LAPORAN RESMI PRAKTIKUM TEKNOLOGI DNA
KLONING DNA
Oleh
NAMA : ANGELIA ASTRIA
NIM : 31160048
PROGRAM STUDI BIOLOGI
FAKULTAS BIOTEKNOLOGI
UNIVERSITAS KRISTEN DUTA WACANA
BAB I
PENDAHULUAN
A.Latar Belakang
Kloning merupakan proses pembuatan salianan dari suatu gen dengan prinsip teknologi DNA rekombinan. Molekul DNA rekombinan dibuat dengan menyisipkan fragmen DNA yang mengandung gen target ke dalam vektor. Vektor berperan sebagai pembawa gen yang akan dikloning ke dalam sel inang. Vektor rekombinan yang ditransformasi ke dalam sel inang ikut membelah setiap sel inang melakukan pembelahan sehingga koloni sel inang yang membanwa vektor dengan gen target akan menghasilkan salianan gen target yang banyak (Brown (1991).
Komonen-komponen kloning adalah sebagai berikut : 1. Sampel DNA
Sampel DNA yang digunakan untuk dikloning dapat berupa DNA genom atau DNA komplementer yang merupakan DNA komplemen dari mRNA ( Snustad dan Simmons, 2012). Sampel DNA dapat juga berasal dari hasil isolasi DNA yang dimanipulasi lebih lanjut dnegan prosedur subkloning, produk PCR atau oligonukleotida yang disintetis secara kimiawi (Twyman, 1998 : 325)
2. Vektor
Vektor adalah molekul DNA yang dapat mmbawa DNA asing ke dalam sel inang dan bereplikasi ke dalam sel inang (Campbell dkk, 2002 : 392). Mlekul DNA yang berperan sebagai vektor harus memiliki beberapa syarat seperti memiliki penanda awal replikasi/ origion of replication(ORI), gen penanda seleksi (umumnya berupa gen resisten pada antibiotik) dan situs pengenalan restriksi yang unik (multiple cloning sites/ MCS).Salah satu vektor yang sering digunakan adalah plasmid, plasmid merupakan molekul DNA yang berbentuk lingkaran (sirkular) beruntai ganda diluar kromosom yang dapat melakukan replikasi sendiri dalam bakteri ( Snustad dan Simmons, 2012).
3. Enzim restriksi
potongan blunt end. Potongan blunt end dihasilkan jika enzim memotong DNA tepat pada bagian tengah situs pengenalannya. Beberapa enzim memotong untai DNA pada posisi yang berbeda dan menghasilkan potongan kohesif yang disebut sticky end contoh enzim EcoRI (Brown (1991).
4. Ligasi
Ligasi adalah suatu proses penggabungan fragmen DNA yang saling berlinear dengan menggunakan ikatan kovalen. Proses ligasi dikatalis oleh enzim ligase dengan bantuan ATP. Enzim ligase merupakan enzim yang mengkatalis reaksi
pembentukan kembali ikatan fosfodiester antar potongan fragmen DNA. Contoh enzim ligase adalah T4 ligase. Enzim ligase digunakan dalam teknik rekayasa genetik karena mampu menyambungkan fragmen DNA ujung rata (blunt end) dan ujng kohesif (sticky end)(Sambrook dan Russell, 2001). 5. Sel inang
Sel inang dipilih berdasarkan tujuan kloning dan asal gen yang dikloning. Karakteristik sel inang yang baik antara lain memilikii laju pertumbuhan cepat, tumbuh dalam jumlah yang banyak, nonpatogenik, genom telah dipetakan,dapat menerima vektor, dapat menjaga stabilitas gen asing dan dapat mengekspresikan gen asing (Tamarin, 2001).
Tahapan proses kloning adalah sebagai berikut : 1. Isolasi DNA
2. PCR adalah teknik amplifikasi sekuen DNA spesifik secara in vitro dengan proses pemanjangan primer untai DNA komplementer (Tamarin, 2001)
3. Restriksi dan ligasi 4. Pembuatan sel kompeten
5. Transformasi adalah intoduksi DNA vektor palsmid yang mengandung gen sisipan kedalam sel inang bakteri (Tamarin, 2001)
6. Blue and white screening
Metode identifikasi DNA rekombinan adalah dengan α-klomplementasi. Α -klomplementasi adalah terbentuknya suatau enzim β-Galaktosidase fungsional karena kehadiran dua gen dari sumber yang berbeda yaitu α-segmen (dari plasmid) dan ω-segmen (dari kromosom sel kompeten) (Brock et al, 2015).
B.Tujuan
BAB II
1. Sampel bakteri Escherichia coli
16.Luria Bertani Broth (LBB) 17.Ampicillin
18.RNAse
19.DNAse RNAse freedistilled water
20.PCR mix
21.Gel agarosa
22.primer forward lacZ 456 bp
23.reverse lacZ 456 bp
24.TBE
25.Red safe
26.Loading dye
C.Cara kerja
1. Ekstrasi DNA kromosom
Disiapkan eppendorf 1,5 mL dan sampel bakteri yang ditumbuhkan pada medium LBB
Disentifugasi 6.500 rpm selama 3 menit kemudian dibuang supernatan.
Ditambahkan 500 µl rinse buffer pada pellet dan dilakukan mixing
Disentifugasi 6.500 rpm selama 1 menit
Dibuang supernatan dan Ditambahkan 500 µl rinse buffer pada pellet dan dilakukan mixing dengan baik
Ditambahkan digestion buffer dan dihomogenkan dengan vortex
Diinkubasi dalam waterbath pada suhu 55 °C selama 60 menit dan mixing setiap 10 menit.
Secara hati-hati ditambahkan 500 µl fenol pada ruang asam.
Digojog selama 20 menit dan disentrifugasi 13.000 rpm, 4 °C selama 5 menit
Fase bagian atas (lendir) yang mengandung DNA dipindahkan ke eppendorf baru
Ditambahkan 500 µl chloroform iso-Amyl Alcohol
Digojog hingga homogen dan disentrifugasi 13.000 rpm, 4 °C selama 5 menit
Fase bagian atas (300-500 µl) dipindahkan ke eppendorf baru
Ditambahkan etanol absolut 2 × volume (600-1000 µl) dan disentrifugasi 13.000 rpm, 4 °C selama 15 menit
2. DNA plasmid
3. Elektroforesis DNA dan plasmid
4. Amplifikasi DNA dan plasmid dengan metode PCR
5. Elektroforesis DNA dan plasmid
Tube PCR diisi dengan DNAse RNAse freedistilled water sebanyak 7 µl
Ditambahkan 10 µl PCR mix
Ditambahkan primer forward (1 µl) dan reverse (1 µl) lacZ 456 bp Sampel DNA dan plasmid di mix dengan DNA loading dye 2-3 µl untuk satu
sampel pada parafilm
DNA dan plasmid dimigrasikan untuk meihat kualitasnya pada elektroforesis DNA dikeringkan dengan cara membalik eppendorf, kemudian DNA dilarutkan
dengan menambahkan 100 µl ddH2O
Ditambahkan 2-3 µl R°C NAse dan disimpan pada suhu ruang semalaman, kemudian disimpan pada suhu -20°C(sampai saat digunakan)
Digunakan plasmid dalam bentuk DNA dengan merek dagang Thermo Scientific
DNA dan plasmid dimigrasikan untuk meihat kualitasnya pada elektroforesis
Pembuatan gel agarosa: 0,8 % agarosa = 0,28 gr (35 mL), TBE : Steril water = 1 : (500 mL) dan Red safe 5 µl untuk 100 mL
Ditambahkan 1 µl DNA/plasmid
Dimasukkan ke dalam sumuran agarosa dan di running Elektroforesis ± 1 jam, 80V, kemudian diamati pada imager.
6. Restriksi dan ligasi
Restriksi :
Ligasi :
Pembuatan sel kompeten :
Pembuatan gel agarosa : 0,8 % agarosa `0,28 gr (35 mL), TBE : Steril water = 1 : (500 mL) dan Red safe 5 µl untuk 100 mL
Mix sampel: Loading dye 2-3 µl dan DNA atau plasmid 5 µl
Dimasukkan ke dalam sumuran gel agarosa
Ditambahkan marker 1 kb dan kontrol Escherichia coli
Running elektroforesis ±1 jam dan setelah itu diamati.
DNA kromosom( Escherichia coli ATCC 25922) dan plasmid pUC19 direstriksi pada tube. Dengan komposisi :DNA kromosom/plasmid 5,3 µl, Enzim BamHI 0,5 µl, Enzim EcoRI 0,5 µl, Buffer 1,0 µl dan dH2O 2,5 µl sehinggal total 15 µl.
Diinkubasi pada 37 °C selama 1 jam.
Komposisi :DNA insert 5 µl, DNA vektor µl 1, Enzim T4 Ligase 0,5 µl, Buffer T4 Ligase 0,5 µl dan dH2O 11 µl sehinggal total 18 µl.
Diinkubasi pada 16-18 °C selama semalaman.
1 ose E.coliDH5α dikulturkan ke dalam 5 mL Luria Bertani Broth (LBH)
Dinkubasi pada suhu 37 °C semalam.
Diambil 0,4-1 mL kultur stok dari 5 mL LBB dan ditambahkan pada 5 mL LBB baru.
Diinkubasi pada suhu 37 °C selama ±3jam dalam shaker
7. Transformasi
Pellet+1,5 mL MR(0,75 mL) / MRC (0,75mL) buffer disentrifugasi 12.000 rpm selama 8 detik dan supernatan dibuang.
Pellet+ 1,5 mL MRC diinkubasi pada es selama 30 menit.
Diambil 150 µl sel kompeten dan disentrifugasi 12.000 rpm selama 8 detik, kemudian supernatan dibuang dan pellet diresuspensi dengan 100 µl MRC.
Suspensi sel pada 2 tabung dijadikan dalam satu tabung (stok)
18 µl plasmid rekombinan (hasil ligasi) + 50 µl sel kompeten pada tabung baru diinkbasi pada es selama 30 menit
Dilakukan hect shock dengan pemanasan 42 °C selama 90 detik, diinkubasi pada es selama 2 menit.
Ditambah 600 µl medium LBB dan diinkubasi pada 37 °C selama 45 menit, disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 detik.
100 µl diinokulasi pada media LBA 1 yang mengandung ampicillin dan LBA2 yang mengandung ampicillin, IPTG dan X-Gal.
BAB III
Tabel 1. Hasil transformasi
Keterangan :
Isolasi DNA kromosom dilakukan untuk mendapatkan DNA murni yang akan digunakan sebagai insert, insert yang digunakan adalah DNA dari bakteri Escherichia coli ATCC 25922. Sebagai kontrol negatif digunakan bakteri Salmonella Typhi NCTC 786, sedangkan untuk vektor digunakan plasmid pUC19 dalam bentuk DNA sehingga tidak membutuhkan isolasi plasmid. Berdasarkan gambar 1 (Hasil isolasi DNA kromosom) diketahui bahwa proses isolasi sudah berhasil dengan baik walaupun pada hasil isolasi DNA bakteri Salmonella Typhi NCTC 786 masih banyak terdapat smear, adanya DNA kromosom yang diinginkan ditandai dengan tebalnya band DNA
yang terbentuk dengan panjang fragmen DNA Escherichia coli ATCC 25922 dan Salmonella Typhi NCTC 786 adalah sekitar 1000 bp-2500 bp dengan marker adalah DNA ladder Vivantis.
DNA yang berhasil disolasi dan plasmid kemudian dilanjutkan dengan tahap PCR. Proses PCR ini bertujuan untuk mengamplifikasi sekuen DNA spesifik dengan proses pemanjangan primer pada untai DNA komplementer menggunakan primer LacZ 465 bp. Primer ini berfungsi untuk mengawali proses amplifikasi dan untuk membatasi
fragmen DNA target yang akan diamplifikasi secara spesifik, digunakan PCR 465 pb sebagai primer parsial untuk menandai daerah yang diamplifikasi sehingga didapatkan hasil berupa DNA yang memiliki lacZ 465 bp. Berdasarkan gambar 2 (Hasil PCR DNA kromosom dan plasmid) diketahui bahwa sampel DNA Escherichia coli ATCC25922 dan plasmid pUC19 berhasil diamplifikasi, terlihat dengan adanya fragmen DNA Escherichia coli ATCC25922 dengan ukuran sekitar 500 bp-1000 bp dan fragmen plasmid pUC19 dengan ukuran 100 bp- 500 bp. Hal ini mengindikasikan bahwa DNA yang diisolasi merupakan DNA yang memiliki lacZ 465 bp.
Setelah diketahui bahwa DNA dan plasmid yang digunakan memiliki gen lacZ 465 bp maka dilakukan proses restriksi dan ligasi untuk membuat DNA rekombinan. Proses restriksi dan ligasi bertujuan untuk memotong DNA dan plasmid kemudian menyambungkan DNA dan plasmid hingga menjadi DNA rekombinan menggunakan enzim restriksi. Pembuatan DNA rekombinan menggunakan beberapa perlakuan yaitu dengan perlakuan kromosom+BamHI+EcoRI, plasmid+BamHI+EcoRI, kromosom+BamHI, plasmid+BamHI dan uncut untuk proses restriksi dan dilanjutkan dengan proses ligasi. Digunakan enzim T4 ligase yang akan menggabungkan fragmen DNA dengan plasmid yang mempunyai ujung tidak rata(sticky end) yang saling berkomplemen dan ujung rata(blunt end).
Pembuatan sel kompeten dilakukan dengan harapan mendapatkan sel inang yang memiliki efisiensi transformasi yang tinggi. Digunakan bakteri Escherichia coli DH5α karena menurut Brown (1991)bakteri Escherichia coli DH5α dapat tumbuh dengan cepat dalam medium pengayaan.
Tahap selanjutnya adalah penyisipan DNA rekombinan dalam sel kompeten yaitu Escherichia coliDH5α (transformasi) menggunakan metode heat shock (Sambrook et al., 2001). DNA rekombinan diperlakukan dengan suhu 42°C(heat shock) selama 90 detik. Menurut Brown (1991) pemanasan menimbulkan gradien panas yang menyebabkan aliran yang mengalir ke dalam
sel yang memungkinkan DNA masuk ke dalam sel. Bakteri hasil transformasi diinokulasi pada media LBA yang diberi perlakuan yang berbeda, hasil proses transformasi dapat dilihat ada tabel 1 (Hasil transformasi).
Kontrol positif berupa sel kompeten yang ditumbuhkan ada medium LBB terdapat pertumbuhan bakteri Escherichia coli DH5α yang munjukkan bahwa sel kompeten mampu tumbuh di medium LBB dan tidak terjadi kontaminasi. Kontrol negatif berupa sel kompeten yang diinokulasi pada medium B yang mengandung LBB+ampicillin tidak terdapat pertumbuhan bakteri karena bakteri Escherichia coli DH5α tidak mempunyai gen resisten pada antibiotik ampicillin.
Hasil identifikasi yang dilakukan menunjukan bahwa proses transformasi belum berhasil, ditandai melalui seleksi DNA transforman yang membawa DNA rekombinan target tidak resisten terhadap antibiotik ampicillin dan terseleksi dengan α-komplementasi ( Wong, 1997). Menurut Brooker (2005) sel inang yang berhasil mentransformasi plasmid dapat tumbuh membentuk koloni pada medium agar dengan antibiotik, sedangkan sel yang tanpa plasmid tidak akan tumbuh karrena rentan terhadap ampicillin.
Keterangan : tidak terdapat pertumbuhan bakteri DNA rekombinan yang dipotong dengan enzim BamHI
Gambar 3. Sel kompeten dalam medium C
Gambar 4. Sel kompeten dalam medium B
Keterangan: tidak terdapat pertumbuhan bakteri DNA rekombinan yang dipotong dengan enzim
BamHI+EcoRI.
Seharusnya yang diharapkan terdapat pertumbuhan koloni putih-biru pada plate medium A dengan perlakuan hasil DNA rekombinan yang dipotong dengan enzim BamHI dan enzim BamHI+EcoRI yang menunjukkan kerja gen lacZ 465 bp yang mengekpresikan β-galaktosidase. Pada vektor plasmid pUC19 terdapat multiple cloning site (MCS) yang terdapat gen LacZ 465 bp. Hasil rekombinan jika ditransformasikan ke sel kompeten maka insert akan merusak gen LacZ 465 bp sehingga gen tersebut tidak dapat diekspresikan. Ekspresi gen LacZ 465 bp ditunjukkan dengan terbentuknya enzim β-galaktosidase yang dengan adanya inducer IPTG akan mengurai substrat X-Gal sehinga terbentuk indol yang merubah warna koloni menjadi biru. Rusaknya gen LacZ 465 bp akan tersisipi oleh insert yang menyebabkan tidak terbentuk enzim β-galaktosidase sehingga X-Gal tidak dapat terurai, indol tidak terbentuk dan koloni tetap berwarna putih.
Pertumbuhan koloni pada medium C tidak sesuai dengan harapan. Koloni yang tumbuh hanya berwarna putih dan tidak ada koloni biru. Tidak dapat dipastikan bahwa koloni tersebut merupakan koloni rekombinan karena tidak terdapat koloni biru sebagai pembanding. Jumlah koloni putih lebih besar daripada koloni biru mengindikasikan tingkat keberhasilan rekombinan yang tinggi. seharusnya, hasil yang diperoleh adalah cawan petri yang dipadati oleh koloni-koloni dengan variasi warna putih dan biru.
Gambar 7. BamHI+EcoRI dalam
medium A Gambar 8. BamHI+EcoRI dalam
BAB IV
KESIMPULAN
Proses kloning yang dilakukan pada praktikun ini belum berhasil dengan baik. Hal ini dapat diketahui dari hasil identifikasi yang menunjukkan bahwa pertumbuhan koloni hanya berwarna putih dan belum bisa dipastikan apakah hasil rekombinan berhasil karena tidak adanya pertumbuhan koloni yang berwarna biru sebagai pembanding. Keberhasilan kloning DNA dipengaruhi oleh kerberhasilan setiap tahapan proses yang dilakukan yaitu isolasi DNA, PCR, restriksi, ligasi, pembuatan sel kompeten, transformasi dan blue and white screening.
DAFTAR PUSTAKA
Brock, T. D. M.T. Madigan & J. Martinko.1994. Biology Of Microorganism, New Jersey. Prentice –Hall. seventh edition
Brown, T.A.1991. Pengantar Kloning Gen. Alih Bahasa : Soemiati, A.M. Yayasan Essentia Medika. Yogyakarta.
Campbell, N.A., Reece, J.B. and Mitchell,L.G.2002. Biologi Edisi kelima jilid 1. Jakarta : Erlangga.
Sambrook J,Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Snustad,D.P. and Simmons, M.J. 2012. Principles of genetics sixth edition. Wiley.
Tamarin, R.H., 2001, Principles of Genetics, Seventh editions, The McGraw-Hill Companies.
Twyman R.M. 1998. Advenced molecular biology. Singapore : Bios Scientific Publisher, Springer-Verlag.
LAMPIRAN
E.coli ATCC(sel) dalam medium A E.coli ATCC(sel) dalam medium B E.coli ATCC(sel) dalam medium C
ddH2O dalam medium A
ddH2O dalam medium B
ddH2O dalam medium C
BamHI dalam medium C BamHI+EcoRI dalam medium C Vektor dalam medium A
Vektor dalam medium B
