LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI ISOLASI DNA KASAR

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

“ISOLASI DNA KASAR”

Disusun Oleh:

Nama

: Helmi D.A

NIM

: 115040201111199

Kelompok

: jumat,15.00 wib

Asisten

:

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2012

BAB I

PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang

Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting,

mengingat bioteknologi pada akhir-akhir ini sangat maju.

Terlebih untuk bidang biologi molekuler. Beberapa

bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam tanaman –

padi, kapas, dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk

perkembangan keanekaragaman hayati dimasa

mendatang memerlukan sebuah keterampilan dan

pemikiran. Melalui isolasi DNA tersebut paling tidak

akan menjadi pembelajaran bagi mahasiswa mengenai

cara pengumpulan DNA.

Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi

atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan seperti

amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis.

Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan

DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan

karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga

yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA

dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta

pemurnian DNA, ada beberapa hal yang perlu

diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus

menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti

protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa

dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan

tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA;

dan metodenya harus sederhana dan cepat.

1.2 Tujuan

• Untuk mengetahui apa itu isolasi DNA.

• Untuk mengetahui tahapan-tahapan isolasi DNA. • Untuk mengetahui cara untuk melakukan isolasi DNA. 1.3 Manfaat

Praktikum ini bermanfaat agar praktikan memahami dan mengerti tahap-tahap yang dilakukan dalam mengisolasi DNA pada tanaman.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Definisi DNA

 Deoxyribonucleic acid (DNA) isolasi adalah proses ekstraksi DNA dari berbagai sumber. Sumber untuk isolasi DNA sangat beragam. Pada dasarnya dapat diisolasi dari organisme hidup atau mati. Sumber-sumber umum untuk isolasi DNA meliputi seluruh darah, rambut, sperma, tulang, kuku, jaringan, noda darah, air liur, bukal (pipi) kapas, sel epitel, urin.  DNA is a nucleic acid that contains the genetic

material and serve to regulate the biological development of all forms of life in color. DNA found in the nucleus, mitochondria and chloroplasts. The differences between them are: DNA and the linear-shaped nucleus is closely associated with histone proteins, whereas mitochondrial and chloroplast DNA is circular and is not associated with histone proteins.

(Lewis, 2003) 2.2 Macam Metode Isolasi DNA

Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990)

dengan Nitrogen Cair.



Metode I.

Daun temulawak sebanyak 1 gram digerus

dengan PVP dannitrogen cair hingga menjadi tepung.

Sebanyak 10 mL bufer ekstraksi hangat dan 2.5 mL

2-merkaptoetanol ditambahkanke dalam sampel dan

diinkubasi sambil digoyang perlahan pada suhu 55 C,

kecepatan 150 rpm selama 1 jam. Selanjutnya

diekstraksi ulang dengan kloroform:isoamil alkohol

(24:1) sebanyak 10 mL. Selanjutnya, dilakukan

pemisahan dengan sentrifugasi pada kecepatan 1000 g

selama 5 menit. Aliquot yang terdapat pada bagian atas

dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan dengan

isopropanol dingin sebanya 2/ volume. Kemudian

diinversi dan diinkubasi dalam es selama 30 menit.

Pelet dikoleksi dengan sentrifugasi pada kecepatan

12000 g selama 20 menit. Pelet dicuci dengan buffer

pencucii (etanol 76% dan ammonium asetat).

Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 14000 g selama

10 menit. Pencucian dilakukan sebanyak 2 kali. Pelet

yang telah dicuci selanjutnya ditambahkan dengan bufer

TE dan ditambahkan RNAse A dengan konsentrasi final

10 ug/mL. RNAse A diaktivasi pada suhu 37 C selama

30 menit. Selanjutnya, dipisahkan dengan sentrifugasi

pada kecepatan 12000 g selama 5 menit. Pelet yang

dihasilkan diresuspensi dengan molecular water.

Proteinase K ditambahkan dengan dua variasi

penambahan.

Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990)

tanpa Nitrogen Cair.



Metode II.

Sampel daun sebanyak 0.2 gram dan digerus dengan

PVP dan 0.75 mL buffer ekstraksi (2% b/v CTAB, 1.4

M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 8),

0.2% (v/v) 2- merkaptoetanol). Inkubasi dilakukan

dengan incubator shaker pada suhu 65°C dengan 50

rpm selama satu jam. Sampel kemudian dibiarkan pada

suhu ruang untuk proses cooling. Sampel ditambahkan

0.75 mL kloroform: isoamil alkohol (24:1) dan

disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu

4

o

C. Supernatan berisi DNA dipindahkan ke tabung

baru dan ditambahkan dengan 2/3 volume isopropanol

dingin kemudian diinversi perlahan sebanyak 10 kali.

Smapel tersebut disentrifugasi 11.000 rpm selama 10

menit pada suhu 4

o

C. Pelet yang telah kering diberi 25

μL molecular water dan disimpan pada suhu -20°C.

Metode Ekstraksi Modifikasi Zheng et al (1995).



Metode III.

Sampel daun 200 mg digerus hingga halus dan

ditambahkan buffer ekstraksi (25 mM EDTA (pH 7.5),

50 mM TrisHCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, dan SDS 1%)

sebanyak 400 μL dalam mortar dingin. Sampel

ditambahkan 100 μL buffer ekstraksi di dalam tabung

dingin dan ditambahkan 400 μL kloroform kemudian

diinversi. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 1

menit pada suhu 4

o

C. Lapisan atas yang terbentuk

ditambahkan 800 μL etanol absolut dan diinkubasi pada

suhu -20

o

C selama 1 jam. Sentrifugasi dilakukan 13.000

rpm selama 3 menit pada suhu 4

o

C. Endapan berupa

pellet DNAditambahkan 500 μL Etanol 70% dan

disentrifugasi kembali. Pellet yang telah kering

diresuspensi dengan 50 μL molecular water dan

ditambahkan RNAse serta diinkubasi pada suhu 37

o

C

selama 30 menit. Sentrifugasi 10000 rpm dilakukan

selama 5 menit. Pellet kering ditambahkan 50 μL

molecular water. Suspensi tersebut disimpan pada suhu

-20

o

C.

Ketiga metode tersebut di atas dimodifikasi untuk

mendapatkan DNA genom dengan kualitas terbaik.

Modifikasi dilakukan dengan variasi penambahan

etanol 76%, buffer pencuci (etanol 76% dan ammonium

asetat 3M), Proteinase K, RNAse A, kalium asetat 5M,

dan PVP. Selain itu, modifikasi juga dilakukan dengan

variasi penambahan larutan pada tahap yang berbeda.

2.3 Perbedaan Isolasi DNA Kasar dengan Isolasi DNA Buffer DNA Ekstraksi

2.4 Manfaat Isolasi DNA

Isolasi DNA memiliki beberapa manfaat diantaranya: 1. Bermanfaat sebagai tempat penyimpanan dan penyalur

informasi genetic suatu makhluk hidup.

2. Bermanffat sebagai heterokatalis, yaitu untuk melaksanakan pengaturan pembuatan molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu fungsi DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri.

3. Sebagai visualisai DNA dnegan elektoforesis gel. 4. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan

secara enzimatik melalui teknik hibridisasi southern. 5. Isolasi DNA genomic dalam rangka pembuatan

pustaka genomic.

6. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA.

7. Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR.

BAB III METODOLOGI 3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat:

 Timbangan : Untuk menimbang bahan  Mortar : Sebagai tempat penggilingan  Pestle : Untuk menggiling bahan  Bekker Glass : Untuk meletakkan larutan  Pipet : Untuk mengambil larutan  Gelas Ukur : Untuk mengukur larutan  Tabung Eppendorf : Sebagai tempat untuk

meletakkan larutan yang sudah diekstrak

 Tissue : Untuk mengeringkan alat yang basah

 Pisau : Untuk memotong bahan  Spatula : Untuk mengambil bahan

dalambentuk bubuk 3.1.2 Bahan:

 Buah mangga : Bahan yang akan dimati  Detergen cair : Sebagai pembanding DNA  Detergen bubuk : Sebagai pembanding  Bu Cream : Sebagai pembanding

3.2 Langkah Kerja

Timbang mangga 5 g Haluskan dengan mortar Masukkan Bekker Glass Tambah aquades 50 ml yang sudah ada

Aram 2,5 g dan detergen 2,5 g Sentrifuge 10.000 rpm 10’

Homogenkan

Campur dengan larutan mangga Diamkan selama 15 menit

Saring Ekstrak bahan Ambil 5 ml dengan pipet Tambahkan alcohol dingin

Masing-masing 6 ml Amati penggumpalannya

3.3 Analisa Perlakuan

Analisa perlakuan pada praktikum kali ini yaitu pada saat larutan buah manga yang telah dicampur dengan detergen dan garam, maka didiamkan selama 15 menit. Hal ini dilakukan dengan tujuan agar endapan yang ada dapat turun kebawah sehingga kita dapat melihat perbedaannya.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Dokumentasi

No. Dokumentasi Keterangan

1.

Mangga dihaluskan dengan menggunakan

mortar dan pestle

2.

Mangga yang sudah dihaluskan dimasukkan ke dalam botol

3.

Ditambah garam, rinso cair, aquadest, diaduk dan didiamkan selama

10 menit

4.

Ditambah garam, rinso bubuk, aquadesh, diaduk

dan didiamkan selama 10 menit

5.

Ditambah garam, bu cream, aquadesh, diaduk

dan didiamkan selama 10 menit

6.

Merupakan hasil dari kiri ke kanan : a)garam+rinso cair,b)garam+rinso bubuk,c)garam+bukream

7. Hasil setelah diberi

4.2 Pembahasan

Dari isolasi DNA secara kasar pada buah mangga arum manis dapat kita ketahu bahwa jumlah DNA terbesar yang muncul adalah pada ekstark mangga yang dicampur dengan larutan rinso cair,kemudian ekstrak mangga dengan campuran larutan garam+rinso bubuk dan yang terakhir adalah ekstrak mangga dengan campuran larutan garam+bukcream.

Sebenarnya campuran larutan yang memunculkan DNA paling banyak adalah larutan garam+rinso bubuk karena terdapat partikel- partikel yang bewarna merah dan biru yang membantu pemecahan dinding sel.tetapi itu tidak terjadi,mungkin dikarenakan saaat mengaduk terlalu keras sehingga busa muncul dan menutupi DNA yang keluar dan untuk dapat melihat DNA tersebut baik nya diberi etanol 6% dalam keadaan dingin

BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan

Dari hasil praktikum yang telah dilakukan dengan menggunakan bahan detergen cair dan bubuk dengan merk Rinso, dan detergen cream dengan merk Bu Krim dapat disimpulkan bahwa detergen bubuk lebih banyak menibulkan benang-benang DNA. Hal ini disebabkan karena semakin sedikit air yang terkandung dalam buah maka DNA yang akan terpresipitasi akan semakin sedikit. Tabung selanjutnya yang dapat terlihat benang-benang DNA adalah detergen yang cream, kemudian cair. Disini untuk detergen bubuk dan cir menggunakan detergen dengan merk Rinso, sedangkan untuk yang cream, menggunakan detergen dengan merk Bu Krim. 5.2 Saran

DAFTAR PUSTAKA

Lewis, R. 2003. Human genetics: Concepts and applications. The McGraw-Hills Company, Inc.,

Anonim a. 2005. DNA Extraction from Wheat Germ, (Online),

(http://www.gslc.genetics.utah.edu/units/activities/whea tgerm.html, diakses 6 April 2007) Hays, Lana. 2005. Introduction to DNA Extraction, (Online), (http://www.tsl.orst.edu.tgerc/dnaext.html, diakses 6 April 2007).

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang.

Tim Dosen Biologi FMIPA UB. Tanpa Tahun. Teknik Analisis Protein dan DNA. Malang: FMIPA Universitas Brawijaya.

Zubaidah, Siti. 2004. Identifikasi, Variasi Genetik, Distribusi dan Upaya Eliminasi Bakteri Penyebab CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration). Desertasi tidak diterbitkan. Malang: Program Pasca Sarjana Universitas Brawijaya.