LAPORAN PRAKTIKUM
REKAYASA GENETIKA TANAMAN
ACARA II
PENENTUAN KUANTITAS DAN KUALITAS DNA HASIL EKSTRAKSI DENGAN SPEKTROFOTOMETER
Oleh:
Muthia Hanin Afidani NIM A1D019072
KEMENTERIAN PENDIDIKAN, KEBUDAYAAN, RISET, DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS PERTANIAN
PURWOKERTO 2022
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Analisis molekuler tumbuhan tergantung pada jumlah dan kemurnian sampel DNA (Pharmawati, 2009, dalam Sari et al., 2014). Kehadiran metabolit sekunder pada tanaman tinggi terkadang menghambat proses isolasi dan menyebabkan munculnya kontaminasi pada DNA murni. DNA yang baik secara kualitas dalam arti kemurnian DNA maupun kuantitas (konsentrasi DNA) dalam proses isolasi merupakan tahap awal yang sangat penting dan harus terpenuhi dalam studi molekuler (Sari et al., 2014).
Prinsip dasar isolasi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen lainnya yang harus dilakukan dengan baik dan bebas dari kontaminasi sehingga diperoleh DNA hasil isolasi dengan kualitas yang baik (Tenriulo, et al., 2001, dalam Farmawati et al., 2015). Untuk mengetahui kualitas DNA yang baik diperlukan suatu pengujian, sehingga diketahui tingkat kemurnian DNA tersebut. Selain itu, dilakukan pula pengujian kuantitas DNA atau konsentrasi DNA. Menurut Haris et al (2003) dalam Harahap (2017), konsentrasi DNA akan berdampak pada kualitas fragmen hasil amplifikasi. Konsentrasi DNA yang terlalu rendah akan menghasilkan fragmen yang sangat tipis pada gel atau bahkan tidak terlihat secara visual, sebaliknya konsentrasi DNA yang terlalu tinggi akan menyebabkan fragmen terlihat tebal sehingga sulit dibedakan antara satu fragmen dengan fragmen lainnya.
Kuantitas DNA sampel tanaman dapat dijadikan parameter keberhasilan dari proses isolasi DNA. Analisis kuantitas DNA bertujuan mengetahui konsentrasi dan tingkat kemurnian untuk proses analisis DNA selanjutnya. Pengukuran kuantitas DNA ini menggunakan alat spektrofotometer (Zebua, 2020). Kualitas DNA juga ditentukan dengan analisis kemurnian DNA hasil isolasi yang dilakukan menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis dengan melihat rasio Absorbansi λ260/Absorbansi λ280 (Farmawati et al., 2015). Oleh karena itu, pada
1
praktikum acara 2 ini akan dilakukan pegujian kuantitas dan kualitas DNA tanaman kedelai menggunakan spektrofotometer UV-Vis (Nano Drop).
B. Tujuan
Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah sebagai berikut.
1. Menentukan kuantitas DNA hasil ekstraksi dengan spektrofotometer.
2. Menentukan kualitas DNA hasil esktraksi dengan spektrofotometer.
.
2
II. METODE PRAKTIKUM
A. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah mikropipet dengan ukuran maksimal 100µL dan 10µL, tip kuning, tip putih, tabung mikro 1,5mL, tissue, dan spektrofotometer UV-Vis (Nano Drop). Bahan yang digunakan adalah akuabides (ddH2O) (sebagai larutan standar atau blanko dan larutan pengencer) dan DNA genom hasil ekstraksi pada acara praktikum sebelumnya.
B. Prosedur Kerja
Prosedur kerja praktikum ini adalah sebagai berikut.
1. Nyalakan spektrofotometer dan biarkan selama 15 menit.
2. Siapkan pengenceran (50-300 kali) larutan DNA.
3. Atur panjang gelombang pada 260 nm.
4. Masukkan cuvet berisi larutan blanko ke spektrofotometer.
5. Atur nilai serapan = 0.
6. Masukkan cuvet berisi larutan DNA ke spektrofotometer.
7. Ukur dan catat nilai serapan.
8. Keluarkan cuvet berisi larutan DNA dari spektrofometer.
9. Apabila larutan DNA yang akan diukur lebih dari satu, maka masukkan cuvet berisi larutan DNA berikutnya, ukur dan catat nilai serapan.
10. Setelah semua larutan DNA diukur dan dicatat nilai serapannya, atur panjang gelombang menjadi 280 nm.
11. Masukkan cuvet berisi larutan blanko ke spektrofotometer.
12. Atur nilai serapan = 0.
13. Masukkan cuvet berisi larutan DNA ke spektrofotometer.
14. Ukur dan catat nilai serapan.
15. Keluarkan cuvet berisi larutan DNA dari spektrofometer.
16. Apabila larutan DNA yang akan diukur lebih dari satu, maka masukkan cuvet berisi larutan DNA berikutnya, ukur dan catat nilai serapan.
17. Hitung kuantitas dan kualitas DNA berdasarkan formula di atas.
.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
Tabel 2.1. Pengukuran Kuantitas dan Kualitas DNA Kedelai Amerika, Grobogan, dan Slamet menggunakan Metode CTAB
Pengukuran Metode CTAB
Varietas Amerika
Varietas Grobogan
Varietas Slamet
A260 0.078 A 0.429 A 0.070 A
A280 0.063 A 0.422 A 0.062 A
Kualitas DNA (Rasio
A260/A280) 1.300 1.020 1.154
Faktor pengenceran (kali) - - -
Kuantitas (konsentrasi)
DNA (dalam satuan μg/ml) 32.5 μg/ml 180 μg/ml 30 μg/ml
Tabel 2.2. Pengukuran Kuantitas dan kualitas DNA kedelai Gepak Kuning dan Gema menggunakan metode kit kolom
Pengukuran Metode Kit Kolom
Varietas Gepak
Kuning Varietas Gema
A260 0.004 A 0.017 A
A280 0.006 A 0.020 A
Kualitas DNA (Rasio A260/A280)
0.636 0.842
Faktor pengenceran (kali) ddH2O (10x) ddH2O (10x) Kuantitas (konsentrasi)
DNA (dalam satuan μg/ml)
3.5 μg/ml 8.00 μg/ml
B. Pembahasan
Analisis kualitas dan kuantitas hasil isolasi DNA dilakukan menggunakan NanoDrop spektrofotometri. Menurut Prayogo et al. (2020), konsentrasi dan kemurnian DNA dapat dihitung dengan membutuhkan alat yang dikenal sebagai spektrofotometer. Oleh karena itu, pada praktikum ini, dilakukan uji kualitas dan kuantitas DNA tanaman hasil ekstraksi praktikum sebelumnya menggunakan spektrofotometer nano drop. Prinsip metode spektrofotometer sinar absorbansi UV adalah pemanfaatan panjang gelombang tertentu yang dapat ditangkap oleh molekul DNA (Rizko et al., 2020). DNA murni mampu menyerap cahaya ultraviolet karena adanya basa purin dan pirimidin (Fatchiyah et al. 2011, dalam Hikmatyar et al., 2015).
Menurut Restu et al. (2012) dalam Retnanengati (2020), dalam pengujian menggunakan teknik spektrofotometer, sampel dipipet pada plat spektrofotometer untuk mendapatkan nilai OD (Optical Density). Pada spektrofotometer digunakan
metode panjang gelombang tunggal (Single Wave Length) dan OD diukur pada panjang gelombang 260 nm. Konsentrasi DNA dapat diketahui menggunakan rumus berikut:
[DNA] (μg/ml) = A260 x 50 x Faktor Pengenceran
Sementara itu, kemurnian larutan DNA dapat diukur dari nilai perbandingan antara absorbansi pada panjang gelombang 260 nm (A260) dengan nilai absorbansi pada panjang gelombang 280 nm (A280) (Sambrook et al., 1989, dalam Retnanengati, 2020). Panjang gelombang 260 nm merupakan serapan maksimum untuk asam nukleat atau nilai maksimum DNA dapat menyerap cahaya, sedangkan panjang gelombang 280 nm merupakan serapan maksimum untuk protein atau nilai maksimum residu protein yang dapat menyerap cahaya (Zebua, 2020).
Hasil uji nano drop adalah berupa nilai kemurnian DNA pada Å260/Å280 dan nilai konsentrasi DNA. Menurut Healey et al. (2014) dalam Rizko et al.
(2020), untuk kegiatan molekuler berbasis NGS (Next Generation Sequencing) dibutuhkan DNA dengan perbandingan λ260/λ280 antara 1,8–2,0. Menurut Sambrook et al. (1989) dalam Rizko et al. (2020) bahwa kisaran angka tersebut telah memenuhi persyaratan yang dibutuhkan dalam analisis molekuler DNA.
DNA berkualitas baik berdasarkan uji nano drop memiliki kemurnian 1,8-2,0 (Fatchiyah et al. 2011; Sambrook et al. 2001, dalam Hikmatyar et al., 2015) dan konsentrasi di atas 100 ng/µL atau 100 μg/ml (Hikmtyar et al., 2015).
Pada praktikum ini, didapatkan kuantitas DNA kedelai hasil ekstraksi dengan metode CTAB adalah varietas Amerika memiliki kuantitas 32,5 μg/ml, varietas Grobogan 180 μg/ml, dan varietas Slamet μg/ml. Sementara itu, DNA kedelai hasil ekstraksi dengan metode kit kolom memiliki konsentrasi yaitu varietas Gepak Kuning 3,5 μg/ml dan varietas Gemaa 8,00 μg/ml. Semua varietas kedelai kecuali varitas kedelai Grobogan memiliki konsentrasi di bawah 100 μg/ml yang berarti bahwa kuantitas DNA tanaman rendah. Sementara itu, kuantitas kedelai Grobogan melebihi 100 μg/ml yaitu 180 μg/ml yang berarti bahwa kuantitas kedelai Grobogan tinggi dan paling tinggi dari semua sampel DNA yang diuji.
Tinggi rendahnya konsentrasi DNA yang dihasilkan dalam proses ekstraksi DNA dapat disebabkan oleh beberapa faktor seperti faktor suhu inkubasi, suhu yang terlalu tinggi dapat merusak DNA, sedangkan jika suhunya terlalu rendah akan mengakibatkan membran sel tidak dapat hancur. Faktor lainnya adalah waktu inkubasi. Jika waktu inkubasi DNA terlalu lama maka akan merusak DNA dan jika terlalu sebentar maka tidak dapat menghancurkan membran dan jaringan sel (Emilia et al., 2021).
Menurut Haris et al. (2003) dalam Emilia et al. (2021), konsentrasi DNA akan berdampak pada kualitas fragmen hasil amplifikasi. Konsentrasi DNA yang terlalu rendah akan menghasilkan fragmen yang sangat tipis pada gel atau bahkan tidak terlihat secara visual, sebaliknya konsentrasi DNA yang terlalu tinggi akan menyebabkan fragmen terlihat tebal sulit dibedakan antara satu fragmen dengan fragmen lainnya.
Konsentrasi hasil ekstraksi DNA dipengaruhi oleh 2 faktor yaitu kecepatan ekstraksi pada waktu ekstraksi dan komposisi penambahan lisis bufer. Faktor kecepatan ekstraksi merupakan faktor paling berpengaruh karena pada tahap lisis sel dan presipitasi pengambilan supernatant harus dilakukan per sampel, sehingga beberapa sampel terjadi pengendapan DNA (Komalasari, 2009, dalam Emilia et al., 2021) maupun sisa-sisa guanidina yang biasanya terdapat pada kit. Namun, hal ini dapat dihindari dengan pembersihan pedestal dan uji blanko dengan bufer elusi yang sama dengan sampel sebelum proses pengujian. Konsentrasi DNA yang besar pula tidak menjamin bahwa DNA tersebut murni, sehingga perlu dilihat nilai kemurniannya. Nilai kemurnian DNA diperlukan untuk menilai derajat kontaminasi dari DNA yang dihasilkan (Emilia et al., 2021).
DNA berkualitas tinggi pada suatu ekstraksi merupakan salah satu hal dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekular (Syafaruddin & Santoso, 2011, dalam Azizah et al., 2014). Kualitas DNA diukur berdasarkan kemurniannya pada absorbansi panjang gelombang 260/280 dalam kisaran 1,8-2,0 (Sambrook &
Russel, 1989, dalam Azizah et al., 2014).
Kualitas DNA kedelai varietas Amerika, Grobogan, dan Slamet kurang baik dilihat dari hasil uji spektrofotometri menggunakan absorbansi dengan panjang
gelombang 260/280. Semua varietas kedelai memiliki nilai di bawah 1,8. Varietas Amerika memiliki nilai 1,3, varietas Grobogan memiliki nilai 1,020, dan varietas Slamet memiliki nilai 1,154. Begitu pula dengan sampel DNA hasil ekstraksi dengan metode kit kolo. Semua sampelnya memiliki kualitas yang kurang baik ditandaik dengan nilai absorbansinya yang di bawah 1,8. Varietas Gepak Kuning memiliki nilai 0,636, sedangkan varietas Gemma memiliki nilai 0,842.
Hasil spektrofotometri menunjukkan bahwa semua sampel DNA tanaman yang diuji pada absorbansi panjang gelombang 260/280 memiliki nilai di bawah 1,8, yang berarti bahwa DNA tidak murni. Nilai kemurnian DNA di bawah 1,8 mengindikasikan pada DNA hasil ekstraksi masih terdapat kontaminan berupa senyawa protein. Kontaminasi berupa senyawa protein pada DNA dapat disebabkan oleh tidak adanya penambahan enzim protease pada protokol isolasi DNA (Kartini 2012, dalam Hikmatyar et al., 2015). Menurut Wirajana et al.
(2013) dalam Rizko et al. (2020), nilai kurang dari 1,8 menunjukkan adanya kontaminan fenol atau senyawa protein yang ikut terbawa selama proses ekstraksi berlangsung, sedangkan jika rasionya lebih dari 2,0 maka DNA masih mengandung RNA. Nilai DNA yang tidak murni dapat disebabkan oleh fenol karena serapan maksimal fenol berada di panjang gelombang 270 nm dan mampu memberikan serapan di panjang gelombang 260 nm
Proses isolasi menjadi kunci tingkat kemurnian pita DNA. Kualitas isolasi DNA dikatakan kurang baik apabila komponen pengotor (protein) tidak terdegradasi secara sempurna saat isolasi, sehingga tercampur dengan DNA target dan adanya kontaminasi protein yang berasal dari komponen sel yang tidak lisis atau dari larutan fenol yang ditambahkan saat isolasi (untuk presipitasi DNA) (Bellard et al., 1973, dalam Octavia et al., 2021).
Beberapa teknik yang kemungkinan mengakibatkan terjadinya kontaminasi di antaranya yaitu kesalahan teknik pengambilan supernatan yang kurang teliti dan hati-hati sehingga substansi yang tidak selain DNA ikut terambil, proses digesti (pemotongan fragmen DNA) yang mungkin tidak sempurna karena selama inkubasi sampel tersebut tidak digoyang sehingga pada saat pengambilan fenol
sebagian protein tidak ikut terikat dan dan tetap berikatan dengan DNA dalam sampel (Ramlah, 2015; Ratnasari & Faridah, 2019, dalam Octavia et al., 2021).
Perbedaan hasil konsentrasi dan kemurnian DNA pada setiap tabung disebabkan oleh faktor teknis ketika melakukan proses distribusi dan pemindahan supernatan pada tabung mikro baru (Hanifa et al., 2021). Sejalan dengan hal tersebut, Triani (2020) dalam Hanifa et al. (2021) menyatakan bahwa beberapa faktor teknis yang terjadi selama proses isolasi seperti pemindahan supernatan dan pengeringan isolat dapat memengaruhi kemurnian DNA yang dihasilkan. Hal ini dikarenakan larutan purifikasi seperti alkohol, atau etanol dapat menurunkan nilai kemurnian DNA ketika dilakukan pengukuran pada spektrofotometer.
IV. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Kesimpulan yang dapat diambil dari acara 2 adalah sebagai berikut.
1. Kuantitas DNA hasil spektrofotometri menunjukkan bahwa sampel DNA kedelai varietas Amerika, Slamet, Gepak Kuning, dan Gemma memiliki kuantitas atau konsentrasi rendah karena jumlahnya di bawah 100 μg/ml, sedangkan kuantitas sampel DNA kedelai varietas Grobogan adalah yang paling tinggi karena konsentrasinya di atas 100 μg/ml yaitu 180 μg/ml.
2. Kualitas DNA hasil spektrofotometri menunjukkan bahwa semua sampel DNA tidak murni karena semua sampel memilki nilai absorbansi di bawah 1,8 yang berarti bahwa terdapat kontaminasi senyawa protein.
B. Saran
Saran untuk praktikum selanjutnya adalah sebelum melakukan praktikum, praktikan terlebih dahulu mempelajari materi yang akan dipraktikkan agar praktikum dapat berjalan dengan lancar.
DAFTAR PUSTAKA
Azizah, N.N., Mazieda, M.N., & Dahlia. 2014. Optimalisasi isolasi dan purifikasi DNA Petunia hybrida seri rose picotedengan kit isolasi geneaid. Seminar Nasional XI Pendidikan Biologi FKIP UNS, 11(1): 273-278.
Emilia, Harnelly, E., & Anhar, A. 2021. Optimalisasi metode ekstraksi dna daun, kulit kayu dan kayu Pinus merkusii Jungh. Et de Vriese. Jurnal Ilmiah Mahasiswa Pertanian, 6(4): 766-779.
Farmawati, D.A., Wirajana, I.N., & Yowani, S.C. 2015. Perbandingan kualitas DNA dengan menggunakan metode boom original dan boom modifikasi pada isolat Mycobacterium tuberculosis 151. Jurnal Kimia, 9(1): 41-46.
Hanifa, Y.R., Pujiyanto, S., Ferniah, R.S., & Kusumaningrum, H.P. 2021.
Identifikasi molekuler jeruk nipis tegal berdasarkan fragmen gen 18S ribosomal RNA. Jurnal Bioteknologi & Biosains Indonesia. 8(2): 244-254.
Harahap, A.S. 2017. Uji kualitas dan kuantitas dna beberapa populasi pohon kapur sumatera. Journal of Animal Science and Agronomy Panca Budi, 2(2): 1-6.
Himatyar, M. F., Royani, J.I., & Dasumiati. 2015. Isolasi dan amplifikasi DNA keladi tikus (Thyponium flagelliform) untuk identifikasi keragaman genetik. Jurnal Bioteknologi & Biosains Indonesia, 2(2): 42-48.
Octavia, D., Mukaromah, A.S., Martiansyah, I., Mimin, Ma'mun, S., &
Rukmanto, H. 2021. Isolasi DNA tumbuhan hasil eksplorasi di nusakambangan dengan metode kit di laboratorium treub, kebun raya bogor. Prosiding Biologi Achieving the Sustainable Development Goals with Biodiversity in Confronting Climate Change, November 8, Gowa. P.
291-299.
Restu, M., Mukrimin, & Gusmiaty. 2012. Optimalisasi teknik ekstraksi dan isolasi DNA tanaman suren (Toona sureni Merr.) untuk analisis keragaman genetik berdasarkan random amplified polymorphic DNA (RAPD). Jurnal Natur Indonesia, 14(2): 138-142.
Retnaningati, D. 2020. Optimasi metode ekstraksi DNA pada melon (Cucumis melo L.) berdasarkan suhu, lama inkubasi, dan kondisi daun. Biota: Jurnal Ilmiah Ilmu-Ilmu Hayati, 15(2): 109-114.
Rizko, N., Kusumaningrum, H.P., Ferniah, R.S., Erfianti, T., Mawarni, S.N., Rahayu, H.T., & Khairunnisa, D. 2020. Isolasi DNA daun jeruk bali merah (Citrus maxima Merr.) dengan modifikasi metode doyle and doyle.
Berkala Bioteknologi, 3(2): 6-12.
Sari, K.S., Mazieda, M.N., Listyorini, D., & Sulasmi, E.S. 2014. Optimasi teknik isolasi dan purifikasi dna pada daun cabai rawit (Capsicum frutescens cv.
Cakra Hijau) menggunakan genomic DNA mini kit (plant) geneaid.
Seminar Nasional XI Pendidikan Biologi FKIP UNS, 11(1): 65-70.
Zebua, F.M. 2020. Keragaman dan identifikasi genetik galur mutan kedelai (Glycine max L. Merril) generasi M5 pada kandungan asam lemak berdasarkan marka SSR (simple sequence repeats). Skripsi. Fakultas Pertanian, Uiversitas Sumatera Utara, Medan.
LAMPIRAN
Hasil spektrofotometri DNA kedelai varietas Slamet
Hasil spektrofotometri DNA kedelai varietas Amerika
Hasil spektrofotometri DNA kedelai varietas Grobogan
