LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER ISOLASI DNA Oleh : Yosephina F.Yarangga 2010 38 031 JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PAPUA
MANOKWARI 2015
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Mempelajari DNA bukanlah hal yang mudah karena DNA itu terlalu kecil (tidak mungkin bisa dilihat dengan mata telanjang) dan konsep-konsep mengenai DNA cukup abstrak. Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen dan intergen (Suryo, 2004).
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat-sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon (Kirsman, 2010).
Kerja laboratorium berikut ini memungkinkan anda untuk bekerja dengan DNA secara kongrit dengan mengisolasi DNA total dengan menggunakan peralatan dasar dan juga metode yang sama dengan yang digunakan para Ilmuwan (Dollard, 1994).
1.2 Tujuan
1. Mempelajari bagaimana mengekstraksi DNA.
2.
Mempelajari bagaimana proses ekstraksi DNA.BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, plastida dan sentriol. Molekul DNA pada nucleus memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA yang terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk lingkaran (Suryo, 2012 : 59).
DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA.
DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua ”benang” polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai ”cetak biru kehidupan” karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Jamilah, 2005).
Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008).
B. Teknik Analisis Biologi Molekuler
Sejak akhir 1950-an dan awal 1960-an, ahli biologi molekuler telah belajar untuk mengkarakterisasi, mengisolasi, dan memanipulasi komponen molekul sel dan organisme. Komponen-komponen ini mencakup DNA, repositori informasi genetik; RNA, kerabat dekat DNA yang fungsinya melayani sebagai berkisar dari copy pekerjaan sementara DNA untuk fungsi struktural dan enzimatik aktual serta bagian fungsional dan struktural dari aparat translasi, dan protein, jenis struktural dan enzimatik utama dari molekul dalam sel. Ada beberapa macam teknik analisis biomol antara lain :
1) Ekspresi kloning
Salah satu teknik yang paling dasar biologi molekuler untuk mempelajari fungsi protein adalah kloning ekspresi. Dalam teknik ini, DNA coding untuk suatu protein bunga kloning (menggunakan PCR dan / atau enzim restriksi) ke dalam sebuah plasmid (dikenal sebagai vektor ekspresi). Plasmid ini mungkin memiliki elemen promotor khusus untuk mendorong produksi protein yang menarik, dan mungkin juga memiliki penanda resistensi antibiotik untuk membantu mengikuti plasmid.
Plasmid ini dapat dimasukkan ke dalam sel-sel bakteri baik atau hewan. Memperkenalkan DNA ke dalam sel bakteri dapat dilakukan dengan transformasi (melalui penyerapan DNA telanjang), konjugasi (melalui kontak sel-sel) atau dengan transduksi (melalui vektor virus). Memperkenalkan DNA ke dalam sel eukariotik, seperti sel hewan, dengan cara fisik atau kimia yang disebut transfeksi. Beberapa teknik transfeksi berbeda tersedia, seperti transfeksi kalsium fosfat, elektroporasi, injeksi dan transfeksi liposom. DNA juga dapat diperkenalkan ke dalam sel eukariotik menggunakan virus atau bakteri sebagai pembawa, yang terakhir ini kadang-kadang disebut bactofection dan khususnya menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Plasmid dapat diintegrasikan ke dalam genom, menghasilkan transfeksi stabil, atau mungkin tetap independen dari genom, yang disebut transfeksi sementara. Dalam kedua kasus, DNA coding untuk suatu protein yang menarik sekarang di dalam sel, dan protein sekarang dapat dinyatakan.
Berbagai sistem, seperti promotor diinduksi dan spesifik sel-sinyal faktor, yang tersedia untuk membantu mengekspresikan protein kepentingan di tingkat tinggi. Jumlah besar protein kemudian dapat diekstrak dari sel bakteri atau eukariotik. Protein dapat diuji untuk aktivitas enzimatik bawah berbagai situasi, protein dapat mengkristal sehingga struktur
tersier yang dapat dipelajari, atau, dalam industri farmasi, aktivitas obat baru terhadap protein dapat dipelajari.
2) Polymerase chain reaction (PCR)
Reaksi berantai polimerase adalah teknik yang sangat serbaguna untuk menyalin DNA. Secara singkat, PCR memungkinkan urutan DNA tunggal untuk disalin (jutaan kali), atau diubah dengan cara-cara yang telah ditentukan. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk memperkenalkan situs enzim restriksi, atau untuk bermutasi (mengubah) basa tertentu DNA, yang terakhir adalah metode disebut sebagai "perubahan Cepat". PCR juga dapat digunakan untuk menentukan apakah suatu fragmen DNA tertentu ditemukan di perpustakaan cDNA. PCR memiliki banyak variasi, seperti PCR transkripsi terbalik (RT-PCR) untuk amplifikasi RNA, dan, baru-baru ini, real-time PCR (QPCR) yang memungkinkan untuk pengukuran kuantitatif molekul DNA atau RNA.
3) Gel elektroforesis
Elektroforesis gel adalah salah satu alat utama biologi molekuler. Prinsip dasarnya adalah bahwa DNA, RNA, dan protein semuanya dapat dipisahkan melalui medan listrik. Dalam elektroforesis gel agarosa, DNA dan RNA dapat dipisahkan berdasarkan ukuran dengan menjalankan DNA melalui gel agarosa. Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran dengan menggunakan gel SDS-PAGE, atau berdasarkan ukuran dan muatan listrik mereka dengan menggunakan apa yang dikenal sebagai elektroforesis gel 2D.
BAB III METODE 3.1 Waktu & Tempat
Waktu : Pukul 08:00-10:00 Tanggal : 19 November 2015
Tempat : Laboratorium Bioteknologi, Universitas Papua 3.2 Alat & Bahan
1. Vorteks 1. Sampel
2. Mikrosentrifus 2. Larutan ekstraksi chelex 10 % 3. Alcohol burner 3. Sarung Tangan
4.
Block pemanas 4. Alkohol5. Spiner 5. Tisu
6.
Lembar kerja Chelex 3.3 Cara kerjaProtokol Ekstraksi Promega Kit
1. Ambil 600 ul nuclei lysis masukan kedalam tube
2. Ambil bagian jaringan sebanyak 10-20 mg masukan ke dalam tube
3. Lalu masukan tube 1,5 ml yang sudah diisi nuclei lysis dan jaringan tadi dipanaskan pada suhu 65 ° C selama 30 menit
4. Setelah di heating (di panaskan) selama 30 menit tambahkan 3ul R Nase lalu panaskan lagi selama 30 menit pada suhu 37 ° C
5. Tambahkan protein precipitation solution sebanyak 200 ul, lalu masukan ke dalam freezer selama 5 menit
6. Lalu sentrifuge dengan kecepatan 15.000 rpm selama 4 menit
7. Tambahkan Isoproposal ambil sebanyak 600 ul letakan di tube yang baru, lalu tube yang berisi kemudian ambil supernatant ke tube yang berisi iso propanol 600 ul 8. Sentrifuge kembali sebanyak 15.000 rpm selama 1 menit
9. Buang kembali supernatant dan tambahkan 600 ul etanol 70%
10. Sentrifuge lagi sesuai dengan langkah sebelumnya dengan kecepatan 15.000 rpm selama 1 menit
11. Buang kembali supernatant kemudian di keringkan / di biarkan selama 15 menit 12. Tambahkan DNA Rehydration Solution sebanyak 100 ul
BAB IV
HASIL & PEMBAHASAN 4.1 Hasil
Sampel Ikan Mujair Hasil
4.2 Pembahasan
Pada praktikum kali ini yang dilakukan yaitu Isolasi (ekstraksi) DNA, bekerja di Laboratorium Bioteknologi, semua praktikan diwajibkan menggunakan sarung tangan, tujuannya agar melindungi diri dari zat-zat berbahaya dan juga sebagai syarat utama agar semua yang kita kerjakan selalu aseptis, namun dalam kegiatan praktikum kali ini hanya asisten yang menggunkan sarung tangan, hal ini terjadi karena mengingat jumlah praktikan yang ada dan alat-alat yang akan digunakan juga telah hampir kurang baik. Setelah asisten memakai sarung tangan lalu menyiapkan chelex kemudian campurkan kedalam mikrotube.
Sampel yang akan kita pakai untuk ekstraksi DNA yaitu sampel ikan mujair, oleh karena itu kode untuk tabung di tuliskan, sesudah diberi kode kita dapat merendam pinset kedalam alkohol 96% yang akan digunakan untuk mengambil sampel ikan mujair, tujuan perendaman yaitu untuk mensterilkan pinset agar saat bekerja tidak terjadi kontaminan dan menyebabkan DNA tidak terbaca. Hal ini sangat penting karena untuk tahap keselanjutnya, langkah dasar yang paling utama adalah menjaga agar setiap alat yang akan kita gunakan steril. Setelah itu dipanaskan dibunsen, lalu kita dapat mengeluarkan sampel dari botolnya dan meletakan diatas cawan petri, kemudian sampel dapat langsung dimasukan kedalam mikrotube. Langkah berikutnya yaitu memasukan sampel kedalam hot block suhu diatur 65 ° C selama 30 menit, tujuan sampel dipanaskan agar membantu memecahkan sel dan mendenaturasi protein serta mengaktifkan beberapa enzim yang hanya akan aktif jika dengan suhu yang panas. Dengan begitu DNA dapat memisah dengan reagen chelex. Setelah dipanaskan selama 30 menit, setelah itu dilakukan proses penambahan 3 µl RNase sampel lalu dipanaskan lagi selama 30 menit pada suhu 370C kemudian Proses penambahan Protein
Precipitation Solution sebanyak 200 µl kedalam tube lalu didinginkan kedalam freezer selama 5 menit. untuk cara kerja selanjutnya tidak ada dapat dilakukan karena mengalami gangguan tekhnis saat akan dilakukannya proses centrifuge juga keadaan listrik yang padam sebanyak 2x, sehingga praktikan menggunakan isolasi udang galah yang telah jadi.
BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan
Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam lagkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sampel itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Isolasi DNA denga kualitas tinggi dari berbagai jenis sampel memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan.
Dari hasil praktikum Isolasi DNA. kita hanya dapat mengerjakan proses Isolasi hingga pada tahap pendiginan didalam frezer selama 5 menit karena terjadi kesalahan teknis pada aliran listrik.
5.2 Saran
Diharapkan agar kegiatan praktikum yang akan datang agar lebih baik lagi dari sebelumnya sehingga tidak mengganggu kelancaran proses praktikum yang akan berlangsung.
DAFTAR PUSTAKA http://deallia.blogspot.com/2013/09/laporan-pengamatan-isolasi-dna.html http://biologiaja.blogspot.com/2012/05/isolasi-dna-buah-pisang.html http://aisyatunnurlaelyshare.wordpress.com/science/isolasi-dna/ http://biology-community.blogspot.com/2012/08/isolasi-dna.html http://www.news-medical.net/health/Molecular-Biology-Techniques-%28Indonesian %29.aspx
