ISOLASI DNA KROMOSOMAL DAN PLASMID DARI BAKTERI Escherichia coli Rois Muqsith Fatawy 1)
drh. Bhintarti S.Hastari, M.Biomed2), Festy Aulyaur Rahmah, S.Si2)
Nugroho Adi Maulana3) ,Indhina Reihannisha3)
1)Mahasiswa Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Negeri Islam Syarif Hidayatullah Jakarta
2)Dosen Praktikum Biologi Molekuler
3)Asisten Dosen Biologi Molekuler
Jl. Ir. Djuanda, Tangerang Selatan 15412, Indonesia Email : rois.muqsith@gmail.com
Oktober 2014
ABSTRAK
DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA berbentuk linier. Kromosom adalah suatu struktur makromolekul yang berisi DNA di mana informasi genetik dalam sel disimpan. sekuens DNA yang terletak pada kromosom disebut DNA Kromosomal. Plasmid sebagai DNA ekstrakromosomal merupakan molekul DNA pada sel bakteri, berbentuk bulat kecil yang berbeda dan merupakan tambahan dari molekul DNA utama pada kromosom bakteri. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.
Kata Kunci : Isolasi, Plasmid, Dna Kromosomal
I. DASAR TEORI
Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam
makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya (Suryo 2004).
Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen
yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen dan
intergen(Campbell dkk.2004).
sel, sedangkan DNA prokariot terletak dalam sitoplasma (Jusuf, 2001).
Kromosom adalah suatu struktur
makromolekul yang berisi DNA di mana informasi genetik dalam sel disimpan. sekuens DNA yang terletak pada kromosom disebut DNA
Kromosomal. Kata kromosom berasal dari kata khroma yang berarti warna dan soma yang berarti badan Kromosom terdiri atas dua bagian, yaitu sentromer / kinekthor yang merupakan pusat kromosom berbentuk bulat dan lengan kromosom yang mengandung kromonema & gen berjumlah dua buah (sepasang)(Godam, 2008).
Kromosom adalah pembawa gen yang terdapat di dalam inti sel (nukleus). Kromosom terdiri dari DNA, RNA (asam ribo nukleat) dan protein. Kromosom homolog (2n) adalah kromosom yang terdapat berpasangan dan memiliki struktur dan komposisi yang sama. sel yang memiliki 2n kromosom (kromosom homolog) disebut sel diploid. Bila tidak berpasangan kromosom diberi simbol n
kromosom. Sel dengan n kromosom adalah sel haploid, misalnya sel kelamin jantan saja atau sel kelamin betina saja (Desrizal, 2012).
Plasmid bekteri yang biasanya merupakan molekul DNA untai ganda dengan ukuran dari 1 kb sampai dengan lebih dari 200 kb. Plasmid ini terdapat dalam berbagai spesies bakteri dan merupakan satuan genetik tambahan yang bereplikasi dengan tidak tergantung pada
kromosom bakteri dan diturunkan kepada anakan. Akan tetapi, dalam replikasi dan transkripsi tetap tergantung pada enzim yang terdapat pada sel
inang. Biasanya, plasmid membawa gen yang menjadi enzim yang pada keadaan tertentu menguntungkan sel inang, di antaranya resisten terhadap antibiotik, produksi antibiotik, degradasi senyawa organic kompleks, produksi kolkisin, produksi enterotoksin, enzim restriksi, dan enzim modifikasi (Sudjadi, 2008).
Plasmid sebagai DNA ekstrakromosomal merupakan molekul DNA pada sel bakteri,
berbentuk bulat kecil yang berbeda dan merupakan tambahan dari molekul DNA utama pada
kromosom bakteri. Kebanyakan plasmid adalah sirkular dan tersusun dari beberapa ribu pasangan basa. Plasmid mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi dimulai dari titik ori hingga semua plasmid tereplikasi (Pierce, 2005)
Berbagai tipe plasmid telah ditemukan pada sel bakteri. Distribusi plasmid pada bakteri bersifat sporadis karena ada bakteri yang
mengandung plasmid tetapi ada juga yang tidak, misalnya pada sel E.coli terdapat plasmid F yang menyebabkan bakteri ini mempunyai sifat konjugatif tertentu. Plasmid F biasa digunakan sebagai vector untuk membawa DNA yang akan disisipkan pada genom sel target. Plasmid juga merupakan alat yang efisien untuk
mengamplifikasi klon DNA karena memiliki kopi yang sangat banyak per selnya.
(lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.
Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah
(Campbell dkk. 2002). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Alberts, 1994).
Praktikum ini bertujuan supaya mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA kromosomal bakteri dan juga melakukan isolasi DNA plasmid sengan metode spin column.
II. MATERI DAN METODE
2.1. MATERI
Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Biologi Dasar, Pusat Laboratorium Terpadu, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta pada tanggal 17 Oktober 2014.
Alat- alat yang di digunakan dalam praktikum ini yaitu sentrifuga, mikropipet, vortex, waterbath, freezer,dan inkubator.
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah kultur bakteri Escherichia coli, EDTA 50 mM, larutan sukrosa 25%, EDTA 0,5 M pH 8, lisozim 10 mg/ml, NaCL 5 M, SDS 20%, proteinase-K 5 mg/ml, kloroform, etanol dingin, bufer TE, yellow tips, blue tips, bufer PD1,
RNAse A, bufer PD2, bufer PD3, buffer W1, bufer wash, Ethanol absolut, bufer elusi, tabung mikro 1,5 mL, PD column, 2 ml collection tube, blue tips
2.1 METODE
II.1.1. Isolasi DNA Kromosmal Bakter
Escherichia coli
kecepatan 10.000 rpm bisa dengan menggunakan penggandaan waktu, misal 5000 rpm selama 10 menit). Selanjutnya ditambahkan pelet dengan 30 µL bufer TE. Simpan pada suhu -20 ◦C.
II.1.2. Isolasi DNA Plasmid dengan Metode
Spin
II.1.2.1. Harvesting
Sebanyak 1,5 mL kultur sel bakteri disiapkan dalam tabung mikro 1,5 mL. Kemudian disentrifuga pada 14.000 – 16.000 x g selama 2 menit kemudian dibuang supernatan.
II.1.2.2. Resuspension
200 µL bufer PD1 Resuspensi dilakukan dengan menambahkan (pastikan RNAse A telah ditambahkan I ) kedalam tabung mikro kemudian divortex.
II.1.2.3. Lysis
Proses lisis dilakukan dengan menambahkan 200 µL bufer PD2 (pastikan pelet sudah larut dalam bufer PD 1 ) kemudian dibolak – balik tabung 10x dengan hati-hati (jangan gunakan vortex). Selanjutnya di inkubasi dalam suhu ruang minimal 2 menit.
II.1.2.4. Neutralization
Neutralisasi dilakukan dengan menambahkan 300 µL bufer PD3 kemudian dibolak – balik tabung 10x (jangan gunakan vortex). Setelah itu disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g selama 3 menit.
II.1.2.5. DNA Binding
Tahap ini dilakukan dengan cara tempatkan PD column dalam pada 2 ml collection tube. Kemudian supernata dituang dari tahap setelah neutralisasi, selanjutnya disentrifuga pada 14.000 – 16.000 x g selama 30 detik. Cairan dibuang pada 2 ml collection tube, kemudian pasang kembali PD column pada 2 ml collection tube.
II.1.2.6.
Tahap ini dilakukan dengan menambahkan 600 µL was buffer (pastikan etanol telah ditambahkan) ke dalam PD column kemudian disentrifuga pada 14.000 – 16.000 x g selama 20 detik. Kemudian buang cairan dalam 2 ml collection tube, selanjutnya sentrifuga pada 14.000 – 16.000 g selama 3 menit untuk mengeringkan PD column.
II.1.2.7.
Tahap ini dilakukan dengan menambahkan 50 µL bufer elusi kebagian tengah PD column mantrix. Setelah itu dibiarkan minimal 2 menit agar bufer elusi terserap sempurna. Sentrifuga kembali cairan dalam 2 ml collection tube ke bagian tengah PD column matrix. Kemudian disentrifuga pada 14.000 – 16.000 x g selama 2 menit untuk mendapatkan DNA murni.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
III.1. HASIL
No Tahapan Gambar Keterangan Isolasi DNA Kromosom
1. Penamba
han 60
EDTA
50 mM
Terdapat kultur bakteri
2. Penamba han klorofor m
Terbentuknya 3 lapisan
3. Penamba han etonol dingin
Terbentuknya 2 lapisan
Isolasi DNA Plasmid 1. Neutraliz
ation
Terdapat DNA
2. Wash Terdapat senyawa kontaminan
3. DNA
elution
Terdapat DNA murni
PEMBAHASAN
isolasiDNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya pada praktikum ini kultur bakteri disentrifuge dengan kecepatan 4300 selama 20 menit.
Setelah disentrifuge didapatkan pelet (hasil dari pemisahan berat molekul oleh gaya sentrifugal) disuspensikan kembali dan timbahkan EDTA yang berfungsi EDTA berfungsi sebagai pengkelat magnesium kalsium yang berperan dalam menjaga stabilitas membran plasma serta menghambat DNAse sehingga molekul DNA tidak terdenaturasi. Penambahan sukrosa 25% juga diperlukan untuk meningkatkan tekanan osmotik di luar sel yang mampu membantu proses pelisisan (Suharsono,2006).
Kemudian dilanjutkan pada ekstraksi DNA dengan tujuan agar didapat ekstrak dari nukleus. DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat
dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi (Suharsono,2006).
SDS dan Proteinase-k berfungsi untuk mempermudah isolasi DNA. Tahap lysis tetap menggunakan pelet hasil sentrifuge pada tahap sebelumnya. Pellet ini diresuspensikan ke dalam buffer lisis yang terdiri dari: SDS 20% untuk campuran tersebut dihomogenkan menggunakan vortex agar pemutusan ikatan-ikatan peptida tersebut lebih cepat terjadi. Selanjutnya suspensi diinkubasi pada suhu 50oC selamat 1 jam. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh suhu. Presipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform berguna untuk menghilangkan sisa protein (Triwibowo,2005).
enzim yang digunakan untuk merusak protein yang ada (Triwibowo,2005).
DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur isolasi DNA kromosom. Setelah proses kultur bakteri di sentrifuge 14000-16000 rpm yang kemudian dibuang supernatannya. Setelah itu pada tahapan resuspensi ditambahkan RNAse berfungsi untuk mendegradasi RNA
Kemudian dilakukan penambahan etanol absolut berguna untuk mengendapkan kromosom karena perbedaan polaritas, etanol yang ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi DNA kromosom yang mengendap. Kromosom yang didapatkan berupa pellet ditambahkan bufer TE.
Pemurnian atau isolasi DNA plasmid menggunakan kit ini menggunakan metode pemurnian berdasarkan konformasi DNA (dengan denaturasi alkali). Kebanyakan DNA plasmid berada dalam sel sebagai molekul yang sangat berlilitan (supercoiled) atau disebut covalently closed circular (CCC) DNA. DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya. Molekul supercoiled ini jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom dan dapat dipisahkan dengan dua cara yaitu: denaturasi dengan alkali, dan pemurnian berdasarkan kerapatan apung (bouyant density) atau dikenal dengan istilah equilibrium density gradient centrifugation atau sentrifugasi isopiknik (Sudjadi,2008).
Lisis sel dalam isolasi DNA plasmid digunakan buffer P1 dan P2. Buffer P1 sebelumnya telah ditambah dengan enzim RNAse A untuk perusakan dinding dan lisis sel. Pada pH 12-12,5 ikatan hidrogen dari DNA kromosom non supercoiled akan terdenaturasi, heliks ganda terurai dan kedua rantai polipeptida memisah. Penambahan P2 akan memperjelas proses ini untuk mengecek apakah denaturasi ini telah berhasil dengan baik atau tidak (Sudjadi,2008).
Hasil isolasi DNA yang didapat dari percobaan ini adalah seperti benang-benang halus yang berwarna putih. Benang-benang tersebut merupakan kumpulan DNA yang berbentuk kromatin. Kromatin terdiri dari sejumlah molekul DNA yang beruntai ganda yang sangat panjang dan massa protein dasar yang agak kecil serta hampir sama besarnya yang dinamakan histon disamping protein non histon dalam jumlah yang lebih sedikit (sebagian diantaranya bersifat asam dan berukuran lebih besar daripada histon) dan sejumlah kecil RNA. Heliks DNA berantai ganda dalam setiap kromosom memiliki panjang yang besarnya ribuan kali diameter nukleus sel. Salah satu tujuan molekul ini, khususnya histon adalah untuk memadatkan DNA.
KESIMPULAN
Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.
DAFTAR PUSTAKA
Campbell, N.A. 2002. Biologi 5th ed. Erlangga. Jakarta
Jusuf. 2001. Genetika I: Struktur dan Ekspresi gen. Sagung Seto. Jakarta
Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Kasinius. Yogyakarta.
Suharsono dan Widyastuti. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi. IPB.
Triwibowo, Y. 2005. Biologi Molekular. Erlangga. Jakarta
Triwibowo, Y. 2005. Biologi Molekular. Erlangga. Jakarta
LAMPIRAN
Kultur bakteri di sentrifuse Pengambilan supernatan Pelet 50 μl, ditetesi ke Pd colum
KIT Pengambilan bufer elusi pengambilan bufer
wash
Kromosomal+kloroform Krmsomal+klofrom+dikocok 20menit plasmid+Pd3+sentrifuse
Pengambilan supernatan Pellet Kromosomal+kloroform+dikocok 20 menit
