• Tidak ada hasil yang ditemukan

LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2018

Membagikan "LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA"

Copied!
14
0
0

Teks penuh

(1)

LAPORAN PRAKTIKUM

REKAYASA GENETIKA

LAPORAN I

(ISOLASI DAN PEMETAAN DNA PLASMID)

KHAIRUL ANAM

P051090031/BTK

BIOTEKNOLOGI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)

ISOLASI DAN PEMETAAN DNA PLASMID

TUJUAN

Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi DNA plasmid dan memetakan plasmid

PGEM T Easy dengan digesti menggunakan beberapa enzim restriksi.

TINJAUAN PUSTAKA

Plasmid

Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses

rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan

dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah

molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di

dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan

Widyastuti, 2006).

Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai

wahana (vektor) kloning, antara lain adalah : a). plasmid mempunyai ukuran molekul yang

kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi; b). DNA nya berbentuk

sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia; c). mempunyai titik

ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel

inang secara otonomi; d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga

terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi;

e). mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu

sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu

(Brock, et al., 1994).

Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap

kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu

memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat

pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding

sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar

(3)

membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di

dalamnya (Saunders and Parkers, 1999). Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan

dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat),

dan SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel

dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel

maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun

SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. Ini

semua menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan

oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal

hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan,

digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform

(membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk

memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002).

Spektrofotometer

Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui

jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan

panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA yang berhubungan dengan

kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi

suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio OD260/OD280

antara 1,8-2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan

protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi

konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan

Widyastuti, 2006)

Elektroforesis

Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk

memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat dilihat secara

langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose

maupun gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Untuk

dapat divisualisasikan, maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida

(EtBr), kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap sinar

(4)

sehingga molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. DNA

merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan dalam medan listrik, DNA

akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan migrasi ditentukan oleh : i)

ukuran molekul DNA; ii) prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA; iii) arus listrik yang

diberikan untuk memigrasikan molekul DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin

cepat migrasi DNA. Semakin rapat media yang digunakan, semakin tinggi prosentasenya,

maka semakin lambat DNA bermigrasi. Semakin besar arus yang diberikan, maka

semakin cepat DNA bermigrasi.

Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan

ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan kekuatan

gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan menggunakan

kekuatan elektrik. Gel elektroforesis mengambil keuntungan bahwa, sebagai asam

organik, DNA bermuatan negatif. Ketika diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA

menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi kutub negatif (katoda).

Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus

ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk i) menambah densitas, sehingga

DNA akan selalu berada di dasar sumur; ii) pewarna untuk memudahkan meletakkan

sampel DNA ke dalam sumur, iii) agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang

dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang

biasa digunakan adalah bromophenol blue dan xylene cyanol. Selain itu, pembacaan pita

DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan ethidium bromida di atas lampu UV yang

dibandingkan dengan DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas

jumlah DNA (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

Restriksi

Enzim restriksi endonuklease (enzim restriksi) mengenali urutan nukleotida spesifik

dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut.

Enzim ini telah ditemukan lebih dari 30 tahun yang lalu sehubungan dengan fenomena

pemotongan yang spesifik terhadap bakteri inang dan modifikasi oleh virus bakteri. Bakteri

pada mulanya tahan terhadap infeksi virus karena bakteri memiliki sistem pertahanan

dengan merusak molekul DNA asing yang masuk ke dalam selnya. Enzim restriksi yang

berhasil dimurnikan pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII dari Escherichia coli, dan

(5)

DNA pada urutan basa tertentu yang spesifik, yang menghasilkan fragmen-fragmen

seukuran gen yang dapat disambungkan kembali. Para peneliti dengan cepat segera

mengetahui bahwa enzim restriksi merupakan alat biologis baru yang dapat digunakan

untuk mempelajari organisasi, fungsi, dan ekspresi gen.

Enzim restriksi melindungi bakteri dari infeksi virus. Enzim ini berperan dalam

sistem imun pada mikroorganisme. Jika bakteri E. coli yang tidak memiliki enzim restriksi

diinfeksi virus, maka sebagian besar partikel virus mampu menyebabkan infeksi. Namun,

jika bakteri E. coli memiliki enzim restriksi, kemungkinan infeksi virus akan menurun.

Enzim restriksi biasanya terdapat dalam kombinasi dengan enzim pemodifikasi lain

yang melindungi DNA-nya sendiri dari pemotongan, misalnya DNA-metil transferase

(dnmt). Dnmt akan memetilasi basa DNA pada tiap untai sehingga sekuen yang dikenali

oleh enzim restriksi tidak akan terpotong.

Secara umum, enzim restriksi dapat dibedakan ke dalam 3 tipe, berdasarkan pada

komposisi sub unit, posisi pemotongan, spesifisitas sekuen DNA, dan perlu tidaknya

kofaktor. Enzim-enzim tipe I merupakan enzim yang kompleks, multisubunit, kombinasi

antara restriksi dan pemodifikasi yang memotong DNA pada area random yang jauh dari

sisi pengenalan. Enzim tipe I secara biokimia mungkin banyak berfungsi di dalam sel,

tetapi mereka kurang menguntungkan untuk digunakan dalam percobaan di laboratorium.

Enzim tipe II memotong DNA pada posisi tertentu yang dekat atau berada di antara

sekuen yang dikenalnya. Enzim tipe II menghasilkan fragmen-fragmen tertentu dengan

pola pita-pita yang spesifik pada gel agarosa. Enzim tipe inilah yang dipakai untuk

berbagai percobaan dalam analisis DNA dan kloning gen. Enzim tipe III juga merupakan

kombinasi restriksi dan enzim pemodifikasi. Enzim ini memotong DNA di luar sekuen yang

dikenal dan memerlukan 2 sekuen yang sama pada orientasi yang berlawanan pada untai

DNA yang sama untuk dapat memotong. Enzim-enzim ini jarang menghasilkan potongan

yang sempurna.

Ada beberapa faktor kunci yang harus diperhatikan untuk melakukan pemotongan

dengan enzim restriksi (enzyme digestion). Di antaranya adalah: gunakan jumlah DNA,

enzim, dan buffer yang benar dalam volume reaksi total yang sesuai. Satu unit enzim

restriksi akan memotong 1 ug DNA secara sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam.

Rasio enzim : DNA : volume reaksi ini dapat digunakan sebagai pedoman dalam

menentukan reaksi. Meskipun demikian, sebagian besar peneliti mengikuti pedoman

(6)

variasi dalam sumber, jumlah dan kemurnian DNA. DNA harus terbebas dari kontaminan

seperti fenol, kloroform, alkohol, EDTA, deterjen (SDS) atau garam yang berlebih. Metilasi

DNA dapat mengakibatkan penghambatan digesti dengan enzim tertentu. DNA plasmid

superkoil dan DNA yang terikat gel agarose pada umumnya memerlukan lebih dari 1

unit/ug untuk dapat terpotong sempurna.

Enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. Oleh karena itu, sebaiknya

disimpan pada suhu -20°C untuk sebagian besar enzim. Beberapa enzim perlu disimpan

pada -70°C. Enzim ini harus tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer

dan harus selalu menjadi komponen yang ditambahkan terakhir pada campuran reaksi.

Selain stabilitas, harga enzim restriksi pun mahal. Campur reaksi dengan baik dengan

cara pemipetan atau menggoyang tabung reaksi. Sentrifus dengan cepat selama

beberapa detik jika ada cairan yang menempel di dinding tabung.

Untuk menghentikan reaksi enzim, dapat dilakukan penambahan stopper reagent

yang mengandung SDS-EDTA.

Pemetaan Plasmid

Menurut Brown (1991) dan Glick and Pasternak (1994), dalam menyusun peta

restriksi harus dilakukan suatu rangkaian digesti restriksi. Jumlah dan ukuran fragmen

yang dihasilkan oleh tiap-tiap endonuklease restriksi harus ditentukan dengan

elektroforesis gel, kemudian dibandingkan dengan ukuran marka. Hasil yang didapat

harus didukung oleh hasil rangkaian digesti ganda, yaitu DNA dipotong dengan dua enzim

restriksi secara bersamaan. Pembandingan hasil digesti tunggal dan digesti ganda akan

(7)

BAHAN DAN METODE KERJA

Isolasi DNA Plasmid

Bakteri yang digunakan dalam praktikum ini adalah E. coli yang telah tersisipi

plasmid.

Satu koloni bakteri E. coli yang mengandung plasmid ditumbuhkan dalam 10 ml

media LB (bacto tryptone 10g/l, bacto-yeast extract 5g/l, NaCl 10 g/l) lalu diinkubasi di atas

shaker dengan kecepatan 250 rpm pada suhu 37°C selama semalam. Kemudian 1,5 ml

kultur dipindahkan ke dalam tabung 1,5 ml lalu diendapkan dengan sentrifugasi 10.000

rpm (Tomy MRX-150) 4°C selama 10 menit. Lalu endapan bakteri disuspensikan ke dalam

100 ul buffer suspensi sel (Tris HCl pH 7.5 + EDTA) dan di-vortex. Kemudian ditambah

200 ul buffer lisis (0.2M NaOH, 1% SDS). Suspensi dihomogenkan dengan

membolak-balik tabung (6-8kali) lalu didiamkan 3 menit. Bufer netralisasi (1,32M Na-asetat pH 4,8)

ditambahkan sebanyak 300 ul dan dihomogenkan dengan membolak-balik tabung.

Setelah itu, dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10 menit. Supernatan ditransfer

ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil

alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA. Fase air (supernatan)

yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37°C semalam. Kemudian

DNA diendapkan dengan penambahan Na-asetat pH 5,2 sehingga larutan menjadi netral

dan etanol absolut untuk mengikat air. Setelah diinkubasi pada 30°C selama 2 jam,

dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10 menit. Pelet dibilas dengan etanol 70%

kemudian disentrifugasi kembali 10.000 rpm selama 10 menit pada 4°C. Supernatan

dibuang dan pelet dikeringkan. Selanjutnya pelet dilarutkan ke dalam TE (Tris-HCl pH 8 10

mM, EDTA 1 mM).

Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer

Suspensi DNA plasmid diencerkan dengan mengambil 1 ul dalam 99 ul H2O atau

TE. Suspensi DNA yang telah diencerkan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang

260 nm dan 280 nm. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dikonversikan ke

dalam konsentrasi, yaitu 1 OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml. Untuk mengetahui

kemurnian DNA terhadap kontaminan protein, nilai absorbansi 260 nm dibandingkan

(8)

Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa

Gel agarose 1% dibuat dengan mensuspensikan agarose ke dalam buffer TAE 1x

(Tris-HCl pH 8,3 40 mM, asam asetat pekat 1,98 mM, EDTA 1 mM) atau TBE 1x (Tris-HCl

100 mM, asam borat 83 mM, EDTA 1 mM), dipanaskan hingga jernih dengan microwave.

Setelah suhu tidak terlalu panas (60°C), gel dicetak dengan menggunakan gel tray

(cetakan gel) dan dipasang sisir untuk membuat sumuran, lalu dibiarkan beku. Sisir

dilepas kemudian gel dipindah ke dalam electrophoresis chamber. Sebanyak 1-2 ul DNA

dicampur dengan larutan pewarna (loading dye; bromofenol biru 0,25%, xylene cyanol FF

0,25%, sukrosa 40%). Kemudian sampel DNA tersebut serta penanda kuantitas (marker, λ

yang dipotong dengan enzim HindIII) diaplikasikan pada gel agarosa. DNA dimigrasikan

kemudian setelah selesai migrasi, direndam dengan larutan etidium bromide, dan dilihat di

atas UV setelah dicuci dengan H2O. Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan

antara pendaran pita DNA plasmid yang dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda

kuantitas 10, 20 dan 50 ng. Bentuk DNA plasmid ditentukan dengan melihat jumlah pita di

dalam gel.

Digesti dengan Enzim Restriksi pada Pemetaan DNA Plasmid

Sebanyak 5-10 ug DNA plasmid yang akan dipotong menjadi fragmen-fragmen, 2

ul larutan penyangga reaksi 10x (10%), 1 ul enzim restriksi (10 unit/ul) dan dH2O hingga

volume larutan menjadi 20 ul dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 500 ul (dengan

urutan: dH2O, larutan penyangga, DNA plasmid, enzim). Kemudian larutan diinkubasi

selama 1 jam pada suhu 37°C. Selesai inkubasi, dilakukan elektroforesis untuk mengecek

apakah enzim telah memotong DNA. Bila DNA belum terpotong sempurna, waktu inkubasi

dan/enzim restriksi ditambahkan lagi. Bila telah terpotong, aktivitas enzim dihentikan

dengan memanaskan larutan DNA pada suhu 65-70°C. Selanjutnya, dilakukan

elektroforesis kembali untuk menentukan ukuran plasmid dan fragmen-fragmennya.

Enzim-enzim restriksi yang digunakan antara lain: 1. NotI, 2. EcoRI, 3. HindIII, 4. SacI, 5.

(9)

HASIL DAN PEMBAHASAN

 

Isolasi DNA Plasmid

Dapat diketahui bahwa dalam proses mengisolasi plasmid dari suatu bakteri, ada

tiga tahap penting yang perlu dilakukan, yaitu 1. Lisis membran sel bakteri, 2. Ektraksi

DNA, 3. Pengendapan DNA.

Gambar 1. Lisis dinding dan membran sel bakteri

Proses lisis diawali dengan adanya pemberian SDS + NaOH dimana SDS (sodium

dodesil sulphate) merupakan deterjen yang berperan untuk melisis dinding atau membran

sel yang terdiri dari lipid (fosfolipid) dan NaOH sebagai larutan basa berfungsi untuk

denaturasi protein atau DNA (DNA double strain menjadi single strain). Terjadinya proses

lisis ditandai dengan terbentuknya lendir. Kemudian larutan disentrifugasi untuk diambil

supernatannya berupa lautan suspensi.

(10)

Pada larutan suspensi sebelum diekstraksi, terdapat senyawa DNA plasmid, RNA,

Protein, Senyawa Organik dan Komponen Lipid. Ekstraksi dilakukan dengan adanya

penambahan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) dengan tujuan untuk memisahkan

antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform berfungsi sebagai pelarut

dari senyawa organik dan komponen lipid. Dengan dilakukannya ekstraksi menggunakan

PCI maka setelah disentrifugasi terbentuklah 3 fase dimana terdiri dari fase air yang ada di

paling atas tempat DNA plasmid berada, protein yang terkoagulasi di fase yang ada di

tengah dan fase Phenol-Chloroform yang ada di paling bawah karena sifat chloroform

yang berat jenisnya besar.

Gambar 3. Pemurnian DNA dengan etanol

Fase air yang diambil kemudian diendapkan menggunakan sodium acetat untuk

menciptakan kondisi netral dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada

DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi. Pelet yang didapat kemudian

dimurnikan dengan penambahan etanol 70% yang kemudian disentrifugasi lagi untuk

didapatkan pelet. Pada tahap ini tidak perlu dilakukan resuspensi karena apabila dilakukan

resuspensi DNA akan sulit mengendap karena pH nya tidak netral lagi. Penambahan

RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisa-sisa fragmen RNA setelah dilakukan

pemurnian dan proses vakum dengan bantuan larutan buffer TE ataupun dH2O.

(11)

Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer

Dari DNA plasmid yang diisolasi diperoleh dilakukan kuantifikasi dengan

menggunakan metode spektrofotometri, didapatkan hasil seperti pada Tabel 1.

Tabel 1. Nilai absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260 dan 280 nm

Kel Abs λ260 Abs λ280 Abs λ260/ Abs λ280 konsentrasi ng/ul

6 2.213 1.333 1.66 110.6

Dari data spektrofotometri dapat diketahui bahwa larutan DNA plasmid

kemungkinan masih terdapat protein sebagai kontaminan dimana rasio antara absorbansi

λ260/λ280 sebesar 1.66 adalah lebih kecil dari 1.8 sehingga DNA plasmid yang didapatkan belum murni.

Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa

Analisis menggunakan gel agarose dilakukan dengan melakukan elektroforesis

DNA sampel bersama dengan DNA penanda kuantitas. Konsentrasi DNA penanda

kuantitas yang digunakan adalah 10 ng/ul, 20 ng/ul, 40 ng/ul. Elektroforesis dilakukan

sampai larutan pewarna menjauhi sumuran. Untuk kuantifikasi, jarak migrasi yang

ditempuh tidak perlu terlalu jauh dan untuk menganalisis bentuk DNA.

   

     

(12)

Dari hasil elektroforesis dapat diketahui bahwa DNA plasmid yang terbentuk ada

beberapa macam karena terbentuknya beberapa pita. Kemungkinan pita-pita tersebut

adalah DNA plasmid dimana plasmid berbentuk superheliks (ccc = covalently closed

circular) bermigrasi paling jauh dari sumur, pita DNA plasmid yang berada di tengah

berbentuk linear, sedangkan yang bermigrasi paling dekat dengan sumur adalah pita DNA

plasmid yang berbentuk open sirkuler. Semakin kompak suatu DNA maka akan bermigrasi

semakin cepat sehingga pada saat yang bersamaan akan bermigrasi lebih jauh

dibandingkan dengan bentuk yang kurang kompak. DNA superheliks lebih kompak

dibandingkan dengan DNA plasmid dalam keadaan open sirkuler atau linier.

Dari hasil elektroforesisi pun dapat dikuantifikasi konsentrasi dari larutan DNA yang

di dapatkan seperti pada kelompok 5, untuk 1 ul DNA plasmid yang dielektroforesis

mengandung bobot 40 ng, sehingga apabila larutan DNA yang dimiliki adalah 50 ul maka

konsentrasi DNA yang diisolasi adalah 2000 ng/50 ul atau 40 ng/ul. Sehingga ketika akan

dilakukan restriksi maka larutan DNA yang dibutuhkan adalah sekitar 2.5 ul untuk

mendapatkan 100 ng DNA.

Digesti dengan Enzim Restriksi pada Pemetaan DNA Plasmid

  Hasil pemotongan DNA plasmid dengan beberapa enzim restriksi menghasilkan

pita-pita dengan ukuran basa yang berbeda dan unik sesuai dengan enzim restriksinya

masing-masing. pada praktikum diperoleh pita-pita hasil elektroforesis DNA plasmid yang

telah direstriksi seperti yang terlihat pada Gambar 5.

 

EcoRI  NotI HindII SacI EcoRI  HindIII 

HindIII  SacI 

NotI  HindIII  I

(13)

Dari hasil elektroforesis untuk proses restriksi diperoleh panjang fragmen sebagai

Maka dari data tersebut dapat diperoleh pemetaan enzim restriksi pada plasmid pGEM T

Easy seperti yang terlihat pada Gambar 6.

 

Gambar 6. Pemetaan plasmid pGEM T Easy

 

Dari hasil pemetaan dapat diketahui bahwa SacI, EcoRI dan NotI memiliki dua

situs pengenalan restriksi dimana satu situs pengenalan restriksi pada tempat yang sama,

sedangkan HindIII hanya memiliki satu situs pengenalan. Situs pengenalan pengenalan

(14)

SIMPULAN

1. Dari isolasi DNA plasmid, diperoleh DNA plasmid yang kurang murni dan diperoleh

konsentrasi plasmid sebesar 110.6 ng/ul

2. Dari hasil elektroforesis diperoleh beberapa tipe plasmid dari linear, sirkular, open

sirkular dan diperoleh konsentrasi DNA 40 ng/ul.

3. Dari hasil restriksi untuk pemetaan Plasmid diketahui pGem T Easy memiliki 4

situs restriksi dengan enzim SacI, EcoRI dan NotI dan HindIII.

DAFTAR ACUAN

Brock, T. D., Michael T. Madigan, john M. Martinko and Paker. 1994. Biology of

microorganisms. Prentice Hall.

Brown, T.A. 1991. Pengantar Kloning Gena (terjemahan). Yayasan Essentia Medica.

Glick, B.R. and J.J. Pasternak. 1994. Molekuler Biotechnology, Principles and

applications of Recombinan DNA. ASM Press. Washinton D.C.

Muladno, 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda. Bogor.

Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan

Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB

Bahan Kuliah dan Praktikum Rekayasa Genetika

Gambar

Gambar 2. Ekstraksi DNA dengan PCI
Gambar 3. Pemurnian DNA dengan etanol
Tabel 1. Nilai absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260 dan 280 nm
Gambar 5. Hasil digesti DNA plasmid mengunakan beberapa enzim restriksi
+2

Referensi

Dokumen terkait

bukan pada 16s rRNA maka organism tersebut bukan bakteri dan atau PCR yang dilakukan. kurang sempurna yang mengakibatkan hasil PCR tidak dapat digunakan sebagai

compare means       paired- sample T Test    paired- sample T Test , atau seperti yang terlihat pada gambar , atau seperti yang terlihat pada gambar

Gambar 2.2 menunjukkan bagian situs pemotongan untuk plasmid (vektor) dari pTZ57R/T dengan beberapa enzim yang bisa digunakan untuk proses restriksi.. Pada plasmid ini

Metode yang digunakan adalah melakukan pemurnian produk PCR, meligasi vektor plasmid pGEM-T Easy dengan produk purifikasi dan mentransformasi pada sel kompeten

Setelah informasi terkumpul dalam database, langkah berikutnya adalah menganalisa data.  Pencarian  database  umumnya  berdasar  hasil  alignment/pensejajaran 

Pengujian aktivitas enzim dilakukan dengan mereaksikan ekstrak enzim restriksi yang diperoleh dengan substrat berupa plasmid dan DNA fage lambda dalam kondisi reaksi yang

Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp pGEM®‐T Easy/RAP‐1 bằng enzyme giới hạn, M: Thang chuẩn khối lượng ADN 1kb, Bioline, 1, 2, 3: Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pGEM®‐T Easy/RAP‐1 bằng

Sebanyak 100 µl Elution- Buffer yang telah dipanaskan dimasukkan ke dalam tub, dibiarkan selama 5 menit dan kemudian disentrifus pada kecepatan 14 000-16 000 rpm selama 30 detik..