LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA

LAPORAN PRAKTIKUM 

REKAYASA GENETIKA 

 

 

 

 

 

LAPORAN V 

(HIBRIDISASI) 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

KHAIRUL ANAM 

P051090031/BTK 

 

 

 

 

 

 

 

 

BIOTEKNOLOGI 

SEKOLAH PASCASARJANA 

INSTITUT PERTANIAN BOGOR 

HIBRIDISASI DOT BLOT 

    TUJUAN  Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui dan memahami prinsip dari hibridisasi southern (dot  blot)  TINJAUAN PUSTAKA 

Hibridisasi  adalah  proses  perpasangan  antara  DNA  yang  menjadi  sasaran  dan  DNA  pelacak.  Hibridisasi  biasa  digunakan  untuk  melacak  adanya  DNA  yang  sesuai  dengan  pelacak,  misalnya  untuk  mengetahui  integrasi  transgen  di  dalam  organisme  transgenik.  Berdasarkan  prinsipnya,  hibridisasi  southern dapat dibagi ke dalam 4 tahap, yaitu : (1) fiksasi DNA di membran (nitroselulosa atau nilon); (2)  pelabelan  pelacak;  (3)  prehibridisasi  dan  hibridisasi;  dan  (4)  deteksi  hasil  hibridisasi.  Fiksasi  DNA  di  membran  dapat  dilakukan  melalui  beberapa  cara,  yaitu  (1)  penetesan  DNA  (dot  blot)  langsung  di  membran;  (2)  fiksasi  DNA  bakteri  replika  (plasmid  rekombinan)  di  membran;  (3)  fiksasi  DNA  fage  rekombinan dari satu replika plak di membran; dan (4) transfer DNA dari gel agarose (yang sebelumnya  telah dimigrasikan dengan elektroforesis) ke membran. Membran yang dipergunakan untuk memfiksasi  DNA  biasanya  menggunakan  membran  nilon  karena  lebih  kuat  daripada  membran  nitroselulosa.  Dot  blot  dan  hibridisasi  terhadap  DNA  replika  hanya  dapat  digunakan  untuk  mendeteksi  keberadaan  DNA  tetapi tidak dapat mengetahui ukurannya. Sebaliknya, hibridisasi southern terhadap DNA yang difiksasi  ke membran dengan cara transfer melalui metode southern (southern blotting) dapat diketahui ukuran  DNA targetnya (Suharsono dan Widyastuti, 2006).  

Pelacak  dapat  diperbanyak  melalui  beberapa  metode  sebagai  berikut  :  perbanyakan  plasmid  yang  dilanjutkan  dengan  isolasi  fragment  DNA  yang  diinginkan  melalui  elusi  atau  dengan  PCR  dengan  menggunakan  primer  yang  spesifik.  Berbagai  bahan  dan  cara  telah  dikembangkan  untuk  melabel  pelacak. Pada dasarnya bahan untuk melabel DNA pelacak dapat dibagi ke dalam dua kelompok, yaitu  (1) bahan radioaktif (radioisotop) seperti 32P, 33P, 3H; dan (2) bahan non radioaktif seperti digoxigenin,  biotin,  ECL,  dan  alkalin  fosfatase  (AlkPhos).  Radioisotop  sangat  sensitif  untuk  digunakan  dalam  hibridisasi  southern,  tetapi  membutuhkan  fasilitas  yang  canggih  dan  keamanan  yang  harus  dijaga  dengan ketat. Oleh karena itu pemilihan bahan non‐radioisotop menjadi sangat menarik karena dampak  lingkungannya  lebih  ringan  dibandingkan  dengan  menggunakan  bahan  radioisotop  walaupun  sensitifitasnya lebih rendah dibandingkan dengan bahan radioisotop (Suharsono dan Widyastuti, 2006). 

BAHAN DAN METODE KERJA    Bahan    Bahan‐bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah membran nylon, film, probe, DNA  dari Peronos cleros spore.  Metode  Dot  Blotting 

Siapkan  membran  nylon  (Hybon  N+)  sesuai  kebutuhan.  Potong  salah  satu  ujungnya  untuk  mengetahui orientasi membran dan berilah label dengan pensil. Encerkan DNA target yang berasal dari 

Peronos  cleros  spora  hingga  konsentrasi  1  μg/μl.  Ambil  5  μl  DNA  tersebut  lalu  didenaturasi  dengan 

memanaskannya pada air mendidih selama 5 menit. Segera masukkan ke dalam es selama 5 menit (spin  sebentar).  Ambil  1‐2  μl  DNA  yang  telah  didenaturasi  lalu  teteskan  pada  membran  dan  biarkan  sampai  kering.  Ulangi  penetasan  hingga  DNA  habis.  Masukkan  membran  ke  dalam  alat  crosslinker  untuk  memfiksasi DNA di membaran, pada intensitas 1200 x 100 m Joule/cm2 selama 1 menit. Membran siap  untuk digunakan dalam hibridisasi. 

Pelabelan Probe 

20 ul cross linker solution diencerkan dengan ditambahkan 80 ul air. DNA (atau RNA) diencerkan  untuk label sampai konsentrasi 10 ng/ul dengan air yang berbeda. Diambil 10 ul sampel DNA (yang telah  diencerkan)  dan  masukkan  ke  eppendorf,  kemudian  didenaturasi  dalam  water  bath  100°C  selama  5  menit. Eppendorf didinginkan di es selama 5 menit,lalu  spin down. 10 ul buffer reaksi ditambahkan ke  dalam ependorf, lalu  di mix. Kemudian ditambahkan 2 ul labeling reagen, lalu di mix. Ditambahkan 10 ul 

cross linker solution, lalu di mix, kemudian di spin down lalu kemudian dilakukan diiInkubasi 37°C selama 

30  menit.  Probe  dapat  digunakan  langsung  atau  dapat  disimpan  di  es  paling  lama  2  jam  (untuk  penyimpanan yang lebih lama, probe yang sudah di label dapat disimpan dalam larutan 50% (v/v) pada ‐ 15°C s.d. ‐30°C sampai 6 bulan.  

Prehibridisasi 

Larutan  buffer  prehibridisasi  dibuat  dengan  melarutkan  NaCl  0,5  M  dan  5  %  (b/v)  blocking 

reagent  ke  dalam  larutan  hibridisasi  dan  dikocok  dengan  magnetic  stearer  selama  1  jam  pada  suhu 

ruang.  Membran  dimasukkan  ke  dalam  tabung  hibridisasi  dengan  posisi  yang  mengandung  DNA  pada  bagian  dalam  gulungan  dan  ditambahkan  SSC  3x  sebanyak  5  ml  tanpa  menyebabkan  terbentuknya 

– 20 ml larutan buffer prehibridisasi ke dalam tabung. Lakukan prehibridisasi selama 1 jam  pada suhu  42°C. 

Hibridisasi  

Larutan  buffer  prehibridisasi  di  dalam  tabung  ditambahkan  dengan  DNA  pelacak  yang  sudah  dilabel  dengan  menggunakan  pipet  mikro.  Tabung  eppendorf  tempat  DNA  pelacak  yang  sudah  dilabel  dibilas dengan larutan prehibridisasi supaya seluruh pelacak dapat masuk ke dalam larutan. Hibridisasi  dilakukan pada suhu 42°C.  

Washing 

Larutan  pembilas  pertama  dipanaskan  pada  suhu  42°C  di  dalam  oven  hibridisasi,  dilakukan  2  kali.  Membran  diambil  dari  dalam  tabung  dan  dimasukkan  dalam  wadah  yang  berisi  larutan  pembilas  kedua menggunakan pinset berujung tumpul. Wadah diletakkan di atas shaker dan digoyang selama 5  menit  pada  suhu  ruang,  dilakukan  2  kali.  Larutan  pembilas  kedua  dalam  wadah  di  ganti  dengan  yang  baru dan diinkubasikan kembali selama 5 menit pada suhu ruang. 

Deteksi Sinyal  

Larutan deteksi sinyal dibuat dengan mencampurkan detection reagent 1 dan detection reagent  2  (1:1)  sebanyak  0,125  ml/cm2.  Wrapping  plastik  disiapkan  diatas  permukaan  kaca  yang  rata  dan  diteteskan dengan larutan deteksi. Kelebihan larutan pembilas kedua dibuang dan permukaan membran  yang mengandung DNA disentuh (direndam) ke atas tetesan cairan pendeteksi, selanjutnya di inkubasi  selama 1 menit. Kelebihan larutan deteksi dibuang dan membran di bungkus dengan wrapping plastik.  Membran diletakkan dalam kaset dengan permukaan yang mengandung DNA menghadap atas. Dalam  ruang  gelap  dengan  menggunakan  lampu  bercahaya  merah  (red  safe  light)  film  autoradiografi  ECL  seukuran  membran  diletakkan  di  atas  membran  dan  dipress  di  dalam  Film  Cassette,  dilakukan  dalam  keadaan  gelap  pada  suhu  kamar  selama  4  jam.  Film  diangkat  dari  Film  Cassette  dan  dicuci  dengan  larutan  developer  dalam  keadaan  gelap  pada  suhu  kamar  selama  5  menit.  Film  dicuci  dengan  larutan  fixer dalam keadaan gelap pada suhu kamar selama 5 menit. Film dibilas dengan air pada suhu kamar  selama 5 menit. Film dikeringanginkan pada suhu kamar. Sinyal yang terdapat pada film diobservasi.  

HASIL DAN PEMBAHASAN  Hasil      Gambar 1. Dot blot pada membran     

Hibridisasi  dot  blot  dilakukan  pada  gen  DNA  dengan  cara  meneteskannya  menggunakan  mikropipet  sehingga  terbentuk  bulatan  seperti  pada  gambar  1.  Bentuk  bulatan  diperoleh  karena  pengaruh tetesan cairan dari DNA dan pelarutnya.  

 

Pembahasan 

Hibridisasi  dot  blot  sangat  berguna  dalam  penentuan  keberadaan  gen.  walaupun  teknik  PCR  dapat  digunakan  untuk  mengetahui  keberadaan  suatu  gen  atau  DNA,  tetapi  hibridisasi  dot  blot  tetap  dibutuhkan karena dengan teknik ini dapat diketahui panjang gen yang ada di dalam suatu organisme.  Selain itu hibridisasi juga dapat digunakan untuk  kajian keragaman molekuler, seperti RLFP dan RAPD.  Penapisan terhadap suatu pustaka untuk mengisolasi gen, baik pustaka genom maupun pustaka cDNA,  memerlukan  teknik  hibridisasi  dot  blot.  Konfirmasi  hasil  isolasi  suatu  gen  atau  DNA  juga  dilakukan  menggunakan teknik hibridisasi dot blot (Suharsono dan Widyastuti, 2006). 

  Pada prinsipnya terdapat dua cara pemblotan DNA. Pertama adalah pemblotan dengan sistem  kapiler  yang  sudah  dipakai  sejak  lama.  Kedua  adalah  pemblotan  dengan  sistem  vakum  yang  banyak  dipakai  belakangan  ini  karena  relative  lebih  cepat  dan  mudah.  Akan  tetapi  dalam  hibridisasi  dot  blot  tidak dilakukan keduanya. Dot blotting dilakukan dengan penetesan dan pengeringan pada suhu ruang  yang langsung diikuti dengan cross linking menggunakan UV.  

  Berdasarkan  informasi  yang  diperoleh,  dari  percobaan  deteksi  sinyal,  tidak  diperoleh  bercak  hitam  pada  film.  Tidak  adanya  bercak  hitam  pada  film  dikarenakan  tidak  timbulnya  cahaya  dimana  cahaya  tersebut  dapat  timbul  apabila  substrat  yang  berupa  protein  (streptavidin)  yang  dapat 

pada  DNA  probe.  Berdasarkan  hasil  tersebut  diketahui  bahwa  hibridisasi  dari  hasil  dot  blotting  tidak  menghasilkan sinyal pada film x‐ray.  

  Tidak terdapatnya sinyal (dot) pada film X‐Ray tidak berarti tidak terdapatnya gen target, namun  perlu  dilakukan  dengan  waktu  yang  lebih  lama  pada  tahap  deteksi  sinyal  ketika  membran  hasil  hibridisasi  ditempelkan  dengan  film  sehingga  memungkinkan  untuk  alkalin  phosphatase  bereaksi  dengan DNA yang ada pada membran.    SIMPULAN  1. Hibridisasi dot blot dilakukan dengan penetesan menggunakan mikropipet.  2. Sinyal DNA hasil hibridisasi tidak dapat dideteksi karena tidak tercetak pada film.      DAFTAR ACUAN    Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. Pusat Penelitian  Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi – Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat IPB dengan  DIKTI – DIKNAS, Bogor.