LAPORAN PRAKTIKUM
REKAYASA GENETIKA TANAMAN
ACARA I
PENGESTRAKAN DNA TANAMAN
Oleh:
Muthia Hanin Afidani NIM A1D019072
KEMENTERIAN PENDIDIKAN, KEBUDAYAAN, RISET, DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS PERTANIAN
PURWOKERTO 2022
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Isolasi DNA merupakan salah satu tahap penting dalam kegiatan memperoleh informasi genetik dan analisis genetik. DNA dengan kualitas yang baik digunakan untuk kegiatan seperti pemanfaatan marka molekuler, pembuatan pustaka genom, hingga sekuensing. Prinsip isolasi DNA terdiri dari tiga tahapan, yaitu: lisis dinding dan membran sel, pemisahan atau purifikasi DNA, dan presipitasi DNA (Yuwono, 2005; Travers and Muskhelishvili,2015; Dairawan, 2020). Permasalahan utama yang sering muncul dalam proses isolasi DNA tanaman adalah kandungan senyawa polisakarida, polifenol, protein, RNA, dan senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada tanaman yang dapat menghambat tahapan isolasi DNA (Varma et al., 2007, dalam Reztu et al., 2020).
Berbagai teknik analisis dalam pemuliaan tanaman dan biologi molekuler yang berdasarkan pada hibridisasi molekuler atau Polymerase Chain Reaction (PCR) membutuhkan DNA dalam jumlah yang cukup dan kualitas yang baik.
Oleh karena kandungan senyawa sekunder dalam sel tanaman berbeda-beda, maka setiap tanaman membutuhkan prosedur isolasi yang optimum agar diperoleh DNA genom yang dapat digunakan sebagai bahan dalam analisis molekuler. Optimasi prosedur tersebut dapat dilakukan terhadap komposisi larutan buffer lisisnya ataupun teknik penanganan fisik dalam pemisahan DNA genom dari senyawa lain.
Pada prinsipnya optimasi prosedur ini bertujuan melindungi DNA genom dari degradasi akibat senyawa sekunder yang dilepaskan ketika sel dihancurkan atau kerusakan akibat penanganan fisik (Milligan 1992).
Beberapa teknik dan prosedur telah dipublikasikan, tetapi seringkali tidak dapat diaplikasikan karena genus atau bahkan spesies tanaman bersifat sangat spesifik. Oleh karena itu, pada praktikum acara 1 ini akan dilakukan pengekstrakan DNA tanaman kedelai menggunakan 2 metode yang berbeda yaitu metode konvensional atau CTAB dan metode kit Geneaid.
1
B. Tujuan
Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah sebagai berikut.
1. Untuk melaksanakan ekstraksi DNA tanaman kedelai dengan metode konvensional.
2. Untuk melaksanakan ekstraksi DNA tanaman kedelai dengan kit ekstraksi.
3. Untuk membandingkan 2 (dua) metode ekstraksi DNA tanaman.
.
2
II. METODE PRAKTIKUM
A. Alat dan Bahan
DNA diekstrak dari biji kedelai dengan menggunakan dua metode pengekstrakan DNA yaitu CTAB dan Genomic DNA Mini Kit (Plant) Extraction Kit (Geneaid). Bahan kimia yang digunakan untuk metode CTAB adalah: CTAB, PVP, NaCl, EDTA, tris, HCl, β-merkaptoetanol, RNase, klorofom, isoamil alkohol, isopropanol, amonium asetat, etanol, dan air. Bahan kimia yang digunakan untuk metode Genomic DNA Mini Kit (Plant) Extraction Kit terdiri atas GP1 Buffer, GPX1 Buffer, GP2 Buffer, GP3 Buffer (ditambah isopropanol), W1 Buffer, Wash Buffer (ditambah ethanol), Elution Buffer, dan RNase (10mg/ml).
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah: alat penghancur biji (mortar dan pestle), saringan teh, berbagai pipet mikro dan tipnya (ukuran 10 µl, 200 µl, dan 1000 µl), 1,5 dan 2 ml tabung mikro, gelas piala, gelas ukur, alat pemanas, penangas air, vortex, mikrosentrifuge, dan tabung mikro.
B. Prosedur Kerja
Prosedur kerja praktikum ini adalah sebagai berikut.
1. Persiapan bahan tanaman yang akan diekstrak DNA nya sebagai berikut: Biji digerus, kemudian disaring dengan saringan teh halus. Tepung hasil penyaringan (+ 40 hingga 100 mg) dimasukkan ke dalam tabung sentrifus ukuran 1,5 atau 2 ml. Bahan tanaman siap untuk diekstrak DNA-nya.
2. Pengekstrakan DNA Tanaman
a. Pengekstrakan DNA dengan Metode CTAB
1) Larutan penyangga CTAB (2% CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0 hangat (65oC) sebanyak 600 µl dimasukkan ke dalam tabung yang berisi tepung tanaman.
2) β-merkapto-etanol sebanyak 12 µl dimasukkan ke dalam tabung yang berisi tepung tanaman.
3) Tabung dikocok dengan kuat sehingga tepung tersuspensi dengan homogen.
4) Tabung diinkubasi pada suhu 65oC selama 1 jam sambil digoyang.
5) Setelah inkubasi, tabung dibiarkan pada suhu ruang selama 15 menit.
6) Larutan klorofom : isoamil alkohol (24 : 1) sebanyak 600 µl dimasukkan ke dalam tabung yang berisi suspensi tepung tanaman.
7) Tabung dikocok dengan kuat selama 5 menit, kemudian disentrifus pada kecepatan 14000 rpm selama 5 menit.
8) Cairan di lapisan teratas dipindah ke tabung sentrifus ukuran 1,5 ml baru.
9) Larutan klorofom : isoamil alkohol (24 : 1), sebanyak volume lapisan teratas yang dipindahkan, dimasukkan ke dalam tabung.
10) Tabung dikocok dengan kuat selama 5 menit, kemudian disentrifus pada kecepatan 14000 rpm selama 5 menit.
11) Cairan di lapisan teratas dipindah ke tabung sentrifus ukuran 1,5 ml baru.
12) Isopropanol, sebanyak 2/3 volume larutan teratas yang dipindahkan, dimasukkan ke dalam tabung. Benang DNA akan tampak dalam larutan.
13) Tabung dibolak-balik 10 kali, kemudian disentrifuse pada 14000 rpm selama 3 menit.
14) Supernatan dibuang, kemudian penyangga TE (10mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,0) sebanyak 100 µl dimasukkan ke dalam tabung berisi pelet dan disimpan pada kulkas suhu 6 oC semalam, atau diinkubasi selama 1 jam pada suhu 65oC sambil digoyang.
15) Tabung dikeluarkan dari kulkas dan 7,5 M ammonium asetat (50 µl) dimasukkan ke dalam tabung.
16) Tabung dibolak-balik 10 kali, kemudian etanol 96% dingin (500 µl) dimasukkan ke dalam tabung.
17) Tabung dibolak-balik 10 kali, disimpan di suhu -20oC minimal selama 2 jam, kemudian disentrifus pada 14000 rpm selama 2 menit.
18) Supernatan dibuang, etanol 70% dimasukkan ke dalam tabung, kemudian tabung disentil sehingga pelet lepas dari dinding tabung.
19) Tabung dibolak balik 10 kali, kemudian disentrifus pada 14000 rpm selama 2 menit.
20) Supernatan dibuang, tabung tutupnya dibuka dan diletakkan pada suhu ruang hingga etanol habis menguap (+ 30 menit).
21) Penyangga TE (100µl) dimasukkan ke dalam tabung berisi pelet, kemudian disimpan di kulkas suhu 6oC semalam, atau diinkubasi pada suhu 65oC selama 1 jam sambil digoyang.
22) Tabung dikeluarkan dari kulkas, dikocok selama 2 menit, kemudian disentrifus pada 14000 rpm selama 15 menit.
23) Supernatan berisi DNA dipindahkan ke tabung sentrifus baru. DNA disimpan di dalam freezer bersuhu -20oC, atau digunakan untuk analisis selanjutnya.
b. Pengekstrakan dengan Genomic DNA Mini Kit (Plant) Extraction Kit (Geneaid)
1) Tahap Penghancuran Jaringan
a) Sampel tanaman segar ditimbang 50 mg.
b) Sampel dihaluskan hingga menjadi bubuk, kemudian dipindahkan ke dalam tabung koleksi 2 mL atau tabung mikro 1,5 mL.
c) Buffer GP1 atau GPX1 dan RNAse A dicampurkan terlebih dahulu tepat sebelum digunakan pada tahapan penghancuran jaringan.
d) Sebanyak 400µl Buffer GP1 atau GPX1 dan 5µl RNAse A ke dalam tabung berisi sampel, kemudian campurkan dengan vortex agar homogen.
e) Campuran diinkubasi pada suhu 60oC selama 10 menit. Selama inkubasi, tabung dibolak-balik setiap 5 menit.
2) Tahap Lisis Sel
a) Pada tahapan ini, panaskan terlebih dahulu Elution Buffer (200µl untuk setiap sampel) hingga suhu 60oC (untuk tahapan ke-5 elusi DNA).
b) Sebanyak 100µl Buffer GP2 dan dicampurkan dengan vortek, kemudian diinkubasi pada es selama 3 menit.
c) Filter kolom ditempatkan di dalam 2 mL tabung koleksi, kemudian campuran dipindahkan ke dalam filter kolom.
d) Dengan hati-hati, supernatan dipindahkan dari tabung koleksi 2 mL ke tabung mikro 1,5 mL yang baru.
3) Tahap Pengikatan DNA
a) Sebanyak 1,5 kali volume lisat untuk Buffer GP3 (yang sebelumnya telah ditambahkan isopropanol) ditambahkan, kemudian dilakukan homogenisasi dengan vorteks selama 5 detik (misal : volume lisat 500µl, maka buffer GP3 yang ditambahkan adalah 750µl).
b) Jika muncul presipitasi (ada pengendapan), maka segera dipecah sesegera mungkin dengan tip pada mikropipet .
c) Kolom GD ditempatkan ke dalam tabung koleksi 2 mL.
d) Campuran sebanyak 700µl dipindahkan ke dalam Kolom GD (termasuk presipitat yang ada).
e) Campuran disentrifuge pada 14000-16000g selama 2 menit.
f) Tabung koleksi 2 mL dibuang, kemudian kolom GD ditempatkan dalam tabung koleksi yang baru.
g) Sisa campuran sebelumnya (setelah diambil 700µl), kemudian dipindahkan ke dalam kolom GD pada tabung koleksi 2 mL, lalu dilakukan sentrifugasi pada 14-16000g selama 30 detik.
h) Tabung koleksi 2 mL dibuang, kemudian kolom GD ditempatkan dalam tabung koleksi yang baru.
4) Tahap Pencucian DNA
a) Sebanyak 400µl Buffer W1 ditambahkan ke dalam kolom GD, kemudian disentrifuge pada 14-16000g selama 30 detik.
b) Tabung koleksi 2 mL dibuang, kemudian kolom GD ditempatkan kembali ke dalam tabung koleksi 2mL yang baru.
c) Sebanyak 600µl Wash Buffer ditambahkan (pastikan etanol telah ditambahkan) ke dalam kolom GD.
d) Campuran disentrifugasi pada 14-16000g selama 30 detik.
e) Tabung koleksi 2 mL dibuang, kemudian kolom GD ditempatkan kembali ke dalam tabung koleksi 2 mL.
f) Campuran disentrifugasi selama 3 menit pada 14-16000g untuk mengeringkan matriks kolom.
5) Tahap Elusi DNA
a) Kolom GD kering dipindahkan tabung mikro 1,5 mL yang baru.
b) Buffer elusi atau larutan TE sebanyak 100µl ditambahkan pada tengah-tengah matriks kolom, kemudian dibiarkan selama 3-5 menit untuk memastikan buffer elusi atau larutan TE sepenuhnya meresap.
c) Dilakukan sentrifugasi pada 14-16000g selama 30 detik untuk pemurnian DNA.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
Tabel 1.1. Perbedaan ekstraksi DNA menggunakan metode CTAB dan metode kit kolom
No Pembeda Metode CTAB Metode Kit Kolom
1. Waktu yang diperlukan ± 12 jam 2,5-3 jam 2. Perkiraan biaya per
sampel
Rp 500.000 - Rp 600.000
Rp 6.500.000
menggunakan Genomic DNA Mini Kit (Plant) Extraction Kit (Genaid) 3. Alat yang digunakan Mortar dan pestle,
saringan teh, 1,5 dan 2 ml tabung mikro, mikro pipet dan tipnya (10 ml, 100 ml, 200 ml), gelas piala, gelas ukur, alat pemanas, penangas air, vortex,
mikrocentrifuge.
Mikropipet, tip thermolyne, vortex mixer, pemusing, thermometer, gelas bekker, tabung koleksi, filter kolom, kolom GD, tabung mikro, gelas piala, dan tip
4. Bahan yang digunakan Kedelai varietas Slamet, Grobogan dan Amerika, CTAB, PVP, NaCl, EDTA, tris, HCl, β-
merkaptoetanol, RNase, klorofom, isoamil alkohol, isopropanol, amonium asetat, etanol, dan air.
Kedelai varietas Gepak Kuning dan Gema, GP1 Buffer, GpX1 Buffer, GP2 Buffer, GP3 Buffer (sudah ditambah
isopropanol), W1 Buffer, Wash Buffer (sudah ditambah
ethanol), Elution Buffer, dan RNase (10 mg/ml).
5. Prinsip ekstraksi Proses lisis sel, ekstraksi sel, presipitasi, dan purifikasi.
Penghancuran jaringan, pengikatan DNA, pencucian DNA, dan elusi DNA dengan menggunakan bahan- bahan buffer kimia dari kit.
6. Produk presipitasi DNA yang dihasilkan
Pelet DNA Cairan hasil filtrasi dari kolom GD sebanyak 100 µL.
B. Pembahasan
DNA genom dapat diekstraksi dengan berbagai macam teknik. Keberhasilan ekstraksi DNA tergantung pada metode dan bahan-bahan ekstraksi serta spesies tumbuhan (Padmalatha and Prasad, 2006; Pharmawati, 2009, dalam Simarmata et al., 2014). Tingkat keberhasilan teknik PCR juga ditentukan oleh metode ekstraksi DNA yang digunakan (Kamilia, 2017).
Tahapan ekstraksi DNA terdiri dari tiga proses utama, yaitu proses lisis sel, purifikasi, dan presipitasi. Proses lisis sel merupakan proses pertama ekstraksi DNA diawali dengan menghancurkan membran sel dengan cara memberikan enzim Proteinase K untuk merusak protein dan Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) untuk mengikat lipid sehingga membran sel rusak dan semua isi sel keluar. Proses lisis sel menyebabkan DNA bercampur dengan makromolekul sel lainnya.
Pemurnian DNA dari makromolekul sel dilakukan pada tahap purifikasi dengan cara memberikan Phenol dan CIAA (Chloroform Isoamil Alkohol) untuk mengikat makromolekul selain DNA seperti protein, lipid, dan karbohidrat. Pada tahap ini DNA dan air terpisah dari bahan organik lainnya setelah disentrifugasi.
Untuk menarik air dari DNA dibutuhkan alkohol. Proses ini disebut dengan presipitasi (Kamalia, 2017).
Pada prinsip ekstraksi DNA, sel harus dipecah terlebih dahulu menggunakan beberapa agensia, baik secara fisik maupun kimiawi. Senyawa yang sering digunakan untuk memecah sel pada isolasi DNA genom adalah CTAB (Emilia et al., 2021).
Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol. Penggunaan buffer CTAB sebagai pengganti nitrogen cair untuk ekstraksi dapat menghasilkan produk DNA yang berkualitas. Buffer CTAB cukup memenuhi syarat untuk digunakan dalam ekstraksi DNA tanaman yang mengandung karbohidrat dan fenol tinggi karena
tidak merusak DNA (Porebski et al., 1997, dalam Reztu et al., 2020). Bufer CTAB dengan kandungan garam yang tinggi dapat memisahkan polisakarida dari dinding sel (Surzycki, 2000, dalam Reztu et al., 2020). CTAB bekerja dengan mengendapkan asam nukleat dan polisakarida asam dalam larutan kekuatan ionik rendah, sedangkan protein dan polisakarida netral tetap berada dalam larutan (Reztu et al., 2020).
Penggunaan CTAB dalam buffer ekstraksi berguna untuk mengeliminasi polisakarida. Selanjutnya Fang et al. (1992) dan Tel-zur et al. (1999), menyatakan bahwa penambahan NaCl dengan konsentrasi di atas 1 M dapat meningkatkan kelarutan polisakarida sehingga lebih mudah untuk dihilangkan. Dengan demikian, buffer CTAB cukup memenuhi syarat untuk digunakan dalam ekstraksi DNA dari tanaman yang mengandung karbohidrat dan fenol tinggi karena tidak merusak DNA. Buffer CTAB dengan kandungan garam yang tinggi dapat memisahkan polisakarida dari dinding sel, sedangkan PVP dapat mengurangi browning akibat kandungan fenol pada daun muda (Porebski et al. 1997; Surzycki 2000, dalam Restu et al., 2012).
Senyawa CTAB biasanya digunakan untuk ekstraksi DNA dari jaringan tanaman. Setelah sel dipecah selanjutnya dilakukan ekstraksi dan pemurnian DNA (Yuwono, 2008). Teknik pemecahan sel dapat dibagi dalam metode fisik, metode mekanik dan metode kimiawi (Sudjadi, 2008, dalam Emilia et al., 2021). Sel diperlakukan dengan pemaparan senyawa kimiawi yang mempengaruhi dinding sel. Metode kimiawi lebih banyak digunakan untuk preparasi DNA (Emilia et al., 2021).
Dalam suatu teknik ekstraksi DNA masih diperlukan suatu tahapan untuk meminimalkan senyawa-senyawa kontaminan yang dapat mengganggu reaksi PCR seperti polisakarida dan metabolit sekunder. Hal ini disebabkan keberadaan polisakarida dan metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam isolasi asam nukleat (Maftuchah & Zainuddin, 2013, dalam Emilia et al., 2021).
Kandungan senyawa sekunder dalam sel tanaman berbeda-beda, maka setiap
tanaman membutuhkan prosedur ekstraksi yang optimal untuk memperoleh DNA genom yang layak digunakan dalam proses analisis molekuler. Ekstraksi DNA bertujuan memisahkan DNA dengan komponen lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat (Emilia et al., 2021).
Berikut adalah contoh tahapan isolasi DNA yang dilakukan dengan menggunakan metode Doyle dan Doyle (1987). Sebanyak 700 mg sampel daun tanaman yang telah dibersihkan menggunakan alkohol 70%, dihaluskan dengan menggunakan mortar dan pestle. Buffer ekstraksi DNA CTAB sebanyak 5 mL ditambahkan secara bertahap dan dihomogenkan kembali. Tabung mikrotube diinkubasi dalam waterbath dengan suhu 65 ºC selama 30 menit. Larutan 250 L kloroform : isoamil akohol (24:1) ditambahkan ke dalam sampel, kemudian dicampur dan dihomogenkan. Tabung mikro divortex selama 10 detik atau selama 1 menit. Sampel disentrifuge pada 8.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dimasukkan ke dalam tabung mikro baru dengan hati-hati untuk mencegah pencampuran fase supernatan dan natan. Dilakukan penambahan isopropanol ke preparasi DNA dengan perbandingan 1:1 sesuai dengan supernatan yang didapatkan pada masing-masing tabung mikro. Larutan diinkubasi pada suhu −20 ºC semalaman, kemudian disentrifus pada 8.000 rpm selama 10 menit. Fase organik (isopropanol) dibuang dengan hati-hati, dan dikeringanginkan selama 30 menit. Buffer TE sebanyak 250 L, sodium asetat 3M sebanyak 20 L, dan etanol absolut sebanyak 500 L ditambahkan ke dalam tabung kemudian diinkubasi pada suhu −20 ºC selama 30 menit. Larutan disentrifus pada 8.000 rpm selama 10 menit. Fase organik dibuang dengan hati-hati kemudian dicuci dengan alkohol 70% sebanyak 200 L dengan cara disentrifus pada 8.000 rpm selama 10 menit kemudian alkohol dibuang dan dikeringanginkan selama 30 menit. Buffer TE 50 L ditambahkan ke dalam tabung. Terakhir sampel DNA disimpan pada suhu −20 ºC (Hanifa et al., 2021).
Beberapa kandungan dalam senyawa yang digunakan dalam ekstraksi DNA dengan metode CTAB antara lain EDTA yang merupakan chelating agents.
EDTA akan mengikat ion-ion logam yang merupakan kofaktor DNase dan protein
lain yang dapat mendegradasi DNA. Hydranate akan berikatan dengan protein dan memisahkannya dari DNA dengan kekuatan ionik. Secara bersamaan bahan- bahan ini akan memisahkan protein dari DNA dan melindungi DNA dari kerusakan (Gierer, A. & G. Schramm, 1956, dalam Emilia et al., 2021).
Pada saat dilakukan penggerusan, bahan tanaman yang akan diisolasi DNA- nya dilarutkan dalam larutan CTAB. Hal ini dimaksudkan untuk menghindari adanya degradasi nukleolitik yang disebabkan karena adanya DNase. CTAB memiliki beberapa peranan, yaitu membantu merusak membran, juga akan berikatan dengan muatan positif protein kromosomal, sehingga DNA akan dilepaskan ke dalam larutan dan EDTA pada CTAB akan segera menonaktifkan DNase. CTAB mengandung NaCl. Garam akan meminimalkan daya ikatan antara DNA dan protein dengan merusak keseimbangan muatan negatif dan positif antara keduanya. Dengan demikian DNA akan lebih mudah dipisahkan (Galactics, 1998, dalam Emilia et al., 2021). Garam akan berikatan dengan gugus fosfat DNA yang bermuatan negatif yang dapat membantu DNA mengendap pada saat pemberian ethanol absolute dingin (Dollard, 1994, dalam Emilia et al., 2021).
PVP 2% berfungsi untuk mereduksi senyawa-senyawa fenolik yang keberadaannya dapat merusak kualitas DNA. Mercaptoethanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat. Selain itu, mercaptoethanol juga berfungi untuk melindungi RNA dari senyawa quinon, desulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein. Proses inkubasi pada air dengan suhu 65oC berfungsi untuk mendenaturasi protein tanpa merusak DNA.
Selain itu proses pemanasan ini akan membantu melunakkan membran sel dan membantu detergen menyisip di antara membran sehingga membran bisa terurai (Emilia et al., 2021).
Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas
tabung. Teknik sentrifugasi dilakukan oleh mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan di bagian atas dan pelet di bagian bawah (Emilia et al., 2021).
Klorofom dan isoamil alkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan mengendapkan komponen polisakarisa didalam bufer ekstrasi yang mengkontaminasi larutan DNA (Ningrum, 2008). Ethanol 70% berfungsi untuk mengeluarkan endapan garam karena NA+ bermuatan positif dan DNA bermuatn negatif. Pemberian isoprofanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA, sehingga terjadi presipitasi (Purwantara, 2001, dalam Emilia et al., 2021).
Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran.
Pengeringan pelet DNA berfungsi untuk mengeringkan pelet dari sisa-sisa bufer maupun etanol. Bufer TE berfungsi melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak. Dalam bufer TE mengandung EDTA yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk aktivitas berbagai enzim nuclease (Sudarsono, 1996, dalam Emilia et al., 2021).
Metode isolasi DNA dapat dilakukan menggunakan kit ataupun konvensional. Metode konvensional/manual yaitu metode CTAB memerlukan persiapan alat dan bahan yang relatif rumit dan membutuhkan waktu yang lama sekitar 12 jam dengan hasil isolasi tergantung jenis sampel, sedangkan kelebihannya relatif murah. Biaya yang diperlukan pada metode CTAB adalah sekitar Rp500.000 - Rp600.000 berdasarkan website indonesian.alibaba.com.
Sementara itu, isolasi DNA menggunakan kit lebih praktis karena dalam satu paket kit terdapat larutan isolasi yang siap pakai sehingga menghemat waktu kerja yaitu hanya memerlukan waktu sekitar 2-3 jam, tetapi harganya relatif lebih mahal yaitu sekitar Rp6.500.000 (Sari et al., 2014, dalam Octavia et al., 2021).
Pada dasarnya semua metode ekstraksi memiliki prinsip yang sama yaitu penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian, hanya saja setiap metode merancang senyawa-senyawa yang berbeda sesuai dengan kebutuhan teknik ekstraksi yang semakin berkembang (Emilia et al., 2021). Sejalan dengan berkembangnya teknologi metode ekstraksi DNA diciptakan seefisien mungkin untuk memudahkan kegiatan ekstraksi DNA. Salah satu produk ekstraksi yang digunakan adalah KIT Extraction. Tahapan KIT Extraction mengikuti prosedur dari perusahaan (Kamalia, 2017).
Kit pemurnian DNA universal untuk keperluan isolasi dinilai lebih cepat, sederhana dan efektif dibandingkan dengan metode isolasi konvensional. Hasil pemurnian DNA oleh kit lebih berkualitas tinggi, sehingga berfungsi dengan baik sebagai template untuk pencernaan enzim restriksi, analisis PCR, sekuensing, keperluan Gen Bank, DNA genom, ligasi DNA dan prosedur transformasi (Universal DNA purification kit handbook, 2021, dalam Octavia et al., 2021).
Salah satu KIT Extraction adalah Geneaid. Penggunaan protokol dari Geneaid sangat efektif untuk ekstraksi dan isolasi genomik DNA dari dalam sel daun. Bahan-bahan yang digunakan dalam Geneaid adalah 400 µL GP1 Buffer, 5 µL Rnase A, 100 µL of GP2 Buffer, Buffer GP3, 400 µL W1 Buffer, 600 µL Wash Buffer, 100 µL Elution Buffer, Filter Column, dan GD Column (Simarmata et al., 2014).
Metode Geneaid mengikuti protokol dari kit Geneaid yang merupakan modifikasi dari Vogelstein and Gillespie (1979). Berikut adalah contoh tahapan ekstraksi DNA tanaman menggunakan metode Geneair yang mengikuti protokol dari kit Geneaid. Sampel daun tanaman segar seberat 50 - 100 mg digerus dengan pestel dan mortar dan selanjutnya dimasukkan ke dalam tub1.5 ml. Sebanyak 400 µl GP1-Buffer dan 5 µm A-RNase dimasukkan ke dalam tub tersebut dan dihomogenkan dengan vortex. Kemudian tub diinkubasi di dalam waterbath pada suhu 60 oC selama 10 menit. Ke dalam tub tersebut ditambahkan 100 µl GP2-
Buffer (yang sudah dipanaskan sampai 60 oC), divortex, selanjutnya diinkubasi dalam es selama 3 menit. Campuran sampel daun tanaman beserta larutannya dipindahkan ke dalam filter column 2-ml dan disentrifus pada kecepatan 1000 rpm selama satu menit. Filter diangkat dan supernatan dipindahkan ke dalam tub- 1,5 ml yang baru. GP3-Buffer ditambahkan ke dalam tub tersebut sebanyak 1.5 x volume supernatan dan divortex selama 5 detik. Selanjutnya, 700 µl campuran tersebut dipindahkan ke dalam GD column-2 ml dan dicentrifus pada kecepatan 14 000-16 000 rpm selama 2 menit. Endapan dari lysis tersebut dibuang dan GD collumn diletakkan kembali ke dalam tub. Sebanyak 400 µl W1- Buffer dimasukkan ke dalam GD column dan disentrifus pada kecepatan 14 000 - 16 000 rpm selama 30 detik. Endapan dibuang dan GD column dimasukkan kembali ke dalam tub. Proses pencucian diulang dengan 600 µl Wash-Buffer, kemudian 400 µl ethanol. Setelah pencucian ethanol, GD column dikeringkan dengan sentrifus kecepatan 14 000 – 16 000 rpm selama 30 detik. Kemudian GD column yang telah kering dipindahkan ke sebuah tub yang baru. Sebanyak 100 µl Elution- Buffer yang telah dipanaskan dimasukkan ke dalam tub, dibiarkan selama 5 menit dan kemudian disentrifus pada kecepatan 14 000-16 000 rpm selama 30 detik.
Endapan yang diperoleh adalah hasil ektraksi DNA disimpan di lemari pendingin (Simarmata et al., 2014).
IV. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Kesimpulan yang dapat diambil dari acara 1 adalah pada dasarnya, semua metode ekstraksi memiliki prinsip yang sama yaitu penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian, hanya saja setiap metode merancang senyawa-senyawa yang berbeda sesuai dengan kebutuhan teknik ekstraksi yang semakin berkembang.
B. Saran
Saran untuk praktikum selanjutnya adalah sebelum melakukan praktikum, praktikan terlebih dahulu mempelajari materi yang akan dipraktikkan agar praktikum dapat berjalan dengan lancar.
DAFTAR PUSTAKA
Emilia, Harnelly, E., & Anhar, A. 2021. Optimalisasi metode ekstraksi dna daun, kulit kayu dan kayu Pinus merkusii Jungh. Et de Vriese. Jurnal Ilmiah Mahasiswa Pertanian, 6(4): 766-779.
Octavia, D., Mukaromah, A.S., Martiansyah, I., Mimin, Ma'mun, S., &
Rukmanto, H. 2021. Isolasi DNA tumbuhan hasil eksplorasi di nusakambangan dengan metode kit di laboratorium treub, kebun raya bogor. Prosiding Biologi Achieving the Sustainable Development Goals with Biodiversity in Confronting Climate Change, November 8, Gowa. P.
291-299.
Kamaliah. 2017. Perbandingan metode ekstraksi DNA phenol-chloroform dan kit extraction pada sapi aceh dan sapi madura. Jurnal Biotik, 5(1): 60-65.
Simarmata, M., Inoriah, E., Haquarsum, E.J.V. 2014. Optimalisasi PCR-RAPD dan identifikasi morfologi tanaman kumis kucing di provinsi bengkulu.
Akta Agrosia, 17(2): 190-200.
Hanifa, Y.R., Pujiyanto, S., Ferniah, R.S., & Kusumaningrum, H.P. 2021.
Identifikasi molekuler jeruk nipis tegal berdasarkan fragmen gen 18S ribosomal RNA. Jurnal Bioteknologi & Biosains Indonesia. 8(2): 244-254.
Rizko, N., Kusumaningrum, H.P., Ferniah, R.S., Erfianti, T., Mawarni, S.N., Rahayu, H.T., & Khairunnisa, D. 2020. Isolasi DNA daun jeruk bali merah (Citrus maxima Merr.) dengan modifikasi metode doyle and doyle.
Berkala Bioteknologi, 3(2): 6-12.
Restu, M., Mukrimin, & Gusmiaty. 2012. Optimalisasi teknik ekstraksi dan isolasi DNA tanaman suren (Toona sureni Merr.) untuk analisis keragaman genetik berdasarkan random amplified polymorphic DNA (RAPD). Jurnal Natur Indonesia, 14(2): 138-142.
LAMPIRAN
Penimbangan sampel kedelai Bahan CTAB
Pemasukan bahan-bahan pengekstrakan DNA metode CTAB
Sentrifugasi sampel
Inkubasi sampel Hasil presipitasi sampel, terlihat sampel DNA yang mengendap
