I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang
Klasifikasi bakteri secara filogenetik dapat dilakukan melalui analisis taksonomi molekular (Sembiring, 2010). Data yang digunakan adalah sekuens gen yang mengkode 16S rRNA (16S rDNA) pada masing-masing strain yang akan diklasifikasikan. Woese pada tahun 1980-an telah dapat menyimpulkan bahwa perbandingan filogenetik berdasarkan bagian conserved dari genom lebih stabil daripada klasifikasi berdasarkan pada sifat-sifat fenotipik (Woese, 1987). Oleh karena itu, penggunaan molekul rRNA disebarluaskan untuk pembuatan perbandingan filogenetik, dan gen 16S rRNA (1650 bp) adalah marker yang paling umum digunakan dalam bidang sistematika mikrobia (Prakash et al., 2007).
Molekul 16S rRNA terdiri atas daerah variabel dan daerah conserved, dan primer universal untuk amplifikasi gen 16S rRNA biasanya dipilih dari daerah conserved sedangkan daerah variabel digunakan untuk taksonomi perbandingan (Prakash et al., 2007). Langkah awal dalam klasifikasi filogenetik adalah mengisolasi dan memurnikan DNA kromosomal dari masing-masing strain. Gen 16S RNA selanjutnya diamplifikasi dengan teknik PCR (polymerase chain reaction) dari masing-masing sampel DNA kromosomnya. Hasil amplifikasi tersebut dimurnikan untuk disekuensing.
Klasifikasi filogenetik dilakukan melalui konstruksi phylogeny tree. Phylogeny tree yang diperoleh merupakan hasil klasifikasi yang menunjukkan hubungan filogenetik masing-masing strain bakteri yang diklasifikasikan. Terdapat 4 tahapan dalam mengkonstruksi phylogeny tree yang didasarkan atas data sekuens 16S rDNA, yaitu:
a. Preparasi sekuens 16S rDNA b. Aligment sekuens 16S rDNA c. Konstruksi phylogeny tree
d. Konstruksi matriks similaritas dan perbedaan nukleotida 16S rRNA.
Tujuan dari praktikum ini adalah mengetahui cara dan tahapan analisis kekerabatan bakteri dengan metode filogenetik molekuler.
A. Materi
Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini antara lain sekuesn nukleotida mikroba yang diujikan, dan komputer yang memiliki program PFE, MVSP, ClustalX, MEGA dan Ms.Words.
B. Metode
Metode yang digunakan dala praktikum taksonomi numerik-fenetik adalah sebagai berikut :
a. Koleksi data
1. Data sekuens 16S rRNA dari 15 isolat Flavobacetrium sp. dan satu isolat Pseudomonas sp. (outgroup) di download dari situs ncbi.
2. Masing-masing dicopykan ke program Words atau Notepad. Data tersebut berupa text file dan disimpan sebagai file.
b. Preparasi sekuens 16S rRNA
1. Data sekuens di atas selanjutnya dibuka dengan PFE (Programmer File Editor) dan sekuens dari masing-masing isolat diberi kode nama pada bagian depan sekuens (misal ‘flav 1, flav 2 dan seterusnya).
2. Selanjutnya di depan kode sekuens diberi tanda fasta format (>), hal ini agar dapat dibaca oleh program yang untuk melakukan alignment yaitu CLUSTALX.
3. Selanjutnya file disimpan dan diberi kode nama (save as), file ini sudah dalam bentuk fasta format file yang siap diload ke dalam CLUSTALX untuk dilakukan alignment.
c. Alignment sekuens 16S rDNA (ClustalX)
1. Data sekuens dari masing-masing strain (Cara kerja b) di load ke dalam program CLUSTALX untuk di align. Alignment bertujuan untuk menata sekuens agar satu sama lain diletakkan sesuai dengan posisi homologi antar sekuens. Artinya, daerah homolog harus diletakkan pada posisi yang sama (conserved region dengan conserved region, variable region dengan variable region). Dengan alignment antar sekuens gen 16S rRNA dari masing-masing strain dapat dibandingkan. Semua sekuens yang dialignment ditata dalam satu file oleh program ClustalX sebagai output file dalam beberapa pilihan format. Agar file hasil alignment dapat dibaca
oleh program MEGA dan PHYLIP yang digunakan untuk mengkonstruksi phylogeny tree berdasarkan sekuens tersebut, maka file ini dibuat dalam phylip format (file name.phy). Hal ini dapat dilakukan dengan memilih format output file pada waktu melakukan alignment dalam CLUSTALX. 2. Output file ini disimpan dalam direktori CLUSTALX (Misal
C:\ClustalX\Flav.phy), sehingga setelah alignment dapat dicari hasil alignment berupa file yang diberi nama seperti contoh, dalam direktori ClustalX.
3. File ini selanjutnya digunakan untuk mengkonstruksi phylogeny tree dengan program MEGA atau PHYLIP.
d. Konstruksi Phylogeny Tree
Program MEGA 3.0.1
Seluruh sekuens 16S rDNA hasil alignment digunakan untuk mengkonstruksi phylogeny tree dengan program Mega 3.0.1.
1. Program Mega 3.0.1 dibuka, pilih alighment, lalu alighment explorer, kemudian pilih retrieve.
2. Selanjutnya mengambil file dengan format “.aln” hasil dari Clustalx. Klik file, lalu pilih Export alighment, pilih Mega format, dan save. Close, kemudian ketik 16S lalu “OK”, kemudian “no” dan pilih close.
3. Selanjutnya muncul perintah open data in mega? Pilih “yes”, lalu minimize.
4. Pilih phylogeny, Construct phylogeny, pilih Neighbor Joining, lalu Test phylogeny, Bootstrap dengan replikasi 1000. Selanjutnya pilih compute.
II. HASIL DAN PEMBAHASAN
fl4 fl12 fl14 fl9 fl10 fl1 fl11 fl2 fl5 xant fl7 fl3 fl8 fl6 fl13 al15 96 99 64 65 90 46 30 24 52 87 45 51 29
Gambar 1. Hasil Dendogram Isolat Flavobacterium sp.
B. Pembahasan
Taksonomi numerik merupakan kajian kekerabatan taxa yang mengacu berdasarkan nilai similaritas. Taksonomi numerik digunakan untuk memperoleh suatu klasifikasi yang bersifat lebih teliti, dan padat informasi. Taksonomi numerik diawali dengan analisis karakter yang diuji dari berbagai uji yang menghasilkan data fenotip yang beragam, data fenotip yang didapat, akan diolah lebih lanjut sehingga menghasilkan koefisien similaritas, yaitu sebuah fungsi yang
mengukur tingkat kemiripan yang dimiliki oleh dua atau lebih stain mikroba yang dibandingkan (Edwards dan Cavalli, 1964). Taksonomi numerik juga dikenal sebagai taksonomi Adansonian. Taksonomi numerik ini berdasarkan atas lima prinsip utama, yaitu taksonomi ideal merupakan taksonomi yang mengandung informasi terbesar, dimana masing-masing karakter diberi nilai yang setara dalam mengkonstruksikan takson yang bersifat alami, tingkat kedekatan antara dua strain merupakan fungsi proporsi similaritas sifat yang dimiliki bersama, taksa yang berbeda dibentuk berdasarkan atas sifat yang dimiliki, dan similaritas tidak bersifat filogenetik melainkan bersifat fenetik (Boone & Castenholz, 2001).
Koefisien ini terdiri atas dua jenis yaitu, Simple Matching Coeficient (Ssm) dan Jaccard Coeficient (SJ). Ssm merupakan koefisien similaritas yang umum digunakan pada ilmu bakteriologi untuk mengukur proporsi karakter yang sesuai, baik hubungannya bersifat ada (positif) maupun tidak ada (negatif). Sedangkan SJ dihitung tanpa memperhitungkan karakter yang tidak dimiliki oleh kedua organisme tersebut (Edwards dan Cavalli, 1964). Koefisien Asosiasi Ssm semua sifat yang ada dilihat dan digunakan, sedangkan pada SJ tidak memperhatikan sifat yang sama-sama tidak dimiliki. Kemudian dari matriks IS tersebut, akan diperoleh dendogram (Felsenstein, 2004).
Sebanyak-banyaknya sifat (minimal 50 sifat) dari organisme yang akan dikelompokkan kemudian dicari indeks similaritas (IS) dari satu organisme terhadap organisme lain dalam daftar organisme yang akan dikelompokkan (disebut OTUs). Pengamatan meliputi sifat morfologi, baik koloni maupun sel dan dilanjutkan dengan pengujian sifat biokimia. Proses pengklasteran dalam melakukan analisis taksonomi numerik dapat dilakukan dengan cara, langkah pertama menentukan minimal 10 isolat dan 30 karakter dalam proses analisis. Kemudian, dibuat tabel n x t pada Microsoft Excel dengan n sebagai jumlah karakter, dan t sebagai jumlah isolat. Setelah itu, seluruh matrix di copy dan masukkan dalam aplikasi PFE. Kemudian, ketik rumus *L t n nilai + diganti menjadi 1, dan nilai – diganti jadi 0. Langkah selanjutnya, di save dengan format “.mvs”. Langkah selanjutnya, masuk dalam program MVSP yang bertujuan untuk mendapatkan index similiarity dan nilai koefisien, serta dendogramnya. Program MVSP dibuka kemudian pilih menu analysis kemudian, pilih cluster analysis dan
pilih UPGMA dan pilih Simple Matching Koefisien dan Jaccard Koefisien. setelah itu akan muncul dendogramnya.
Prinsip pengklasteran ini didasarkan pada OTU (Operational Taxonomic Unit), clustering ini dilakukan dengan mencari similaritas paling tinggi yang menunjukan besarnya kemungkinan dua strain merupakan satu spesies. Pada percobaan ini digunakan UPGMA. Konstruksi dendogram dibuat berdasarkan pengklasteran yang telah dilakukan. Dengdogram merupakan hal penting sebagai alat untuk mempermudah membaca hasil taksonomi numerik fenetik. Garis – garis pada dendogram menunjukan sejumlah strain yang satu spesies. Setelah itu dilakukan analisis cophenetic-correlation-coefficient atau nilai koefisien korelasi. Perhitungan koefisien korelasi dilakukan untuk mengetahui validitas konstruksi dendrogram. Nilai koefisien korelasi yang > 60% diasumsikan sebagai konstruksi dendogram yang dapat diterima. Nilai koefisien korelasi dapat diterima dan dipertanggungjawabkan klasifikasinya jika didapatkan hasil > 70%. Hasil menggunakan Simple Matching Coefficient menunjukan perbedaan dengan menggunakan Jaccard’s Coefficient. Hal ini dikarenakan Simple Matching Coefficient merupakan koefisien similaritas yang umum digunakan untuk mengukur proporsi karakter yang sesuai, baik hubungannya bersifat ada (positif) maupun tidak ada (negatif). Sedangkan Jaccard’s Coefficient mengabaikan karakter-karakter yang negatif pada kedua spesies, hanya memuat proporsi yang sesuai untuk karakter positif saja (Bayane et al., 2010).
Berdasarkan hasil praktikum kali ini Isolat yang dibandingkan ialah Penicillium sejumlah 10 strain, terdiri dari P. expansum, P. solitum, P. chrysogenum, P. echinulatum, P. olivinoviride, P. hirtusum, P. hordei, P. camembertii, P. verrucosum, dan P. claviforme. 30 karakter yang dibandingkan antara lain kemampuan hidup pada suhu 37˚C, asam laktat, hidrolisis kasein, ada/tidaknya percabangan, dan gentisyl alkohol (Bridge et al., 1989). Hasil analisis Jaccard’s dan Simple Matching menunjukkan perbedaan seperti yang terlihat pada dendogram. Jaccard’s menunjukkan adanya dua kubu besar Penicillium yang terpisah menjadi kelompok 1 (P. hirtusum, P. olivinoviride, P. camembertii, P. chrysogenum) dan kelompok 2 (P. expansum, P. solitum, P. echinulatum, P. hordei, P. verrucosum, P. claviforme), sedangkan Simple
Matching menunjukkan terpisahnya P. expansum dari mayoritas strain lainnya, ditambah P. solitum sebagai outgroup. Perbedaan ini dapat terjadi karena sistem penilaian karakter pada Jaccard’s dan Simple Matching berbeda. Koefisien korelasi antara Jaccard’s dan Simple Matching berbeda, yaitu 0,8050491815 untuk Jaccard’s Coefficient dan 0,8408615513 untuk Simple Matching Coefficient. Terdapat perbedaan antara analisis fenetik Jaccard’s dan Simple Matching terlihat contohnya pada hubungan kekerabatan P. camembertii dan P. chrysogenum. Jaccard’s coefficient menyatakan P. camembertii dan P. chrysogenum memiliki hubungan kekerabatan sekitar 80%, sedangkan pada Simple Matching coefficient dinyatakan sekitar 84%. Berdasarkan kedua koefisien korelasi tersebut, maka bisa dikatakan bahwa kedua strain ini memiliki kekerabatan yang tinggi (Bridge et al., 1989).
IV. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan maka dapat disimpulkan bahwa : 1. Koefisien korelasi Simple Matching menunjukkan nilai yang lebih tinggi
dibanding Jaccard’s, yaitu 0,8408615513 berbanding 0,80504918.
2. Taksonomi Numerik membutuhkan program komputer berupa Excell, PFE, MVSP, Words, dan Paintshop Pro.
B. Saran
Jurnal yang dipakai untuk praktikumnya mungkin lebih baik jika 1 kelompok 1 jurnal tidak 1 orang 1 jurnal agar lebih efisien dalam pengerjaannya tidak memakan waktu yang lama. Terima kasih sudah membagi ilmunya, semoga lebih baik lagi di praktikum selanjutnya.
DAFTAR REFERENSI
Bayane, A., B. Diawara, R. D. Dubois, J. Destain, D. Roblain, and P. Thonart. 2010. Isolation and Characterization of New Spore-forming Lactic Acid Bacteria with Prospects of Use in Food Fermentation and Probiotic Preparation. African Journal of Microbiology Research4(11): 1016-1025. Boone, R. D. and R. W. Castenholz. 2001. Bergey’s Manual Of Systematics
Bacteriology. 2nd edition. Springer, New York.
Bridge, P. D., D. L. Hawksworth, Z. Kozakiewicz, A. H. S. Onions, R. R. M. Paterson, M. J. Sackin, & P. H. A. Sneath. 1989. A Reappraisal of the Terverticillate Penicillia Using Biochemical, Physiological and
Morphological Features I. Numerical Taxonomy. Journal of General Microbiology, 135: 2941 – 2966.
Edwards, A. W. F. and Cavalli-Sforza, L. L. 1964. Reconstruction of phylogenetic trees. in Phenetic and Phylogenetic Classification. ed. Heywood, V. H. and McNeill. London: Systematics Assoc. Pub No 6.
Felsenstein, J. 2004. Inferring Phylogenies. Sinauer Associates, Sunderland. Harly, J. P. 2005. Laboratory Exorcises in Microbiology sixth Edition. McGraw
Hill Companies, inc, 1211, Avence of the Amonical. New York. Holland, S. M. 2006. Cluster Analysis. University of Georgia. Athens.
Pelczar, M.J. dan E.S. Chan.1993. Dasar-dasar Mikrobiologi I. UI Press. Jakarta. Sembiring, L. 2003. Petunjuk Praktikum Sistematik mikrobia. Laboratorium
Mikrobiologi, UGM, Yogyakarta.
Sembiring, L. 2011. Petunjuk Praktikum Sistematik mikrobia. Laboratorium Mikrobiologi, UGM, Yogyakarta.
Suprapto, S., T. Gunaedi, dan B. T Rumahorbo. 2014. Aktivitas Enzim Amilase Isolat Bakteri Amilolitik dari Tepung Sagu Basah dan Lingkungan Tempat Penyediaannya Secara Tradisional di Jayapura. Jurnal Biologi Papua, 6(2): 101-104.
Oleh :
Nama : Silviyatun Ni’mah
NIM : B1J013016
Kelompok : 1 Rombongan : I
Asisten : Hedi Susanto
LAPORAN PRAKTIKUM SISTEMATIKA MIKROBA
KEMENTERIAN RISET TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO
