LAMPIRAN
Lampiran 1. Bagan alur penelitian
Analisis Tanah (mencakup DHL, pH tanah, kandungan N, P, K, Ca, Mg, Na,
Cl, Al, dan KTK)
Penanaman Benih F4
Aplikasi antioksidan
Isolasi daun pada akhir vegetatif
Analisis aktivitas SOD, POD dan kadar protein
Analisis data pengamatan
Interpretasi hasil Analisis Klorofil
Lampiran 2. Alur Penelitian mendapatkan progeni F4
dan di lapangan pada media tumbuh Dilakukan uji ekspresi gen
tahan salin molekuler terhadap verietas Grobogan yang
Dilakukan persilangan genotipe beradaptasi salin tersebut dengan varietas anjasmoro sebagai varietas bereproduksi tinggi untuk perbaikan
varietas
Varietas Anjasmoro (berproduksi tinggi)
Genotipe beradaptasi di tanah salin
F1 (Penanaman bulk plot)
F2 (Penanaman di beri jarak)
F3 (keragaman tanaman yang berproduksi tinggi)
F4 (pemberian beberapa jenis antioksidan terhadap peningkatan ketahanan salinitas pada turunan F4 kedelai
Lampiran 3. Tahapan Analisis Klorofil Daun
Metode yang digunakan adalah metode Wintermans and de Mots (1965). Klorofil diekstraksi dengan menggerus daun menggunakan Etanol 95%. Kemudian dibiarkan selama semalam. Disaring dengan kertas saring bernomor 42. Dan kemudian dibaca dengan menggunakan spektrofotometer. Dihitung klorofil a, b dan total dengan menggunakan rumus:
Klorofil a = {(13,7 x A665 – 5,76 x A649)} (mg/l) Klorofil b = {(25,8 x A649 – 7,60 x A665)} (mg/l) Total Klorofil = {(20,0 x A649 + 6,10 x A665)} (mg/l)
A649 : Absorbansi ekstrak klorofil pada 649 nm A665 : Absorbansi ekstrak klorofil pada 665 nm
Lampiran 4. Tahapan Analisis Enzim Superoksida Dismutase
Aktivitas SOD dianalisis berdasarkan metode Beuchamp dan Fridovich (1971) yang dimodifikasi. Daun sebanyak 0,1 g digerus di
steril sebanyak 350 µl, lalu diaduk sampai merata. Kemudian dibaca dengan spektrofotometer dengan adsorbansi 560 nm.
Lampiran 5. Tahapan Analisis Kandungan Protein Terlarut Daun
Kandungan protein terlarut dianalisis berdasarkan metode Bradford (1976). Daun sebanyak 0,1 g digerus di dalam mortar dengan menambahkan
nitrogen cair dan PVP. Setelah halus sampel dimasukkan ke dalam tube yang berisi 1 ml buffer ekstrak (BE), lalu disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4°C selama 20 menit dan disimpan di dalam kulkas.
Sebelum menganalisis kandungan protein daun, maka kita harus membuat kurva standart terlebih dahulu. Disipakan larutan standar protein terlarut dengan konsentrasi BSA (Bovine Serum Albumin) 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, dan 100
ppm. 0 ppm adalah campuran BSA 0 ml dan BE 1 ml, 10 ppm adalah campuran BSA 0,1ml dan BE 0,9 ml, dan seterusnya. Masing-masing ditambahakan reagen Bradford sebanyak 2,5 ml (dilakukan dalam kondisi gelap). Kemudian dibaca dengan menggunakan spektrofotometer dengan adsorbansi 595nm. Kemudian dibuat kurva dan fungsi kurva.
Lampiran 6. Tahapan Analisis Enzim Peroksidase
Daun sebanyak 0,1 g digerus di dalam mortar dengan menambahkan nitrogen cair dan PVP. Setelah halus sampel dimasukkan ke dalam tube yang berisi 1 ml CaCl2, lalu disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4°C selama 10 menit, disimpan di dalam kulkas. Sebelum melakukan pengukuran POD kita terlebih dahulu mengoptimalkan pH analisis terbaik yaitu pada kondisi asam digunakan larutan buffer MES 0,02 M (dengan pH 5,5; 6,0; 6,5) sedangkan kondisi netral digunakan larutan buffer HEPES 0,02 M (dengan pH 7,0; 7,5; 8,0) dengan menambahkan NaOH 1M. kemudian diuji aktivitas POD masing-masing larutan, aktivitas yang terbesar yang akan digunakan untuk membuat larutan B. Larutan MES pH 5,5 merupakan pH optimal dengan aktivitas peroksidase 0,79.
Larutan A dibuat dengan mencampurkan Fenol sebanyak 1,458 g, 4-aminoantipirin sebanyak 0,045 g dalam akuades sebanyak 90 ml. Larutan B dibuat
dengan dengan mencampurkan larutan H2O2 30% sebanyak 1,5 ml, MES (pH 5,5) 0,02 M dengan konsentrasi akhir 0,01 M.
Disiapkan tabung reaksi sebanyak sampel ditambah dua tabung untuk larutan standar dan blanko. Kemudian dimasukkan larutan A sebanyak 1,4 ml ke dalam tabung reaksi, lalu larutan B sebanyak 1,5 ml. Dimasukkan sampel sebanyak 200 µL. Dibaca oleh spektrofotometer pada panjang gelombang dengan adsorbansi 510 nm selama dua menit. Hasil pembacaan spektrometer pada menit kedua dikurang menit awal adalah satu aktivitas POD.
Lampiran 7. Pembuatan larutan stok dan buffer
Larutan Methionine 13 mM (200 sampel) : Ditimbang Methionin (C5H11NO2S, Mr=149,21) sebanyak 19,3973 mg dan dilarutkan ke dalam 100 ml akuades.
Larutan EDTA 0,1 mM (200 sampel): Ditimbang EDTA (C10H14N2Na2O8 2H2O, Mr = 372,24) sebanyak 1,11672 mg dan dilarutkan ke dalam 30 ml akuades.
Larutan Riboflavin 2µM (200 sampel): Ditimbang Ribolfavin (C17H20N4O6, Mr=376,36) sebanyak 0,0075272 mg dan dilarutkan ke dalam 10 ml akuades.
BSA : Ditimbang 0,01 g BSA (Bovine Serum Albumin) dan dilarutkan ke dalam 10 ml
H2O. Larutan ini merupak stok BSA dengan konsentrasi 1000 ppm. Diencerkan BSA dengan mengambil 0,5 ml stok BSA dan ditambahkan 4,5 ml H2O steril sehingga diperoleh konsentrasi 100 ppm.
Reagen Bradford : Ditimbang 0,01 g coomasie brilian blue (CBB) G-250. Kemudian dilarutkan 10 ml etanol 95% dan 20 ml asam fosfor 85%. Diaduk sampai homogen dalam kondisi gelap. Kemudian disaring menggunakan kertas saring sampai seluruhnya tersaring. Larutan dicampur dengan 150 ml akuades. Larutan yang telah dicampurkan dengan akuades tidak dapat disimpan (harus digunakan pada saat itu juga).
CaCl2 0,5 M : Ditimbang CaCl2 sebanyak 5,55 g dan dilarutkan ke dalam 100 ml akuades. Disimpan di lemari pendingin.
Larutan A (60 sampel) : Ditimbang Fenol sebanyak 1,458 g dan 4-aminoantipirin sebanyak 0,045 g. Kemudian bahan di atas dilarutkan ke dalam
akuades sebanyak 90 ml.
Larutan Buffer MES 0,02 M : Ditimbang MES sebanyak 0,293 g dan dilarutkan ke dalam 75ml akuades. Larutan dibagi tiga bagian, masing-masing 25ml. Dioptimal pH pada kondisi asam masing-masing larutan menjadi 5,5; 6,0; 6,5 dengan menggunakan NaOH 1M.
Larutan Buffer HEPES 0,02 M : Ditimbang MES sebanyak 0,357 g dan dilarutkan ke dalam 75ml akuades. Larutan dibagi tiga bagian, masing-masing 25 ml. Dioptimal pH pada kondisi netral masing-masing larutan menjadi 7,0; 7,5; 8,0 dengan menggunakan NaOH 1 M.
Lampiran 8. Deskripsi Kedelai Varietas Grobogan
Nama Varietas : Grobogan
SK : 238/Kpts/SR.120/3/2008
Tahun : 2008
Tetua : Pemurnian populasi Lokal Malabar Grobogan Rataan hasil : 3,40 ton/ha
Potensi hasil : 3,77 ton/ha
Karakter khusus : polong masak tidak mudah pecah, dan pada saat panen daun luruh 95–100% saat panen >95% daunnya telah luruh
Pemulia : Suhartina, M. Muclish Adie, T. Adisarwanto, Sumarsono, Sunardi, Tjandramukti, Ali Muchtar, Sihono, SB. Purwanto, Siti
Khawariyah, Murbantoro, Alrodi, Tino Vihara, Farid Mufhti, dan Suharno
Tipe pertumbuhan : Determinate Warna hipokotil : Ungu
Daerah sebaran : Beradaptasi baik pada beberapa kondisi
lingkungan tumbuh yang berbeda cukup besar, pada musim hujan dan daerah beririgasi baik Pengusul : Pemerintah Daerah Kabupaten Grobogan,
Lampiran 9. Deskripsi Kedelai Varietas Anjasmoro
Nama Varietas : Anjasmoro
SK : 537/Kpts/TP.240/10/2001
Tahun : 2011
Tetua : Seleksi massa dari populasi galur murni Mansuria
Daya hasil : 2,03-2,25 ton/ha
Pemulia : Takashi Sanbuichi, Nagaaki Sekiya,
Jamaluddin M., Susanto, Darman M.A., dan M. Muchlish Adie Warna polong masak : Cokelat muda Warrna hilum biji : Kuning Kecoklatan
Bentuk daun : Oval Jumlah buku batang utama : 12,9-14,8
Bobot biji : 14,8-15,3 g
X
X
X
X
Lampiran 10. Bagan Penanaman Pada Petak
X : Polibag tanaman di tanah salin 10 cm
30 cm 10 cm
10 cm
Lampiran 12. Hasil analisis tanah
Parameter Satuan Hasil Analisis
N % 0,31
C organik % 3,32
KTK C mol/Kg 26,23
Ca-tukar C mol/Kg 6,79
Mg-tukar C mol/Kg 14,04
K tukar C mol/Kg 1,33
Na-tukar C mol/Kg 8,90
Al-tukar C mol/Kg 0,54
H-tukar C mol/Kg 0,21
pH H2O - 4,36
Lampiran 13. Data Pengamatan Klorofil a
Perlakuan Blok Jumlah Rataan
Lampiran 14. Data Pengamatan Klorofil b
Perlakuan Blok Total Rataan
I II
A0 4,555 5,304 9,859 4,930 A1 5,099 1,176 6,275 3,138 A2 5,380 4,611 9,991 4,996 A3 5,354 5,372 10,726 5,363 A4 5,246 1,458 6,704 3,352 A5 5,295 5,25 10,545 5,273 A6 5,261 3,784 9,045 4,5226 A7 5,289 3,746 9,035 4,518 A8 4,559 3,856 8,416 4,208 A9 5,254 0,4686 5,723 2,8612 Total 51,293 35,027 86,320 Rataan 9,326 3,503 8,632 4,316 Sidik Ragam
Sumber
Keragaman db JK KT F hitung
F Tabel 5%
F Tabel
1% Ket. Blok 1 13,229 13,229 7,350 5,117 10,561 * Perlakuan 9 14,756 1,640 0,911 3,179 5,351 tn
Galat 9 16,198 1,800
Total 19 44,183
KK : 31,083%
Lampiran 15. Data Pengamatan Klorofil b Setelah ditranformasi √X+0,5
Perlakuan Blok Total Rataan
I II
A0 2,24591 2,40919 4,6551 2,32755 A1 2,36613 0,84447 3,2106 1,6053 A2 2,42486 2,25626 4,68112 2,34056 A3 2,41948 2,42318 4,84266 2,42133 A4 2,39696 0,92405 3,32101 1,66051 A5 2,40734 2,39781 4,80515 2,40258 A6 2,40015 2,03803 4,43818 2,21909 A7 2,40602 2,02177 4,42779 2,2139 A8 2,24222 2,05941 4,30163 2,15082 A9 2,39876 0,5994 2,99815 1,49908 Total 23,7078 17,9736 41,6814 Rataan 4,31052 1,79736 4,16814 2,08407 Sidik Ragam
Sumber
Keragaman db JK KT F hitung
F Tabel 5%
F Tabel
1% Ket. Blok 1 1,644 1,644 6,163 5,117 10,561 * Perlakuan 9 2,261 0,251 0,942 3,179 5,351 tn
Galat 9 2,401 0,267
Total 19 6,306
KK : 24,783%
Lampiran 16. Data Pengamatan Klorofil total
Perlakuan Blok Total Rataan
I II
A0 6,916 7,672 14,588 7,294
A1 7,473 2,518 9,991 4,995
A2 7,737 7,029 14,767 7,383 A3 7,697 7,726 15,423 7,712 A4 7,564 2,791 10,355 5,177 A5 7,636 7,624 15,260 7,630 A6 7,591 6,496 14,087 7,044 A7 7,623 6,271 13,894 6,947 A8 6,990 6,389 13,379 6,690
A9 7,568 1,238 8,806 4,403
Total 74,795 55,754 130,550 Rataan 13,599 5,575 13,055 6,527 Sidik Ragam
Sumber
Keragaman db JK KT F hitung
F Tabel 5%
F Tabel
1% Ket. Blok 1 18,127 18,127 5,869 5,117 10,561 * Perlakuan 9 26,183 2,909 0,942 3,677 5,351 tn
Galat 9 27,800 3,089
Total 19 72,110
KK : 26,925%
Lampiran 17. Data Pengamatan Klorofil total Setelah ditranformasi √X+0,5
Perlakuan Blok Total Rataan
I II
A0 2,722 2,859 5,581 2,791
A1 2,824 1,176 4,000 2,000
A2 2,870 2,742 5,612 2,806
A3 2,863 2,868 5,731 2,866
A4 2,840 1,233 4,073 2,036
A5 2,852 2,850 5,703 2,851
A6 2,844 2,637 5,482 2,741
A7 2,850 2,587 5,437 2,719
A8 2,733 2,615 5,348 2,674
A9 2,840 0,863 3,703 1,851
Total 28,239 22,430 50,670 Rataan 5,134 2,243 5,067 2,533 Sidik Ragam
Sumber
Keragaman db JK KT F hitung
F Tabel 5%
F Tabel
1% Ket. Blok 1 1,687 1,687 5,069 5,117 10,561 tn Perlakuan 9 2,891 0,321 0,965 3,677 5,351 tn
Galat 9 2,996 0,333
Total 19 7,575
KK : 22,773%
Lampiran 18. Data Pengamatan SOD
Perlakuan Blok Total Rataan
I II
A0 0,098 0,158 0,256 0,128
A1 0,242 0,024 0,266 0,133
A2 0,103 0,189 0,291 0,146
A3 0,172 0,100 0,272 0,136
A4 0,754 0,325 1,079 0,539
A5 0,287 0,153 0,441 0,220
A6 0,187 0,135 0,322 0,161
A7 0,102 0,151 0,252 0,126
A8 0,139 0,751 0,889 0,445
A9 0,683 0,177 0,861 0,430
Total 2,765 2,163 4,928 0,000 Rataan 0,503 0,216 0,000 0,246 Sidik Ragam
Sumber
Keragaman db JK KT F hitung
F Tabel 5%
F Tabel
1% Ket. Blok 1 0,018 0,018 0,378 5,117 10,561 tn Perlakuan 9 0,461 0,051 1,068 3,179 5,351 tn
Galat 9 0,432 0,048
Total 19 0,912
KK : 88,930%
Lampiran 19. Data Pengamatan SOD Setelah ditransformasi √X+0,5
Perlakuan Blok Total Rataan
I II
A0 0,773 0,811 1,584 0,792 A1 0,858 0,370 1,228 0,614 A2 0,776 0,826 1,602 0,801 A3 0,820 0,774 1,594 0,797 A4 1,095 0,536 1,631 0,815 A5 0,875 0,804 1,679 0,840 A6 0,829 0,796 1,624 0,812 A7 0,774 0,806 1,581 0,790 A8 0,798 1,097 1,895 0,948 A9 1,079 0,462 1,541 0,771 Total 8,676 7,284 15,959 0,000 Rataan 1,577 0,728 0,000 0,798 Sidik Ragam
Sumber
Keragaman db JK KT F hitung
F Tabel 5%
F Tabel
1% Ket. Blok 1 0,097 0,097 2,077 5,117 10,561 tn Perlakuan 9 0,119 0,013 0,283 3,179 5,351 tn
Galat 9 0,420 0,047
Total 19 0,635
KK : 27,060%
Lampiran 20. Data Pengamatan POD
Perlakuan Blok Total Rataan
I II
A0 0,491 0,171 0,662 0,331 A1 0,494 0,273 0,767 0,383 A2 0,569 0,451 1,020 0,510 A3 0,282 0,251 0,533 0,267 A4 1,285 0,063 1,348 0,674 A5 0,978 0,656 1,634 0,817 A6 0,089 0,083 0,172 0,086 A7 0,288 0,152 0,440 0,220 A8 0,402 0,269 0,670 0,335 A9 0,965 0,081 1,046 0,523 Total 5,841 2,451 8,293 Rataan 1,062 0,245 0,829 0,415 Sidik Ragam
Sumber
Keragaman db JK KT F hitung
F Tabel 5%
F Tabel
1% Ket.
Blok 1 0,575 0,575 7,223 5,117 10,561 * Perlakuan 9 0,864 0,096 1,207 3,179 5,351 tn
Galat 9 0,716 0,080
Total 19 2,155
KK : 68,026%
Lampiran 21. Data Pengamatan POD Setelah ditranformasi √X+0,5
Perlakuan Blok Total Rataan
I II
A0 0,981 0,819 1,800 0,900 A1 0,989 0,865 1,854 0,927 A2 1,012 0,974 1,986 0,993 A3 0,881 0,865 1,745 0,873 A4 1,265 0,749 2,014 1,007 A5 1,173 1,046 2,219 1,110 A6 0,767 0,764 1,531 0,765 A7 0,888 0,806 1,694 0,847 A8 0,941 0,872 1,813 0,906 A9 1,204 0,760 1,964 0,982 Total 10,100 8,521 18,620 Rataan 1,836 0,852 1,862 0,931 Sidik Ragam
Sumber
Keragaman db JK KT F hitung
F Tabel 5%
F Tabel
1% Ket.
Blok 1 0,125 0,125 7,897 5,117 10,561 * Perlakuan 9 0,167 0,019 1,178 3,179 5,351 tn
Galat 9 0,142 0,016
Total 19 0,434
KK : 13,496%
Lampiran 22. Data Pengamatan Protein Daun
Perlakuan Blok Total Rataan
I II
A0 0,300 0,271 0,571 0,285
A1 0,375 0,207 0,581 0,291
A2 0,315 0,270 0,585 0,292
A3 0,330 0,332 0,662 0,331
A4 0,137 0,119 0,256 0,128
A5 0,352 0,306 0,658 0,329
A6 0,401 0,311 0,713 0,356
A7 0,384 0,303 0,688 0,344
A8 0,346 0,266 0,611 0,306
A9 0,297 0,145 0,443 0,221
Lampiran 23. Data Pengamatan Bobot Biji per Tanaman
Perlakuan Blok Total Rataan
I II
A0 3,575 4,170 7,745 3,873 A1 3,860 0,950 4,810 2,405 A2 4,355 2,340 6,695 3,348 A3 6,470 3,115 9,585 4,793 A4 5,895 0,325 6,220 3,110 A5 5,690 2,830 8,520 4,260 A6 4,045 3,425 7,470 3,735 A7 4,765 3,420 8,185 4,093 A8 4,065 2,930 6,995 3,498 A9 6,680 0,000 6,680 3,340 Total 49,400 23,505 72,905 Rataan 8,982 2,351 7,291 3,645 Sidik Ragam
Sumber
Keragaman db JK KT F hitung
F Tabel 5%
F Tabel
1% Ket.
Blok 1 33,528 33,528 13,595 5,117 10,561 ** Perlakuan 9 7,964 0,885 0,359 3,179 5,351 tn
Galat 9 22,196 2,466
Total 19 63,688
KK : 43,081%
Lampiran 24. Data Pengamatan Bobot Biji per Tanaman Setelah ditranformasi √X+0,5
Perlakuan Blok Total Rataan
Lampiran 25. Gambar Tanaman
Persiapan Media Tanam Pengukuran DHL tanah
Perlakuan Kontrol Perlakuan Asam Askorbat 250 ppm
Perlakuan Asam Salisilat 250 ppm Perlakuan Asam Salisilat 500 ppm
Perlakuan Asam Salisilat 750 ppm Perlakuan α-Tokoferol 250 ppm
Aplikasi Asam Askorbat Aplikasi Asam Salisilat
