DO NOT COPY
Profil Genetik Daerah Hipervariabel I (HVI) DNA Mitokondria pada Populasi Dataran Tinggi
Gun Gun Gumilar, Ridha Indah Lestari, Heli Siti HM.
KBK Kimia Hayati Prodi Kimia FPMIPA Universitas Pendidikan Indonesia [email protected]
ABSTRAK
Adaptasi individu terhadap ketinggian geografis berhubungan dengan faktor genetik, salah satunya diduga mempengaruhi urutan DNA mitokondria (mtDNA). Berdasarkan hal tersebut, dalam penelitian ini dilakukan penentuan profil genetik daerah hipervariabel I (HVI) mtDNA manusia pada populasi dataran tinggi Gunung Papandayan, Garut. Tahapan yang dilakukan meliputi lisis terhadap sampel rambut, amplifikasi fragmen HVI mtDNA dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR), deteksi hasil PCR dengan elektroforesis gel agarosa, penentuan urutan nukleotida dengan metode direct sequencing dan analisis hasil sekuensing dengan menggunakan program SeqMan DNASTAR. Hasil analisis terhadap 7 sampel populasi dataran tinggi menunjukkan adanya variasi mutasi. Jenis mutasi yang terjadi adalah subtitusi transisi pada tujuh sampel, subtitusi transversi pada empat sampel, delesi pada satu sampel, dan insersi pada satu sampel. Mutasi T16189C merupakan mutasi dengan frekuensi tertinggi dimana mutasi ini menyebabkan terjadinya rangkaian poli-C. Terdapat tiga sampel yang menunjukkan fenomena poli-C, dengan panjang poli-C beragam yaitu 8C, 12C dan 13C. Berdasarkan perbandingan data mutasi sampel dengan data yang telah dipublikasikan di situs database mitomap terdapat satu mutasi yang belum dipublikasikan yaitu T16063G. Hasil analisis menunjukkan mutasi ini diduga sebagai kandidat mutasi spesifik. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi gambaran awal mengenai profil genetik daerah HVI mtDNA manusia pada populasi dataran tinggi di Indonesia. Kata kunci : mtDNA, profil genetik, HVI, dataran tinggi.
ABSTRACT
Adaptation of an individual towards the geographical altitude correlates with the genetic factor, among which is the sequence of mitochondrial DNA (mtDNA). Therefore, the research aims to investigate the genetic profile of the hipervaribel region (HVI) in human mtDNA of people living in the Papandayan Mountain areas, Garut, Indonesia. The research methodology include the lysis of hair samples, amplification of HVI mtDNA fragments using PCR, detection of PCR pruducts using gel agarose electrophoresis, DNA sequencing and the analysis of sequences using SeqMan DNASTAR program. This research may offer as an illustration of the genetic profile of human mtDNA in HVI area of Indonesian population living in high altitude areas.
DO NOT COPY
PENDAHULUAN
Dalam kondisi terentu, Manusia dapat menjaga fungsi fisiologis tubuh untuk beradaptasi dengan lingkungan-nya, contohnya ketinggian geografis. Proses ini diduga mempengaruhi level genetik dari individu yang bersang-kutan. Hal ini dapat terlihat dari pene-litian yang dilakukan oleh Simonson et al. (2010), yang menunjukkan bahwa dua gen orang di dataran tinggi Tibet berbeda dengan gen orang yang tinggal di dataran rendah. Adanya perbedaan ini mengindikasikan bahwa faktor genetik dipengaruhi faktor geografi. Ketika ketinggian bertambah maka manusia akan meningkatkan frekuensi pernafasan dan denyut jantung (Pelupessi, 2010). Jumlah hemoglobin dalam darah juga bertambah karena faktor ketinggian (Martin and Windsor, 2008).
Profil genetik manusia dapat dilihat dari DNA inti atau DNA mito-kondria (mtDNA). DNA inti memiliki 3 milyar pasang basa sedangkan (pb) mtDNA memiliki 16.569 pb. Sejak mitokondria diketahui sebagai organel tempat berlangsungnya sebagian besar reaksi-reaksi metabolik maka mtDNA banyak dijadikan fokus dalam berbagai penelitian. Variasi mutasi mtDNA yang tinggi juga dijadikan latar belakang dalam berbagai penelitian. Variasi mutasi yang tinggi pada mtDNA terdapat pada daerah D-loop (Chen, 2009). D-loop terdiri atas dua daerah hipervariabel I (HVI) pada posisi nukleotida 16024-16383 dan daerah hipervariabel II (HVII) pada posisi nukleotida 57-372.
Tekanan oksigen di udara pada pada dataran tinggi lebih rendah dibanding tekanan oksigen di dataran rendah (Martin and Windsor, 2008). Hal tersebut menyebabkan jumlah
partikel oksigen pada dataran tinggi lebih sedikit dibanding dataran rendah. Di sisi lain, mtDNA mengkode 13 gen untuk protein yang terlibat pada proses fosforilasi oksidatif. Proses fosforilasi oksidatif memerlukan sejumlah oksige-n, sehingga jumlah partikel oksigen yang masuk kedalam tubuh akan berpengaruh terhadap proses ini. Penelitian sebelumnya meneliti bahwa mutasi pada mtDNA berpengaruh ter-hadap konsumsi oksigen oleh tubuh (Murakami et.al, 2006).
Penelitian tentang variasi mutasi pada daerah HVI telah banyak dilakukan, salah satunya adalah penelitian yang menunjukkan bahwa perbedaan urutan nukleotida pada daerah HVI/II berhubungan dengn perbedaan urutan nukleotida pada gen-gen pengkode di mtDNA (Noer and Syukriani dalam Halimatul et al., 2009). Penelitian lain menunjukkan terdapatnya variasi urutan gen ATPase 6 mtDNA manusia pada populasi dataran tinggi (Halimatul et al., 2009). Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan penentuan variasi mutasi daerah HVI mtDNA manusia pada populasi dataran tinggi Gunung Papandayan, Garut. Hasil penelitian ini nantinya dapat digunakan sebagai pijakan dalam menentukan profil genetik mtDNA populasi dataran tinggi.
METODOLOGI PENELITIAN Penelitian ini meliputi tahapan pengumpulan sampel mentah mtDNA manusia, lisis sampel, amplifikasi daerah D-loop mtDNA dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR), deteksi hasil PCR, sekuensing dan analisis hasil sekuensing.
Pengumpulan sampel dilaku-kan di dataran tinggi Gunung
Papan-DO NOT COPY
dayan yang mempunyai ketinggian ±2400 dpl. Sampel diperoleh dengan mengambil masing-masing 5-7 helai sel folikel akar rambut dari 7 orang penduduk sekitar. Selanjutnya untuk mendapatkan templat PCR, sel akar rambut tersebut dilisis dengan menambahkan pereaksi buffer lisis, ddH2O dan enzim proteinase K. Proses
lisis dilakukan selama 1 jam pada suhu 55 0C.
Sebelum dilakukan analisis lebih lanjut, dilakukan proses (per-banyakan) fragmen mtDNA, dimana daerah D-loop (yang meliputi daerah HVI) dijadikan target proses amplifikasi. Pereaksi PCR yang terdiri templat mtDNA hasil lisis; primer M1 dan HV2R (Tabel 1); buffer PCR 10 x (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 9 pada suhu 25˚C; 1,0% Triton X-100;
15 mM MgCl2); enzim Taq DNA
Polimerase; campuran dNTP; serta
ddH2O steril sehingga volumenya
mencapai 25μL. Proses PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dengan mengguna-kan mesin GeneAmp® PCR System 2700. Tiap siklus terdiri atas tahap denaturasi pada suhu 94˚C selama satu menit, tahap annealing pada suhu 50°C selama satu menit dan tahap polimerase pada suhu 72°C selama 1 menit.
Tabel 1. Urutan Basa Nukleotida Primer Primer Urutan 5’ ke 3’ Ukuran M1 -CACCATT AGCACCC AAAGCT- 20 nukleotida HV2R -CTGTTAA AAGTGCA TACCGCC- 21 nukleotida
Deteksi hasil PCR dilakukan menggunakan elektroforesis gel
agarosa 1% (h/v) menggunakan alat mini sub TM DNA Electrophoresis cell (TM minicell). Penentuan konsentrasi DNA dilakukan dengan cara membandingkan intensitas pita yang dianalisis terhadap pita-pita dari marker yang konsentrasinya telah ditentukan sebelumnya. Marker yang digunakan adalah pUC19/HinfI. Marker ini memiliki lima pita yang masing-masing berukuran 1419 pb, 517 pb, 396 pb, 214 pb, dan 75 pb (Gumilar, 2005).
Setelah didapatkan hasil positif berdasarkan deteksi menggunakan elektroforesis gel agarosa, selanjutnya dilakukan proses sekuensing di
laboratorium Macrogen, Inc
Advancing Through Genomics Korea. Analisis hasil sekuensing dilakukan dengan membandingkan urutan basa (nukleotida) sampel terhadap urutan nukleotida standar Cambridge hasil revisi, revised Cambridge Reference Sequence (rCRS), dengan bantuan
program SeqMantm versi 4
DNASTAR.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Fragmen Hasil Amplifikasi mtDNA
Hasil amplifikasi mtDNA menggunakan teknik PCR berupa cairan tidak berwarna yang di dalam-nya terdapat fragmen-fragmen mtDNA dengan panjang basa (pb) tertentu. Hasil proses PCR ini kemudian dideteksi dengan elektroforesis gel agarosa 0,1 %. Dengan elektroforesis dapat diprediksi panjang fragmen ( pasang basa) mtDNA yang di-identifikasi. Hasil elektroforesis gel agarosa sampel yang telah divisualisasi dengan lampu UV dapat dilihat pada Gambar 1. Untuk dapat melihat DNA hasil PCR dengan lampu UV
DO NOT COPY
sebelumnya gel agarosa ditambahkan larutan etidium bromida (EtBr). EtBr akan mengikat DNA dengan cara menginsersi diantara pasangan basa dan menghasilkan warna ketika diilu-munasi dengan cahaya UV.
Semua sampel memberikan hasil amplifikasi fragmen berukuran sekitar 0,9 kb yang terletak di antara pita fragmen 517 pb dan pita fragmen 1419 pb standar pUC19/HinfI. Gambar 1 memperlihatkan pita fragmen sampel 01, 06, 07, 10 dan DT-11 masing-masing pada lajur 2-6. Demikian juga pada sampel DT17 dan DT-19 memperlihatkan pita fragmen yang sama (gambar tidak ditunjukkan).
Ukuran pita fragmen 0,9 kb merupakan fragmen D-loop mtDNA. Hal ini dikarenakan ketika proses PCR digunakan primer M1 dan HV2R yang dapat mengenali fragmen D-loop mtDNA manusia. Kontrol positif proses PCR digunakan sampel mtDNA yang sudah berhasil diamplifikasi pada kondisi PCR yang sama. Kontrol positif memberikan hasil amplifikasi fragmen berukuran sekitar 0,9 kb. Menunjukkan bahwa proses PCR berjalan dengan baik dan sesuai. Kontrol positif juga berfungsi sebagai kontrol proses lisis sampel. Jika pita fragmen sampel tidak muncul, sedang-kan pada pita fragmen kontrol positif muncul maka kesalahan terjadi pada proses lisis atau memang didalam sampel jumlah mtDNA sangat sedikit. Pada kontrol negatif digunakan ddH2O
steril sebagai pengganti templat. Kontrol negatif berfungsi untuk mengetahui kemungkinan terdapatnya kontaminan dalam campuran reaksi PCR. Tidak munculnya pita kontrol negatif pada hasil amplifikasi menun-jukkan bahwa semua pita yang muncul bukan berasal dari kontaminan.
Gambar 1. Visualisasi Elektroforesis Gel Agarosa dengan Lampu UV. Fragmen 0,9 kb
mtDNA ditunjukkan pada lajur 2 sampai 6 dengan kode sampel masing-masing DT-01, DT-06, DT-07, DT-10 dan DT-11. Marker yang digunakan pUC19/HinfI (pada lajur 1) yang menghasilkan 5 fragmen. Kontrol positif dan negatif proses PCR ditunjukkan pada lajur 7 dan lajur 8.
Variasi Mutasi Daerah HVI mtDNA Manusia Dataran Tinggi
Adanya mutasi pada daerah HVI mtDNA diketahui dengan mem-bandingkan elektroforegram sampel populasi dataran tinggi dengan urutan nukleotida standar rCRS (revised Cam-bridge Reference Sequence). Urutan standar CRS adalah urutan nukleotida mtDNA yang pertama kali dipubli-kasikan dan dijadikan standar variasi mutasi. Analisis jenis dan posisi mutasi yang terjadi dilakukan dengan meng-gunakan program SeqMan DNASTAR.
Berdasarkan perbandingan antara urutan HVI mtDNA tujuh sampel dengan rCRS, diperoleh variasi jenis dan posisi mutasi. Gambar 2. menunjukkan salah satu contoh analisis jenis dan posisi mutasi yang terdeteksi pada sampel DT-01. Bagian elektroforegram yang dilingkari me-nunjukkan urutan nukleotida sampel yang berbeda dengan urutan nukleo-tida standar. Perbedaan itu yang
me-DO NOT COPY
nunjukkan terdapat mutasi pada sampel DT-01.
Pada gambar terlihat urutan complete genom yang merupakan nukleotida rCRS dan sampel DT-01. Berdasarkan hasil analisis dapat dike-tahui terdapat mutasi subtitusi transisi C16147T, insersi pada posisi 16183.1C dan delesi pada posisi 16189.D.
Berdasarkan Gambar 2, diketahui terdapat tiga mutasi pada sampel DT-01. Mutasi pada posisi 16147 yaitu mutasi subtitusi transisi, dimana pada urutan nukleotida standar terdapat basa sitosin sedangkan pada urutan nukleotida sampel DT01 terdapat basa timin (C16147T).
Mutasi pada posisi 16183 yaitu mutasi insersi dimana pada urutan nukleotida standar tidak terdapat basa nukleotida sedangkan pada urutan nukleotida sampel DT01 terdapat basa sitosin (16183.1C). Mutasi pada posisi 16189 yaitu mutasi delesi dimana pada urutan nukleotida standar terdapat basa nukleotida, sedangkan pada urutan nukleotida sampel DT01 tidak terdapat basa nukleotida (16189del). Dengan cara yang sama semua sampel di-analisis menggunakan program SeqMan DNASTAR. Data hasil analisis pada semua sampel populasi dataran tinggi dapat dilihat pada Tabel 2.
DO NOT COPY
Berdasarkan Tabel 2, diketahui variasi mutasi yang terjadi dengan jenis mutasi yang terjadi yaitu subtitusi transisi terdapat pada tujuh sampel, subtitusi transversi pada empat sampel, delesi pada satu sampel dan insersi pada satu sampel. Jenis mutasi subtitusi transisi yang terjadi yaitu tujuh mutasi subtitusi transisi basa sitosin menjadi basa timin, tiga belas mutasi subtitusi transisi basa timin menjadi sitosin, tiga mutasi subtitusi transisi adenin menjadi basa guanin dan tiga mutasi subtitusi transisi guanin menjadi basa adenin. Jenis mutasi subtitusi transversi yang terjadi yaitu tiga mutasi subtitusi transversi basa adenin menjadi sitosin. Jenis mutasi insersi yang terjadi yaitu satu mutasi insersi dengan satu basa sitosin. Jenis mutasi delesi yang terjadi yaitu satu mutasi delesi basa timin. Mutasi yang terjadi pada tiap sampel berkisar antara 2-8 mutasi tiap sampel. Mutasi paling banyak terdapat pada sampel DT-19 yaitu sebanyak 8 mutasi dan
mutasi paling sedikit terdapat pada sampel DT-10 yaitu sebanyak 2 mutasi.
Berdasarkan Tabel 2, diketahui dari tujuh sampel yang disekuensing terdapat tiga sampel yang memiliki mutasi T16189C. Mutasi ini menyebabkan terjadinya rangkaian poli-C pada urutan nukleotida sampel DT-07, DT-10 dan DT-11. Mutasi T16189C merupakan mutasi dengan tingkat frekuensi kemunculan tertinggi.
Berdasarkan Gambar 3 terlihat bahwa rangkaian poli-C sampel DT-07 adalah sebanyak 13 basa, sampel DT-10 sebanyak 8 basa. Berdasarkan analisis yang sama diketahui sampel DT-11 memiliki rangkaian poli-C sebanyak 12 basa. Walaupun tingkat frekuensi kemunculannya tertinggi, namun mutasi ini diduga bukan mutasi spesifik untuk populasi dataran tinggi, karena poli-C juga ditemukan pada populasi dataran rendah (Nurafianti, 2010).
Gambar 3. Elektroforegram Sampel dengan Rangkaian Poli-C. Perbandingan Mutasi HVI mtDNA
dengan Data Mitomap
Perbandingan data mutasi hasil penelitian dengan database mitomap dilakukan untuk mengetahui apakah jenis mutasi yang terjadi merupakan mutasi baru atau sudah pernah
dipublikasikan sebelumnya. Perbandi-ngan mutasi sampel terhadap database mitomap dilaporkan dalam Tabel 3.
Setelah melakukan perban-dingan dengan data mutasi yang telah dipublikasikan pada situs pencarian database mitomap, terdapat 32 mutasi
DO NOT COPY
yang telah dipublikasikan dan terdapat satu mutasi yang belum dipubli-kasikan, yaitu pada mutasi T16063G. Mutasi ini diduga sebagai kandidat mutasi spesifik dengan cara memper-banyak jumlah sampel dalam populasi.
Variasi mutasi yang muncul pada sampel sebagian besar merupakan jenis mutasi yang mengindikasikan adanya penyakit kanker mulut. Mutasi tersebut di antaranya adalah mutasi
pada posisi C16061G, G16129A, T16172C, C16223T, C16234T, C16256T, T16304C, A16309G dan T16362. Selain kanker mulut, ada pula mutasi dari sampel yang mengindikasikan adanya penyakit tumor, yaitu mutasi pada posisi C16147T. Rangkaian poli-C terjadi pada sampel DT-07 dan DT-10 yang disebabkan mutasi T16189C.
Tabel 3. Daftar Mutasi Sampel yang Telah dan Belum Dipublikasikan pada Data
Mitomap
No Kode sampel Jenis mutasi
Hasil perbandingan dengan
data mitomap Jumlah mutasi Telah dipublikasikan Belum dipublika sikan 1 DT-01 C16147T √ 7 16183.1C √ 16189D √ T16217C √ C16261T √ A16293C √ G16310A √ 2 DT-06 C16192T √ 4 T16288C √ T16304C √ A16309G √ 3 DT-07 T16104C √ 3 A16182C √ T16189C √ 4 DT-10 G16129A √ 2 T16189C √ 5 DT-11 T16104C √ 3 A16183C √ T16189C √ 6 DT-17 A16158G √ 6 T16217C √ C16223T √ C16234T √ T16288C √ T16362C √ 7 DT-19 T16061G √ 8 T16063G √ C16108T √ G16129A √ A16162G √ T16172C √ C16193T √ T16304C √ Jumlah mutasi 32 1 33
DO NOT COPY
KESIMPULAN
Berdasarkan analisis terhadap urutan HVI mtDNA dari 7 sampel populasi dataran tinggi, diperoleh terdapatnya variasi mutasi. Jenis mutasi yang terjadi adalah subtitusi transisi pada tujuh sampel, subtitusi transversi pada empat sampel, delesi pada satu sampel dan insersi pada satu sampel.
Mutasi T16189C merupakan mutasi dengan frekuensi tertinggi dimana mutasi ini menyebabkan terjadinya rangkaian poli-C. Terdapat tiga sampel yang menunjukkan fenomena C dengan panjang poli-C beragam yaitu 8poli-C, 12poli-C dan 13poli-C.
Berdasarkan perbandingan data mutasi sampel dengan data yang telah dipublikasikan di situs database mitomap, terdapat satu mutasi yang belum dipublikasikan, yaitu T16063G. Hasil analisis menunjukkan mutasi ini diduga sebagai kandidat mutasi spesifik. Secara keseluruhan, hasil penelitian ini dapat menjadi gambaran awal profil genetik populasi dataran tinggi berdasarkan analisis mtDNA. DAFTAR PUSTAKA
Chen, Jin-Bor et al. (2009). “Lack of association between mutations of gene-encoding mitochondrial D310 (displacement loop) mononucleotide repeat and oxidative stress in chronic dialysis patients in Taiwan”. Journal of Negative Results in BioMedicine 2009, 8:10.
Gumilar, G., (2005), Varian Non Delesi 9 Pasang Basa DNA Mitokondria Manusia, Tesis pada Departemen Kimia Institut Teknologi Bandung: tidak diterbitkan.
Halimatul, H.S., Syukriani, Y.F., Noer, A.S., Gumilar, G., (2009), “Profile of mtDNA ATPase 6 Gene in Human Population of High Altitude”, Biosainstifika, 2, 1, 83-95.
Martin D. and Windsor J., (2008), “From mountain to bedside: understanding the clinical relevance of human acclimatisation to high-altitude hypoxia”. Postgrad Med J., 84, 622–627.
Murakami, H., Ajisaka, R., Hayashi, J., Kuno, S., (2006), “The Influence of ATP Synthase 8, 6 Gene Polymorphisms on the Individual Difference of Endurance Capacity or its Trainability”, International Journal of Sport and Health Science, 4, 472-479. Nurafianti, W., (2010). Variasi Mutasi
Daerah Hipervariabel I DNA Mitokondria Manusia pada Populasi Dataran Rendah. Skripsi pada Program Studi Kimia FPMIPA Universitas Pendidikan Indonesia: tidak diterbitkan.
Pelupessy, Wendri Wildiartoni Pattiawira, (2010), Ketinggian dan dampaknya Terhadap Tubuh
Manusia. Medical Article
[Online], Tersedia: http://jembatankesehatan.com/ta
g/dr-wendri-wildiartoni-pattiawira pelupessy/ [12 Agustus 2010].
Simonson TS, Yang Y, Huff CD, Yun H, Qin G, Witherspoon DJ, Bai Z, Lorenzo FR, Xing J, Jorde LB, Prchal JT, Ge R., (2010), “Genetic evidence for high-altitude adaptation in Tibet”, Science, 329 (5987):72-5, Epub 2010 May 13.
