LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA REKOMBINAN
ACARA III ISOLASI DNA
Nama : Atha Wahyuning Utami
NIM : 24020121140140
Kelompok : 5
Asisten : Lantika Intania
LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA UNIVERSITAS DIPONEGORO
2023
ACARA III ISOLASI DNA I. TUJUAN
1.1. Mampu mengetahui prinsip-prinsip isolasi DNA
1.2. Mampu mengetahui metode isolasi DNA secara sederhana 1.3. Mampu menjelaskan hasil isolasi DNA
II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1. DNA
Gambar 2.1 Deoxyribonucleic acid (DNA) (Alberts et al., 2015)
Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan asam nukleat (biomolekul) yang berisi informasi genetik yang menentukan sifat biologis perkembangan semua bentuk kehidupan seluler. Deoxyribonucleic Acid Acid (DNA) sering disebut sebagai molekul hereditas karena bertanggung jawab atas perbanyakan genetikan semua sifat. Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup. Deoxyribonucleic Acid (DNA) merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme.
Deoxyribonucleic Acid (DNA) genom meliputi gen dan intergen (Murtiyaningsih, 2017).
Deoxyribonucleic Acid (DNA) merupakan polinukleotida untai ganda yang memiliki karakteristik komponen penyusun antara lain gula doksiribosa,
gugus fosfat dan basa nitrogen (adenin, guanie, timin dan sitosin). Untai DNA tersusun atas rangkaian nukleatida yang terhubung melalui ikatan fosfodiester yang terbentuk diantara gula pentosa dan gugus fosfat, sedangkan untai ganda DNA terhubung melalui ikatan hidogen yang terbentuk dianatara pasangan basa nitrogen. Pasangan basa nitrogen pada DNA meliputi adenine dan timi dengan dua ikatan hydrogen serta guanine dan sitosin dengan tiga ikatan hydrogen (Nur’aini dkk., 2019). Deoxyribonucleic Acid (DNA) akan menyimpan informasi genetic yang spesifik untuk setiap individu dan spesies tertentu, yang akan diwariskan ke generasi berikutnya (Morihito dkk., 2017).
2.2. Isolasi DNA
Gambar 2.2 Isolasi DNA (Infiniti, 2022)
Isolasi DNA merupakan teknik yang digunakan rekayasa genetika untuk mengeluarkan dan memisahkan DNA dari partikel-partikel lainnya seperti lipid, protein, polisakarida, dan zat lainnya. Tujuan dari isolasi DNA yaitu untuk mengeluarkan DNA dari sel. Penghancuran dinding sel dapat dilakukan secara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil, sedangkan secara kimiawi dapat dengan pemberian bahan yang dapat merusak membran sel dan membran inti, salah satunya adalah deterjen.
Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen tersebut selain berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan
dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA. Isolasi DNA berguna untuk beberapa analisis molekuler dan rekayasa genetika seperti genom editing, transformasi, dan PCR (Hariyadi dkk., 2018).
Prinsip dasar isolasi total DNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Ekstrak sel kemudian dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA total (Utami dkk., 2012). Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan, seperti preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA.
Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Murtiyaningsih, 2017).
2.2.1. Isolasi DNA Bakteri
Gambar 2.2.1 Isolasi DNA Bakteri (Pambudiono et al.,2016)
Isolasi DNA bakteri prinsipnya merupakan proses pemisahan DNA plasmid yang dimiliki oleh bakteri. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total DNA dari jaringan. Langkah pertama untuk mendapatkan DNA plasmid adalah dengan
menumbuhkan sel-sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan.
Setelah itu sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak sel ini kemudian dipurifikasi dengan serangkaian perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni.
Isolasi DNA yang dilakukan dalam penelitian ini menurut standar prosedur yang sudah biasa dilaksanakan. Homogenisasi sel dengan prosedur ini akan menghasilkan DNA utuh karena proses ini menyebabkan disrupsi sel dan tercucinya komponen-komponen sel lain selain DNA. Penambahan kloroform setelah sentrifugasi memisahkan larutan menjadi fase cair dan padat dimana fase cair merupakan DNA dan fase padat adalah campuran protein dan DNA (Kumalasari dkk., 2020).
Proses ekstraksi pada dasarnya adalah untuk membebaskan DNA dari massa sel dan komponen lainnya di dalam sel. Umumnya ekstraksi untuk mengisolasi DNA bakteri dilakukan beberapa tahapan seperti mengisolasi bakteri dari organ terinfeksi, menumbuhkan pada media agar, pemurnian isolate dan terakhir dilakukan isolasi DNA.
Pelaksanaan isolasi DNA bakteri (khususnya gram positif) dari jaringan yang terinfeksi, diperlukan adanya modifikasi atau pre reatment dengan melakukan pemanasan atau penggunaan bahan kimia untuk melisiskan dinding sel bakteri (Gardenia dan Isti, 2011). Metode umum yang digunakan untuk isolasi DNA bakteri yaitu metode CTAB/NaCl, namun perkembangan teknologi saat ini telah menghasilkan produk dalam bentuk kit untuk isolasi DNA. Kit untuk isolasi DNA dikeluarkan oleh beberapa perusahaan dagang, salah satu produknya ialah QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) merupakan kit yang digunakan khusus untuk isolasi DNA bakteri baik dari kultur murni maupun dari sekret makhluk hidup seperti darah, dan dapat digunakan dengan alat otomatis (robotik) yang bersifat closed system (Fitriya dkk., 2015).
2.2.2. Isolasi DNA Hewan
Gambar 2.2.2 Isolasi DNA Hewan (Hariyadi et al., 2018)
Isolasi DNA dapat dilakukan pada semua makhluk hidup dan juga virus. Salah satu tantangan dalam isolasi DNA adalah isolasi DNA pada organisme hewan mamalia. Mamalia memiliki kompleksitas jaringan dan organ yang sangat tinggi, sehingga terdapat berbagai macam kendala yang sering ditemui dalam proses pengerjaan isolasi DNA pada hewan seperti terlalu banyaknya lipid dan protein yang menyusun suatu jaringan, dan adanya enzim nuklease pada beberapa organ hewan yang juga dapat merusak asam nukleat (Cseke et al., 2012). Masalah lain yang juga ditemukan dalam proses isolasi DNA hewan adalah tingkat ketahanan dari organ atau jaringan hewan tidak seperti tumbuhan dan lainnya, jaringan hewan dapat membusuk dengan cepat dan menyebabkan kerusakan dalam jaringannya dalam waktu yang singkat, sehingga disarankan dalam proses isolasi DNA hewan digunakan sampel yang masih segar, tetapi untuk melakukan isolasi DNA hewan dengan menggunakan sampel segar sangatlah sulit.
Organ yang telah di ambil setelah pembedahan harus diawetkan dan disimpan dalam freezer apabila akan digunakan pada lain hari (Hariyadi dkk., 2018).
Banyaknya kendala yang ada dalam proses isolasi DNA hewan dari jaringan atau organ yang diawetkan menyebabkan tingkat keberhasilan isolasi DNA hewan tersebut menjadi semakin minim.
Isolasi DNA pada sampel hewan segar dan olahan dapat dilakukan dengan menggunakan metode manual CTAB maupun kit komersial yaitu TIANamp genomic DNA kit, DNAzol Genomic DNA Isolation Reagent, GenCheck DNA Extraction Reagent (FASMAC), dan Qiagen.
QIAGEN DNeasy Blood and Tissue yang digunakan untuk sampel segar, dan QIAGEN DNeasy Food Mericon kit yang dikhususkan
untuk sampel makanan (Setiaputri dkk.,, 2020). Sumber jaringan yang diekstraksi pada isolasi DNA ikan kerapu yaitu jaringan otot bagian dorsal (epaxial muscle). Jaringan yang dapat diambil sebagai material Deoxyribose Nucleic Acid (DNA) antara lain otot, hati, jantung, sel epitel dan bagian tubuh lainnya (Ariyanti dan Sister, 2019).
2.2.3. Isolasi DNA Tumbuhan
Gambar 2.2.3 Isolasi DNA Tumbuhan (Octavia dkk., 2021)
Sel tanaman dilindungi oleh membran dan dinding sel. Membran sel terdiri atas ikatan antara protein dan lemak, sedangkan dinding sel tersusun atas polisakarida. Membran dan dinding sel tanaman harus dihancurkan terlebih dahulu untuk mengeluarkan DNA-nya.
Penghancuran dinding dan membran sel dapat dilakukan secara mekanik, kimiawi maupun enzimatik. Proses penghancuran sel dipengaruhi oleh kuantitas dan kualitas sampel serta teknik penghancurannya (Ferniah dan Pujiyanto, 2013). Membran sel tumbuhan dapat dilisiskan dengan menambahkan detergen untuk dapat membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNAse (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Larutan DNA dipresipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Triani, 2020).
Ekstraksi DNA dari tumbuhan dilakukan melalui proses penghancuran dinding sel (lysis of cell walls), pemisahan DNA dari
bahan padat seperti selulosa serta penghilangan protein dan RNA (cell digestion), dan pengendapan DNA (precipitation of DNA). Proses ekstraksi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dari komponen seluler lain seperti protein, RNA, dan lemak (Retnaningati, 2020).
Permasalahan utama yang sering muncul dalam proses isolasi DNA tanaman adalah kandungan senyawa polisakarida, polifenol, protein, RNA, dan senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada tanaman yang dapat menghambat tahapan isolasi DNA. Sampel yang akan digunakan dalam isolasi DNA tanaman harus diperhatikan. Seperti pemilihan daun yang bebas dari infeksi jamur dan virus dimaksudkan agat DNA yang diperoleh tidak terkontaminasi oleh asam nukleat dari jamur maupun virus (Huda dan Daryono, 2013).
2.2.4. Isolasi DNA Menggunakan Wizard Genomic RNA Purification Kit
Gambar 2.2.4 Isolasi DNA Menggunakan Wizard Genomic RNA Putrification Kit
(Perwitasari dkk., 2020)
Isolasi DNA menggunakan Wizard Genomic RNA Putrification Kit merupakan metode yang dilakukan dengan kit ekstraksi DNA.
Metode ini merupakan metode yang dikeluarkan oleh promega corporation dan teruji hasilnya, namun disisi lain biaya yang dibutuhkan cukup besar (Pangesti dkk., 2020). Isolasi metode kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega) dilakukan melalui beberapa tahap, pertama potongan sampel dimasukkan dalam mikrotube steril ukuran 1,5mL lalu ditambahkan 120 µL EDTA 0,5 M (pH 8), 500 µL Nuclei Lysis Solution, dan 17,5 µL Proteinase K.
Sampel dinkubasi selama 45 menit pada suhu 650C, kemudian
ditambahkan 3 µL RNase solution dan dibolak-balik. Sampel diinkubasi kembali selama 20 menit pada suhu 370C dan ditambahkan 200 µL protein precipitation solution. Setelah penambahan larutan presipitasi, sampel divortex 20 detik lalu didinginkan diatas es selama 5 menit. Sampel disentrifugasi 4 menit pada 13.000 rpm, kemudian supernatan dipindahkan ke mikrotube baru serta tambah 600 µL isopropanol dan dibolak-balik. Sentrifugasi 10 menit pada kecepatan 13.000 rpm. Supernatan dibuang dan ditambahkan 600 µL etanol 70%.
Sentrifugasi kembali untuk yang terakhir selama 10 menit pada 13.000 rpm. Supernatan dibuang dan ditambahkan 100 µL DNA rehydration solution. Tahap terakhir sampel diinkubasi selama 60 menit pada suhu 650C, template DNA siap digunakan untuk proses selanjutnya (Iqbal dkk., 2016).
2.3. Tanaman Pucuk Merah (Syzygium myrtifolium)
Gambar 2.3 Daun Pucuk Merah (Audiani, 2023)
Tanaman pucuk merah (Syzygium myrtifolium) adalah jenis tanaman hias yang tergolong dalam famili Myrtaceae. Tanaman ini mempunyai 2 jenis daun, yaitu daun muda berwarna merah dan daun tua berwarna hijau, daun tanaman pucuk merah ini juga memiliki aroma yang khas jika diremas (Suryati et al., 2023). Daun pucuk merah ketika baru tumbuh pucuk daunnya berwarna merah menyala, kemudian berubah menjadi coklat, lalu berubah lagi menjadi warna hijau. Pucuk merah berupa daun tunggal
berbentuk lancip, warna daun mengalami perubahan, bertangakai sangat pendek, permukaan atas daun mengilap dan tumbuh berhadapan. Ukuran daun pucuk merah panjang ± 6 cm dan lebar ± 2 cm dengan pertulangan daunnya menyirip, bunga majemuk tersusun dalam malai berkarang terbatas (Pratama, 2019). Pucuk merah sering digunakan sebagai tanaman pagar rumah yang ditanam secara merata di depan rumah bahkan di taman daerah perkotaan.
Tanaman hias ini memiliki distribusi asli di Timur Laut India, Myanmar, Thailand, Semenanjung Malaysia, Singapura, Sumatera, Kalimantan dan Filipina. Salah satu negara yang menjadi tempat ideal bagi tanaman pucuk merah adalah Indonesia karena tanaman ini sangat cocok hidup di daerah beriklim tropis (Audiani, 2023).
III. METODE PENELITIAN 3.1 Alat
3.1.1 Mortar dan pestle 3.1.2 Microtube
3.1.3 Mikropipet 3.1.4 Tip
3.1.5 Vortex
3.1.6 Microcentrifuge 3.1.7 Waterbath 3.1.8 Timbangan 3.1.9 Nanodrop 3.2 Bahan
3.2.1 Sampel daun tanaman Syzygium myrtifolium 3.2.2 Wizard Genomic DNA Purification KIT (Promega) 3.2.3 Isopropanol
3.2.4 Etanol 70%
3.3 Cara Kerja
3.3.1 Sebanyak 40 mg sampel daun dihaluskan menggunakan mortar pestle.
3.3.2 Nuclei Lysis Solution sebanyak 600 µL ditambahkan dan diinkubasi pada suhu 65oC selama 15 menit.
3.3.3 RNase Solution sebanyak 3 µL ditambahkan dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit. Sampel didinginkan pada suhu kamar selama 5 menit.
3.3.4 Protein precipitation Solution sebanyak 200 µL ditambahkan dan divortex selama 20 detik.
3.3.5 Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 13000-16000 rpm selama 3 menit.
3.3.6 Supernatan dipindahkan ke tabung baru yang berisi 600 µL isopropanol suhu ruang.
3.3.7 Larutan dicampur dengan cara membolak-balikkan tabung beberapa kali, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13000-16000 rpm selama 1 menit.
3.3.8 Supernatan dibuang dan ditambahkan 600 µL etanol 70% suhu ruang, kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000-16000 rpm selama 1 menit.
3.3.9 Etanol dibuang, kemudian keringkan pellet di udara selama 10-15 menit.
3.3.10DNA Rehydration Solution sebanyak 100 µL ditambahkan dan diinkubasi pada suhu 65oC selama 1 jam atau suhu 4ºC selama 1 malam (overnight).
3.3.11Konsentrasi dan kemurnian DNA diukur menggunakan Nanodrop.
IV. HASIL PENGAMATAN
No. Tahapan Gambar Dokumentasi Gambar Referensi Keterangan 1 Penimbangan
sampel daun
(Dok. Pribadi, 2023)
(Sanchez, 2023)
Sampel daun ditimbang
sebanyak 0,4 gram meng-
gunakan timbangan analitik.
2 Penggerusan sampel daun dan
penambahan Nuclei Lysis Solution
(Dok. Pribadi, 2023)
(Lopez et al., 2013)
(Chen & Zhang, 2016)
Sampel daun yang telah ditimbang, kemudian digerus hingga hingga halus
menggunakan mortar dan pestle, kemudian
ditambahkan Nuclei Lysis Solution secara bertahap sebanyak 600 µL sampai daun benar-benar halus dan cair.
3 Inkubasi sampel
Sampel yang sudah halus kemudian dipindahkan ke
(Dok. Pribadi, 2023)
(Chen & Zhang, 2016)
(Nick FD, 2017)
dalam mikrotube dan diinkubasi di dalam waterbath dengan suhu 65oC selama 15 menit.
4 Penambahan Protein Precipitation Solution
(Dok. Pribadi, 2023)
(Rana et al., 2019)
(Nick FD, 2017)
Sampel yang telah di-inkubasi kemudian ditambahkan larutan Protein Precipitation Solution sebanyak 200 µL. Setelah itu dihomogen-kan menggunakan vortex selama 20 detik dan
disentrifugasi dengan kecepatan 13.000-16000 rpm selama 3 menit.
5 Pemisahan supernatan dan pellet
(Dok. Pribadi, 2023)
(Santos et al., 2014)
Larutan sampel yang sudah disentrifugasi akan terbentuk menjadi supernatan (fasa atas) dan pellet (fasa bawah).
Selanjutnya supernatan dipindahkan ke mikrotube baru.
6 Penambahan isopropanol
(Santos et al., 2014)
(Nick FD, 2017)
Supernatan ditambahkan 600 µL isopropanol suhu ruang, kemudian homogenkan larutan dengan membolak-balikan mikrotube.
Selanjutnya larutan disentrifugasi dengan kecepatan 13000-16000 selama 1 menit.
(Dok. Pribadi, 2023) 7 Penambahan
etanol 70%
(Khumar, 2022)
(Nick FD, 2017)
Setelah disentrifugasi, supernatan
dibuang dan pellet ditambahkan etanol 70%
sebanyak 600 µL.
Setelah itu larutan disentrifugasi dengan kecepatan 13000-16000 rpm selama 1 menit.
(Dok. Pribadi, 2023) 8 Pengeringan
pellet dan penyimpanan
(Dok. Pribadi, 2023)
(Anerao et al., 2016)
Setelah disentrifugasi, supernatan (etanol) dibuang dengan
menyisakan pellet (endapan DNA) didasar mikrotube.
Selanjutnya pellet dikering-anginkan di udara selama 15 menit. Setelah kering, pellet ditambahkan larutan DNA Rehydration Solution dan diinkubasi pada suhu 4oC selama 1 malam.
9 Pengukuran konsentrasi DNA
(Dok. Pribadi, 2023)
Konsentrasi DNA diukur
menggunakan Nanodrop.
Hasil:
Hasil nanodrop menunjukkan kemurnian DNA sebesar 1,18. Hasil tersebut
mengindikasikan
(Antar et al., 2019)
adanya kontaminasi senyawa lain, karena kemurnian ideal pada DNA yaitu 1,8-2,0.
Selain itu, pemilihan daun yang terlalu muda juga dapat
mempengaruhi hasil yang diperoleh.
V. PEMBAHASAN
Praktikum Genetika Rekombinan Acara III yang berjudul “Isolasi DNA”
dilakukan di Laboratorium Biologi Dasar, Departemen Biologi Fakultas Sains dan Matematika Universitas Diponegoro pada Jumat, 15 September 2023. Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa mampu mengetahui prinsip-prinsip isolasi DNA, mengetahui metode isolasi DNA secara sederhana, dan menjelaskan hasil isolasi DNA. Alat yang dibutuhkan, yaitu mortar dan pestle, microtube, mikropipet, tip, vortex, microcentrifuge, waterbath, timbangan, dan nanodrop. Bahan yang digunakan, yaitu sampel daun tanaman Syzygium myrtifolium, Wizard Genomic DNA Purification KIT (Promega), isopropanol, etanol 70%. Cara kerja pada praktikum ini yaitu sebanyak 40 mg sampel daun dihaluskan menggunakan mortar pestle. Nuclei Lysis Solution sebanyak 600 µL ditambahkan dan diinkubasi pada suhu 65ºC selama 15 menit. RNase Solution sebanyak 3 µL ditambahkan dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit. Sampel didinginkan pada suhu kamar selama 5 menit. Protein precipitation Solution sebanyak 200 µL ditambahkan dan divortex selama 20 detik.
Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 13000-16000 rpm selama 3 menit.
Supernatan dipindahkan ke tabung baru yang berisi 600 µL isopropanol suhu ruang.
Larutan dicampur dengan cara membolak-balikkan tabung beberapa kali, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13000-16000 rpm selama 1 menit. Supernatan dibuang dan ditambahkan 600 µL etanol 70% suhu ruang, kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000-16000 rpm selama 1 menit. Etanol dibuang, kemudian keringkan pellet di udara selama 10-15 menit. DNA Rehydration Solution sebanyak 100 µL ditambahkan dan diinkubasi pada suhu 65ºC selama 1 jam atau suhu 4ºC selama 1 malam (overnight). Konsentrasi dan kemurnian DNA diukur menggunakan Nanodrop.
Isolasi DNA merupakan suatu teknik molekuler yang dilakukan untuk mengambil dan memisahkan molekul DNA suatu organisme dari komponen sel yang lainnya. Wizard Genomic Kit merupakan alat yang dimanfaatkan dalam pengambilan DNA dari berbagai macam organisme, seperti bakteri, hewan, dan tumbuhan. isolasi DNA menggunakan Wizard Genomic Kit dilakukan dengan beberapa tahapan, yaitu persiapan sampel, pelisisan sel, pemisahan protein, pemisahan DNA, pencucian DNA, dan pelarutan DNA. Hal ini sesuai dengan pernyataan Murtiyaningsih (2017) bahwa prinsip isolasi DNA adalah mendapatkan DNA murni yang tidak tercampur dengan komponen sel lainnya seperti protein dan karbohidrat. Isolasi DNA genom dapat dilakukan dengan metode lisis sel secara fisik dan kimia.
Isolasi DNA adalah proses homogenasi untuk mengeluarkan DNA dari tempat asalnya proses ini dilakukan dengan menambahkan buffer ektraksi atau lisis yang bertujuan untuk menjaga DNA dari kerusakan. Hariyadi et al., (2018) menyatakan bahwa isolasi DNA merupakan teknik dasar dari biotekenologi dan biomolekuler yang bertujuan untuk memisahkan DNA dari partikel lain seperti protein, lipid, polisakarida, dan zatlain. Metode isolasi DNA yang digunakan saat praktikum adalah metode Wizard Genomic Kit. Menurut pernyataan Fadllan et al., (2019) Prinsip kerja dari reagen kit adalah penghancuran sel menggunakan senyawa kimia dan digunakan pada metode alcohol based.
Alat yang digunakan pada praktikum ini, yaitu mortar dan pestle, microtube, mikropipet dan tip, vortex, microcentrifuge, dan waterbath. Bahan yang digunakan adalah sampel daun tanaman belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L.), Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega), isopropanol, dan etanol 70%. Hal ini sesuai dengan pernyataan Seprianto, et al. (2022) bahwa alat-alat laboratorium yang umumnya digunakan untuk isolasi DNA sampai ketahapan visualisasi DNA.
Diantaranya ada mikropipet, mikrosentrifuge, vortex mixer, mini spindown, waterbath, elektroforesis chamber, UVgeldoc, dan LAF. Bahan yang dibutuhkan, yaitu Kit ekstraksi, Nitrogen cair, Isopropanol dan 70% ethanol.
Pada proses lisis fisik, perbedaan dalam konsentrasi DNA yang dihasilkan dari setiap sampel dapat dipengaruhi oleh perlakuan fisik yang diterapkan dan kemampuan buffer ekstraksi untuk mengurai sel. Proses fisik yang efisien dalam menghancurkan sel, seperti penggerusan sampel secara menyeluruh, dapat memfasilitasi kemampuan buffer ekstraksi untuk mengurai sel. Selain itu, pilihan buffer ekstraksi yang digunakan juga dapat mempengaruhi konsentrasi DNA yang akhirnya diperoleh. Hal ini sesuai dengan pernyataan Mulyani, et al. (2013) bahwa perbedaan konsentrasi DNA yang diperoleh pada masing-masing sampel dapat ditentukan oleh perlakuan fisik yang diberikan serta kemampuan buffer ekstraksi dalam memecah sel. Proses perusakan sel secara fisik dengan penggerusan sampel yang sempurna dapat mempermudah buffer ekstraksi dalam memecah sel. Disamping itu, buffer ekstraksi yang digunakan dapat menentukan konsentrasi DNA yang dihasilkan.
Proses lisis kimia pada tahap awal ekstraksi, sel dipecahkan baik secara kimiawi dengan penambahan detergen Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) maupun enzimatik dengan penambahan proteinase-K. SDS digunakan untuk melarutkan lipid yang ada di membran sel, menyebabkan membran sel menjadi tidak stabil, serta mengikat protein dan polisakarida di membran sel sehingga membran sel terbuka.
Selain berperan dalam pemecahan sel, penambahan SDS juga memiliki fungsi dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease, yang merupakan enzim yang dapat mengurai DNA. Di sisi lain, enzim proteinase-K berfungsi untuk memutuskan ikatan peptida yang menghubungkan asam amino dalam lapisan peptidoglikan dinding sel. Seluruh proses lisis sel ini dilakukan dalam larutan salt Tris EDTA (STE). Tris berfungsi
sebagai buffer yang menjaga agar DNA tidak mengalami kerusakan dengan mempertahankan pH pada kondisi normal, yaitu pH 8. Sedangkan EDTA berfungsi sebagai agen pengkelat yang dapat mengikat ion-ion logam bermuatan positif seperti Ca2+ dan Mg2+ pada membran sel, yang menyebabkan membran sel menjadi mudah terurai. Hal ini sesuai dengan pernyataan Hutami, et al. (2018) yang menyatakan bahwa proses lisis sel dilakukan secara kimiawi dengan penambahan detergen Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) dan enzimatik dengan penambahan proteinase-K pada tahap awal ekstraksi. Penambahan SDS berfungsi untuk melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel serta mengikat protein dan polisakarida pada membran sel sehingga membran sel terbuka. Selain berperan dalam pemecahan sel, penambahan SDS juga berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA. Sementara itu enzim proteinase-K berfungsi untuk memutus gugus karboksil asam amino pada ikatan peptida yang menyusun lapisan peptidoglikan dinding sel. Proses lisis dilakukan dalam larutan salt Tris EDTA (STE). Tris berfungsi sebagai buffer yang mencegah kerusakan DNA dengan mempertahankan pH dalam keadaan normal, yakni pada pH 8. Sementara EDTA berfungsi agen pengkelat yang dapat mengikat ion-ion logam bermuatan positif seperti Ca2+ dan Mg2+ pada membran sel yang menyebabkan membran sel mudah terurai.
Proses menghilangkan kontaminan RNA dilakukan dengan menambahkan RNAse ke dalam campuran. Kemudian, biarkan campuran ini tetap pada suhu 37 ºC.
Setelah itu, tambahkan buffer BG untuk mencampurkan semua bahan, dan biarkan campuran ini tetap pada suhu 65 ºC. Terakhir, tambahkan 200 μL etanol absolut ke dalam campuran ini. Hal ini sesuai dengan pernyataan Martha (2023) bahwa untuk proses menghilangkan RNA, ditambahkan RNAse sebanyak 20 μL kemudian
diinkubasi pada suhu 37ºC selama 5 menit. Ditambahkan buffer BG sebanyak 440 μL untuk proses homogenisasi lalu diinkubasi kembali pada suhu 65 ºC selama 10 menit selanjutnya ditambahkan etanol absolut sebanyak 200 μL.
Proses menghilangkan kontaminan protein adalah dengan menambahkan Protein-K ke setiap sampel, kemudian campuran diaduk perlahan dan diinkubasi.
Penambahan Protein-K ini dilakukan untuk mengurangi jumlah protein yang berasal dari tanaman, dan tahap ini dilakukan setelah proses inkubasi dengan RNase A. Jika masih terdapat kontaminasi protein yang tersisa, kita akan menggunakan enzim pengurai protein (proteinase) untuk menghilangkannya. Hal ini sesuai dengan pernyataan Sari, et al. (2014) bahwa perlakuan selanjutnya untuk mengatasi kontaminasi protein, masing-masing sampel kemudian ditambahkan 20 µl Protein-K tube diinvert lalu diinkubasi 60°C selama 10 menit. Penambahan Protein-K bertujuan untuk mereduksi metabolit tanaman berupa protein, perlakuan ini dilakukan pada tahap lisis setelah proses inkubasi RNase A. Dengan modifikasi bertahap, bila masih ditemukan kontaminasi protein maka ditambahkan enzim degradasi protein (proteinase) untuk menghilangkannya.
Proses menghilangkan kontaminan polisakarida dilakukan pada tahap presipitasi dengan menambahkan garam dengan konsentrasi tinggi seperti NaCl atau natrium asetat ke dalam campuran. Hal ini bertujuan untuk membantu menghilangkan senyawa polisakarida dengan cara meningkatkan kelarutan senyawa polisakarida dalam etanol, sehingga senyawa tersebut tidak ikut mengendap bersama DNA. Selain itu, selama proses isolasi DNA, kita melakukan pencucian berulang dengan menggunakan buffer ekstraksi untuk menghilangkan senyawa polisakarida. Tahap penghilangan senyawa polisakarida ini sangat penting, karena senyawa polisakarida seringkali mengendap bersama dengan DNA, yang dapat membuat larutan DNA
menjadi lebih tebal dan lengket. Keberadaan senyawa polisakarida juga dapat menghambat aktivitas enzim restriksi dan Taq Polymerase. Selain itu, penambahan senyawa PVP dalam metode ini memiliki tujuan untuk mengurangi oksidasi senyawa fenolik. PVP akan membentuk kompleks dengan senyawa fenolik melalui ikatan hidrogen dan kemudian terendap bersama dengan sisa-sisa sel, sehingga menghambat interaksi antara polifenol dan DNA. Hal ini sesuai dengan pernyataan Nugroho, et al.
(2015) bahwa saat tahap presipitasi, garam konsentrasi tinggi seperti NaCl atau natrium asetat seringkali ditambahkan ke dalam campuran untuk membantu mengeliminasi senyawa polisakarida dengan cara meningkatkan kelarutan senyawa polisakarida di dalam etanol sehingga senyawa tersebut tidak ikut mengendap bersama DNA. Dalam proses isolasi DNA juga dilakukan pencucian menggunakan buffer ekstraksi berulang untuk mengeliminasi senyawa polisakarida. Proses eliminasi senyawa polisakarida merupakan tahapan yang penting. Polisakarida seringkali mengendap bersama dengan DNA, menyebabkan tekstur larutan DNA menjadi kental dan lengket. Kehadiran senyawa polisakarida dapat menghambat aktivitas enzim restriksi dan Taq Polymerase. Penambahan senyawa PVP pada metode ini berfungsi untuk mengurangi oksidasi senyawa fenolik. PVP akan membentuk senyawa kompleks melalui ikatan hidrogen dengan senyawa fenolik dan terendap bersama debris sel sehingga mencegah terjadinya interaksi antara polifenol dengan DNA.
Proses menghilangkan kontaminan metabolit sekunder dari jaringan tanaman yang memiliki komposisi senyawa metabolit beragam, diperlukan penyesuaian pada komposisi buffer ekstraksi. Untuk menghindari aktivitas senyawa polifenol yang seringkali mengakibatkan perubahan warna larutan menjadi coklat, kita perlu menambahkan senyawa antioksidan seperti PVP, natrium disulfit, dan asam askorbat.
Hal ini sesuai dengan pernyataan Nugroho, et al. (2019) bahwa setiap jaringan
tanaman memiliki kandungan senyawa metabolit yang berbeda-beda sehingga modifikasi pada buffer ekstraksi perlu dilakukan. Penambahan senyawa antioksidan seperti PVP, natrium disulfit, dan asam askorbat perlu dilakukan untuk meminimalisasi aktivitas senyawa polifenol yang seringkali membuat warna larutan menjadi kecoklatan.
Proses purifikasi ekstraksi, atau pemurnian DNA bisa dilakukan dengan bantuan kit yang diproduksi secara pabrik, yang memudahkan proses ini. Tahap pemurnian DNA melibatkan penambahan fenol dan kloroform untuk mengikat makromolekul selain DNA, seperti protein, lipid, dan karbohidrat. Setelah dilakukan sentrifugasi, DNA dan air akan terpisah dari bahan organik lainnya pada tahap ini.
Hal ini sesuai dengan pernyataan Maryam, et al. (2022) bahwa proses ekstrasi atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan kit yang diproduksi pabrik dengan cara yang lebih simpel. Tahap purifikasi atau pemurnian DNA dari makromolekuler sel dengan cara menambahkan fenol dan kloroform untuk mengikat makromolekuler selain DNA seperti protein, lipid, dam karbohidrat. Dimana pada tahap ini DNA dan air akan terpisah dari bahan organik lainnya setelah di sentrifugasi.
Pada proses dehidrasi DNA, isopropanol dan etanol ditambahkan untuk menghilangkan air dari DNA, yang menyebabkan DNA mengendap. Presipitasi adalah proses yang digunakan untuk mengendapkan satu komponen dari campuran.
Hal ini sesuai dengan pernyataan Emilia, et al. (2021) bahwa pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi.
Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran.
Proses rehidrasi DNA bertujuan untuk melarutkan atau mengembalikan DNA ke bentuk cairannya, karena DNA awalnya berada dalam bentuk sedimen. Rehidrasi
dilakukan dengan menambahkan larutan Elution buffer yang sudah dipanaskan sebelumnya, yang dapat mengembalikan DNA ke bentuk larutan. Setelah proses rehidrasi selesai, kita akan mendapatkan produk DNA yang telah terlarut kembali. Hal ini sesuai dengan pernyataan Hidayat (2018) bahwa proses rehidrasi DNA yang bertujuan untuk mencairkan atau melepaskan DNA, karena produk DNA dalam bentuk sedimen. Rehidrasi dilakukan dengan menambahkan larutan pre-heated Elution buffer yang dapat melarutkan DNA. Setelah proses rehidrasi selesai maka dihasilkan produk DNA.
Penyimpanan isolat DNA dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu menggunakan freezer dengan suhu -20°C, silica gel, dan buffer ekstraksi. Ketiganya adalah metode yang paling umum digunakan karena kemampuannya dalam mengawetkan daun dalam jangka waktu yang lama. Freezer biasanya digunakan untuk menyimpan bahan kimia dan DNA. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa metode penyimpanan sampel dengan freezer suhu -20°C adalah yang paling efektif, karena menghasilkan jumlah smear yang lebih sedikit dibandingkan dengan metode penyimpanan lainnya. Hal ini sesuai dengan pernyataan Delvi (2018) bahwa penyimpanan sampel menggunakan freezer -20°C, silica gel, dan buffer ekstraksi merupakan metode-metode yang paling banyak digunakan karena metode-metode tersebut dapat mengawetkan daun dalam waktu yang lama. Freezer biasanya digunakan untuk menyimpan bahan-bahan kimia dan DNA. Penelitian ini menunjukkan bahwa metode penyimpanan sampel menggunakan freezer -20° C adalah metode penyimpanan sampel terbaik, karena menghasilkan smear yang lebih sedikit dibandingkan sampel-sampel perlakuan lain.
VI. KESIMPULAN
6.1 Prinsip-prinsip isolasi DNA terdiri dari pelisisan sel yaitu penghancuran membran dan dinding sel, ekstraksi DNA untuk memisahkan DNA dari kontaminan, dan presipitasi DNA untuk mengisolasi DNA dari larutan yang digunakan selama ekstraksi.
6.2 Metode isolasi DNA secara sederhana menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit, yaitu dengan mempersiapkan sampel yang sudah dihaluskan, diinkubasi, dan disentrifugasi, lalu supernatant dicampurkan dengan isopropanol, supernatant dibuang dan ditambahkan etanol 70%, sentrifugasi, pellet dikeringkan dan ditambahkan DNA Rehydration Solution atau buffer TE.
6.3 Hasil isolasi DNA berupa adanya 3 endapan. Endapan paling atas nmerupakan supernatan dan DNA yang dicirikan dengan warna putih. Bagian ini adalah bagian utama dari isolasi. Kemudian ditemukan pula endapan kontaminan berupa lemak dan pellet/debris berupa polisakarida dan protein berwarna hijau pekat.
DAFTAR PUSTAKA
Ariyanti Y., dan Sister S. 2019. Ekstraksi DNA Total Dari Sumber Jaringan Hewan (Ikan Kerapu) Menggunakan Metode Kit for Animal Tissue. Journal Of Science And Applicative Technology. Vol. 3 (1) : 40-45.
Dairawan, M., Preetha, J.S. 2020.The evolution of DNA extraction methods. America Journal of Biomedical Science and Research. 39-46.
Delvi, I. A. 2018. Optimasi Isolasi DNA Karet (Hevea brasiliensis Muell Arg.) Klon PB 260 dengan Beberapa Metode Penyimpanan Sampel. Skripsi. Universitas Andalas.
Emilia, Harnelly, E., & Anhar, A. 2021. Optimalisasi Metode Ekstraksi DNA Daun, Kulit Kayu dan Kayu Pinus merkusii Jungh. Et de Vriese. Jurnal Ilmiah Mahasiswa Pertanian, 6 (4): 766-778.
Hariyadi, S., Narulita, E. & Rais, M. A. 2018. Perbandingan Metode Lisis Jaringan Hewan dalam Proses Isolasi DNA Genom pada Organ Liver Tikus Putih (Rattus norbegicus). Proceeding Biology Education Conference, 15 (1): 690-692.
Hidayat, M. 2018. Isolasi dan Karakterisasi Molekuler Mikroba Endofit Tanaman Pangan (Centella asiatica L.) sebagai Penghasil Antimikroba. Skripsi. Universitas Hasanuddin, Makassar.
Hutami, R., Bisyri, H., Sukarno, Nuraini, H., & Ranasasmita, R. 2018. Ekstraksi DNA dari Daging Segar untuk Analisis dengan Metode Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP). Jurnal Agroindustri Halal, 4 (2): 209-216.
Iqbal, M., Buwono, I. D., Dan Kurniawati, N. 2016. Analisis Perbandingan Metode Isolasi DNA Untuk Deteksi White Spot Syndrome Virus (WSSV) Pada Udang Vaname (Litopenaeus Vannamei). Jurnal Perikanan Kelautan, 7(1).
Kamaliah, K. 2017. Perbandingan Metode Ekstraksi DNA Phenol-Chloroform Dan Kit Extraction Pada Sapi Aceh Dan Sapi Madura. Biotik: Jurnal Ilmiah Biologi Teknologi Dan Kependidikan, 5(1), 60-65.
Kumalasari, R. D., Risandiansyah, R., dan Fadli, Z. 2020. Perbandingan Metode Isolasi DNA Filter Based Kit Dengan Heat Treatment Berdasarkan Limit Of Detection Dan Quantification Pada Staphylococcus Aureus. Jurnal Kedokteran Komunitas, 8(2).
Martha, D. P. 2023. Identifikasi Fenotip dan Genotip 16s rRNA Bakteri Pendegradasi Plastik dengan Perbedaan Metode Isolasi DNA. Skripsi. Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang.
Maryam, S., Nuryanti, S., & Rahbuddin, K. E. 2022. Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik serta Isolasi DNA Isolat Fungi Endofit Daun Ekor Naga (Rhaphidophora pinnata L.F Schott). As-Syifaa Jurnal Farmasi, 14 (2): 139- 147.
Morihito R.V.S.A., Stephanie E.C., Timboeleng A. N., M. Iqbal P., Roy A.M., Benny M.
2017. Identifikasi Perubahan Struktur DNA Terhadap Pembentukan Sel Kanker Menggunakan Dekomposisi Graf. Jurnal Ilmiah Sains. Vol. 17 (2) : 153- 160.
Murtiyaningsih, H. 2017. Isolasi DNA Genom dan Identifikasi Kekerabatan Genetik Nanas Menggunakan RAPD (Random Amplified Polimorfic DNA). Agritrop: Jurnal Ilmu-Ilmu Pertanian (Journal Of Agricultural Science), 15 (1).
Nugroho, K., Terryana, R. T., & Lestari, P. 2015. Optimasi Metode Isolasi DNA pada Jatropha spp. Jurnal Agroteknologi, 5 (2): 15-22.
Nugroho, K., Terryana, R. T., Reflinur, & Lestari, P. 2019. Metode Ekstraksi DNA Tanaman Tanpa Presipitasi Etanol untuk Kegiatan Polymerase Chain Reaction (PCR).
Jurnal Bioteknologi & Biosains Indonesia, 6 (1): 29-38.
Nur’aini S., Mukaromah A.S., Siti M. 2019. Pengenalan Deoxyribonucleic Acid (DNA) Dengan Marker-Based Augmented Reality. WJIT: Walisongo Journal Of Information Technology. Vol.1 (2) : 91-100.
Octavia, D., Mukaromah, A. S., Martiansyah, I., Mimin, M., Ma'mun, S., Dan Rukmanto, H.
(2021, November). Isolasi DNA Tumbuhan Hasil Eksplorasi Di Nusakambangan Dengan Metode Kit Di Laboratorium Treub, Kebun Raya Bogor. In Prosiding Seminar Nasional Biologi (Vol. 7, No. 1, Pp. 291-299).
Pangesti, N. I. O., Fatiqin, A., Dan Erika, P. 2020. Perbandingan Antara Kualitas DNA Daun Menggunakan Metode KIT (Promega) Dan Metode Manual. In Prosiding Seminar Nasional Sains Dan Teknologi Terapan (Vol. 3, No. 1, Pp. 411-415).
Perwitasari, D. A., Faridah, I. N., Ratnasari, Y. A., Agustina, K., Utami, I. N., Dan Maliza, R.
2020. Uji Banding Metode Isolasi DNA Sampel FTA Card Menggunakan Kit Wizard®
Genomic DNA Purification, Purelink® Genomic DNA, Dan Chelex-100. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 18(2), 241-245.
Retnaningati D. 2020. Optimasi Metode Ekstraksi DNA Pada Melon (Cucumis Melo L.) Berdasarkan Suhu, Lama Inkubasi, Dan Kondisi Daun. Biota: Jurnal Ilmiah Ilmu-Ilmu Hayati., Vol. 5 (2): 109-114.
Seprianto, Saraswati, H., Wahyuni, F. D., Novianti, T., Nora, A., Naroeni, A., & Handayani, P. 2022. Workshop Isolasi DNA dan Pengenalan Alat Laboratorium Bioteknologi Bagi Guru Biologi SMA/MA Se Jakarta. Jurnal Pengabdian Kepada Masyarakat, 2 (3): 4503-4514.
Syahputra, A., Mutaqin, K. H., & Damayanti, T. A. 2016. Komparasi Metode Isolasi DNA Patogen Antraknosa dan Bulai untuk Deteksi PCR. Jurnal Fitopatologi Indonesia, 12 (4): 124-132.
Utami, A., Meryalita, R., Prihatin, N. A., Ambarsari, L., Asri, P., Dan Kurniatin, W. N. 2012.
Variation Methods Of DNA Isolation From Leaf Of Temulawak (Curcuma Xanthorrhiza Roxb.). In Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa.
HALAMAN PENGESAHAN
Semarang, 15 September 2023
Mengetahui,
Asisten Praktikan,
Lantika Intania Atha Wahyuning Utami
NIM. NIM 24020121140140
LAMPIRAN 1. Jurnal Internasional
2. Jurnal Nasional
