IDENTIFIKASI DAN UJI BIOAKTIVITAS
GROWTH FACTOR
DAN
HORMON STEROID SEKS HASIL BIAKAN
MONOLAYER
SEL
HEPAR DAN SEL KUMULUS SAPI
MULYATI, SRI
Promotor : Prof. Dr. Laba Mahaputra, drh., M.Sc.
ESTROGEN; PROGESTERONE; LIVER CELL
KKA KK Dis K 31/12 Mul i
Copyright© 2011 by Airlangga University Library Surabaya
ABSTRACT
IDENTIFICATION AND BIOACTIVITY TEST OF GROWTH FACTOR AND SEX STEROID HORMONE PRODUCED BY BOVINE LIVER AND CUMULUS
CELL MONOLAYER CULTURE
as supplemen media in in vitro fertilization and embryo development as well as able to reduce the incidence of apoptosis in embryo resulted.
Keywords : IGF-1, estrogen, progesterone, monolayer culture, liver cell (hepatocyte), cumulus cell.
SUMMARY
IDENTIFICATION AND BIOACTIVITY TEST OF GROWTH FACTOR AND SEX STEROID HORMONE PRODUCED BY BOVINE LIVER AND CUMULUS
CELL MONOLAYER CULTURE
The implementation of biotechnology is an attemp for increasing the efficiency of
livestock reproduction particularly to obtain good quality and quantity livestock. Embryo
transfer is one technique considered efficient and effective in the area of reproduction.
The success of this technology requires quality embryos. In vivo embryo production is
limited by the ability of donor females in producing embryo. For this case, in vitro
embryo production is an alternative source of embryo.
Growth factors i.e. Insulin-Like Growth Factor-I (IGF-I) and estrogen are two
mitogenic substances that have been proved can be used to stimulate and accelerate cell
growth.
IGF-I or somatomedin is a polypeptide growth factor secreted by liver and a
various tissue in response to growth hormone stimulation. IGF-I contains 70 amino acids
with a molecular weight of 7649 Dalton or 7.65 kDa. Estrogen is a steroid hormone
especially produced by growing follicles in the ovary, corpora lutea and placenta with a
molecular weight of 300–400 Dalton (272.3 Dalton). IGF-I and estrogen through
paracrine, autocrine and endocrine manners stimulate mitogenic activities in proliferating
cells.
Liver and ovary are organs that can produce IGF-I and estrogen. Liver is the main
IGF-I producer while ovary is the main producers of sex steroid estrogen and both of
them can be developed through monolayer cell culture with the supplementation of Foetal
Calf Serum (FCS) or Bovine Serum Albumine (BSA) as precursor substances at
From the descriptions, research has been conducted purposively to quantify the
concentration of IGF-I and steroid sex hormone estrogen and progesterone in the media
of liver and cumulus cell monolayer culture that used liver and ovaries of cattle
slaughtered in abattoir.
This research was conducted in stages. The first stage was the production and
harvest of liver and cumulus cell monolayer culture. Liver culture was prepared by
grinding liver tissue trypsination and repeated centrifugation until liver cells
(hepatocytes) were obtained. Cumulus cells were obtained from aspirating follicles with
diameter 2-6 mm. Then liver and cumulus cells were cultured separately in TCM 199 +
FCS 10 % + BSA 10 %. Cell culture concentration was 1.9 x 106/ml medium then was
incubated in an incubator at 38.5 oC, 5 % CO2 in air for 3, 6, 9 and 12 days. The second
stage was the quantification of IGF-I concentration in the media of liver and cumulus cell
monolayer culture measured by Immuno Radio Metric Assay (IRMA), estrogen and
progesterone measured with Radio Immuno Assay (RIA). The third stage was the
separation or absorbtion of progesterone that is an anti-mitogenic substance from IGF-I
and estrogen that were mitogenic substances by binding progesterone using
anti-progesterone (anti-P4) coated polysterene tube. The next stage was examining the
bioactivity of IGF-I and estrogen produced in this study as supplement media at
fertilization and culture media by observation of embryo cleavage (2-8 cells embryo) and
embryo develop into morula stage (6 days after in vitro fertilization). The last stage was
examining is bioactivity test of IGF-I and estrogen mitogenic agent with observation
reduction the occurence apoptosis of embryo in in vitro fertilization result.
Statistical analysis using factorial F-test (Anava) showed that in Stage 1 the mean
of cumulus cell culture cell number was 62.66% and was significantly higher (p<0.05)
than those of the liver cells’, which was 58.44%. Double comparison test with 5%
honesty significant difference (HSD) against culture periods showed that the highest
concentration was 70.94% which was found in day-6 culture and the lowest concentration
was 44.69% which was found in day-12 culture. There was a significant difference
(p<0.05) between these two concentrations.
Results from Stage 2 showed that IGF-I concentration in liver cell culture media
Estrogen and progesterone concentrations in cumulus cell culture media were
respectively 126.83 pg/ml and 3.21 ng/ml which were very significantly higher (p<0.01)
than those of the liver cells’ (60.44 pg/ml and 0.89 ng/ml). The highest concentration of
IGF-I and estrogen were respectively 175.53 ng/ml and 127.19 pg/ml which were found
in day-6 culture while the lowest concentration of IGF-I and estrogen were respectively
18.94 ng/ml and 53.00 pg/ml which were found in day-12 culture. There were significant
differences (p<0.05) between them. The highest progesterone concentration was 3.281
ng/ml which was found in day-3 culture while the lowest concentration was 1.100 ng/ml
which was found in day-12 culture. These concentrations were significantly different
(p<0.05). It was also found that IGF-I, estrogen and progesterone cells of origin and
culture periods had a very significant interaction (p<0.01).
In Stage 3 statistical analysis using independent t-test showed that the
effectiveness of the use of anti-P4 for the absorbtion of progesterone in liver and
cumulus cell culture media were respectively 58.43% and 60.86% that were not
significantly different (p>0.05).
The results of Stage 4 research showed that the mean number of embryos
underwent cleavage into 2-8 cells in fertilization media contain IGF-1 and estrogen from
liver and cumulus cells were respectively 40.87% and 40.23% which were not differ
significantly (p>0.05). Meanwhile the mean number of embryos underwent cleavage
before and after absorbtion using antiprogesterone were 27.48% and 53.61% respectively
which were significantly different (p<0.01). The mean number of embryos develop into
morula in the culture contained IGF-1 growth factor and estrogen from liver and cumulus
cells were 17.14% and 16.18% which were not different respectively significantly
(p>0.05). Meanwhile, embryos developed into morula as supplemen media before and
after absorbtion were respectively 5.73% and 27.59% which were significantly different
(p<0.01).
Results from Stage 5 research were the mean of apoptosis incidence in embryos
cultured in media contain growth factor IGF-1 and estrogen from monolayer culture of
liver (P1) and cumulus cells (P2) respectively 23.72% and 31.01% which were not
and estrogen (P0) was 70.58% which were signicantly different to (P1) and (P2)
(p<0.05).
From the result of the research it could be conducted that IGF-1 and estrogen which
were mitogenic materials and progesterone which was an antimitogenic material could be
produced through monolayer culture of liver and cumulus cells of cattle, and
progesterone could be separated from IGF-1 and estrogen by binding/absorbtion using
antiprogesterone (antiP4). Growth factor IGF-1 and estrogen from in vitro monolayer
culture of liver and cumulus cells could be used as a supplementation media for bovine in
vitro fertilization and embryo culture. Therefore resulted better cleavage and embryo
development and inhibit the occurence of apoptosis in in vitro derived bovine embryos.
RINGKASAN
IDENTIFIKASI DAN UJI BIOAKTIVITAS GROWTH FACTOR DAN HORMON
STEROID SEKS HASIL BIAKAN MONOLAYER SEL HEPAR DAN SEL
KUMULUS SAPI
Penerapan bioteknologi merupakan upaya meningkatkan efisiensi reproduksi ternak
terutama guna mendapatkan ternak dengan kualitas dan kuantitas yang baik. Embrio
transfer merupakan salah satu cara yang dipandang efisien dan efektif dalam bidang
reproduksi. Keberhasilan hal tersebut membutuhkan embrio yang berkualitas. Produksi
embrio secara in vivo terbatas oleh kemampuan ternak betina donor untuk menghasilkan
embrio. Untuk itu produksi embrio secara in vitro merupakan suatu alternatif produksi
embrio.
Faktor pertumbuhan atau Growth Factor yaitu Insulin-like Growth Factor-1
(IGF-1) dan hormon estrogen merupakan bahan yang bersifat mitogenik telah terbukti dapat
digunakan untuk merangsang dan mengatur pertumbuhan sel.
Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) atau somatomedin adalah polipeptida growth
factor yang disekresikan oleh hati dan berbagai jaringan sebagai respon dari rangsangan
growth hormon. IGF-1 tersusun atas 70 asam amino dengan berat molekul 7649 Dalton
atau 7,65 kDa. Hormon estrogen adalah termasuk dalam hormon steroid, terutama
diproduksi oleh folikel yang sedang berkembang di dalam ovarium, korpus luteum, dan
bekerja secara parakrin, autokrin dan endokrin dalam merangsang aktivitas mitogenik
pada sel yang sedang mengalami proliferasi.
Hepar dan ovarium merupakan bahan yang dapat memproduksi IGF-1 dan estrogen.
Hepar merupakan penghasil utama IGF-1, sedangkan ovarium merupakan penghasil
utama steroid seks estrogen. Tetapi keduanya dapat dihasilkan oleh organ tersebut dan
dapat dikembangkan melalui kultur monolayer dengan penambahan bahan prekursor
berupa Foetal Calf Serum (FCS) atau Bovine Serum Albumin (BSA) pada biakan
monolayer yang digunakan.
Berdasarkan uraian tersebut, maka telah dilakukan penelitian dengan tujuan untuk
memproduksi faktor pertumbuhan IGF-1 dan steroid seks estrogen dan progesteron dari
cairan hasil kultur monolayer sel hepar dan sel kumulus dengan memanfaatkan bahan
berupa hepar dan ovarium sapi yang dipotong di Rumah Potong Hewan (RPH).
Penelitian ini dilakukan secara bertahap, tahap 1 adalah pembuatan dan pemanenan
cairan hasil kultur monolayer sel hepar dan sel kumulus. Kultur sel hepar dibuat dengan
menggerus hepar kemudian dilakukan tripsinasi, kemudian disentrifugasi berulang-ulang
sehingga diperoleh sel hepar (hepatosit). Sel kumulus diperoleh dengan cara aspirasi
folikel dengan diameter 2-6 mm. Kemudian sel hepar dan sel kumulus masing-masing
dikultur dalam media TCM 199 + FCS 10 % + BSA 10 %. Konsentrasi sel kultur adalah
1,9x106 sel/ml media, lalu diinkubasi dalam inkubator 38,5oC 5 % CO2 selama 3, 6, 9,
dan 12 hari. Tahap ke 2 adalah pengukuran konsentrasi IGF-1 dalam cairan hasil kultur
dengan teknik Immuno Radio Metric Assay (IRMA), sedangkan konsentrasi estrogen dan
progesteron diukur dengan teknik Radio Immuno Assay (RIA). Tahap ke 3 adalah
pemisahan/absorbsi progesteron yang merupakan bahan antimitogenik dari IGF-1 dan
estrogen yang merupakan bahan mitogenik dengan cara mengikat progesteron dengan
antiprogesteron (antiP4) dalam tabung coated polyesterene. Tahap selanjutnya adalah
menguji bioaktivitas faktor pertumbuhan IGF-1 dan estrogen produk penelitian sebagai
suplemen media pada fertilisasi dan kultur embrio in vitro dengan melihat adanya
cleavage dan perkembangan embrio sampai stadium morula (6 hari setelah fertilisasi in
vitro). Tahap terakhir adalah menguji bioaktivitas IGF-1 dan estrogen sebagai bahan yang
bersifat mitogenik dan antiapoptotik dengan melihat penurunan kejadian apoptosis pada
Berdasarkan analisis statistik dengan uji F (Anava) Faktorial, hasil penelitian tahap
1 menunjukkan bahwa rerata jumlah sel hasil kultur sel kumulus adalah 62,66% dan lebih
tinggi daripada sel hepar yaitu 58,44% dengan signifikansi (p<0,05). Berdasarkan uji
perbandingan honesty significant different (HSD) 5% terhadap lama kultur, kadar
tertinggi diperoleh dari lama kultur 6 hari yaitu 70,94% dan terendah pada lama kultur
kultur 12 hari yaitu 44,69% dan berbeda signifikan (p<0,05).
Hasil penelitian tahap 2 menunjukkan bahwa, konsentrasi IGF-1 hasil kultur
monolayer sel hepar adalah 108,98 ng/ml dan lebih tinggi dari pada sel kumulus yaitu
69,67 ng/ml, sedangkan konsentrasi estrogen dan progesteron hasil kultur sel kumulus
masing-masing adalah 126,83% pg/ml dan 3,21 ng/ml lebih tinggi daripada sel hepar
yaitu 60,44 pg/ml dan 0,89 ng/ml, dan menunjukkan perbedaan sangat signifikan
(p<0,01). Konsentrasi IGF-1 dan estrogen berdasarkan perbedaan lama inkubasi
diperoleh hasil tertinggi dari lama inkubasi 6 hari masing-masing yaitu 175,53 ng/ml dan
127,19 pg/ml, sedangkan konsentrasi terendah pada inkubasi 12 hari masing-masing
18,94 ng/ml dan 53,00 pg/ml, dan berbeda secara signifikan (p<0,05). Konsentrasi
progesteron berdasarkan lama masa inkubasi diperoleh hasil tertinggi dari kultur 3 hari
yaitu 3,28 ng/ml, sedangkan terendah dari kultur 12 hari yaitu 1,10 ng/ml dan berbeda
secara signifikan (p<0,05). Diketahui pula bahwa konsentrasi IGF-1, estrogen dan
progesteron antara asal sel dan lama kultur menunjukkan interaksi yang sangat signifikan
(p<0,01).
Hasil penelitian tahap 3 berdasarkan analisis statistik dengan uji t tak berpasangan
(independent t test) menunjukkan bahwa efektivitas absorbsi progesteron dengan
antiprogesteron antara sel hepar dan sel kumulus adalah 58,43 % dan 60,86% dan tidak
berbeda secara signifikan (p>0,05).
Hasil penelitian tahap 4 menunjukkan bahwa rerata jumlah embrio yang mengalami
cleavage 2 – 8 sel pada media fertilisasi mengandung IGF-1 dan estrogen antara sel hepar
dan sel kumulus, masing-masing adalah sebesar 40,87 % dan 40,23 % yang tidak berbeda
secara signifikan (p>0,05). Sedangkan antara sebelum dan sesudah absorbsi dengan
antiprogesteron adalah 27,48 % dan 53,61 %, yang berbeda sangat signifikan (p<0,01).
Rerata jumlah embrio yang berkembang menjadi stadium morula pada kultur yang
masing-masing adalah 17,14 % dan 16,18 % yang tidak berbeda secara signifikan
(p>0,05). Sedangkan embrio yang berkembang menjadi morula pada media sebelum dan
sesudah absorbsi dengan antiprogesteron, masing-masing adalah 5,73 % dan 27,59 %,
yang berbeda sangat signifikan (p<0,01).
Hasil penelitian tahap 5 adalah rerata kejadian apoptosis pada embrio yang dikultur
pada media yang mengandung growth factor IGF-1 dan estrogen hasil kultur monolayer
sel hepar (P1) dan sel kumulus (P2), masing-masing adalah 23,72 % dan 31,01 %, yang
tidak berbeda secara signifikan (p>0,05). Sedangkan embrio yang dikultur pada media
yang tidak mengandung IGF-1 dan estrogen (P0) adalah sebesar 70,56 % dan berbeda
secara signifikan dengan (P1) maupun (P2) (p<0,05).
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa IGF-1 dan estrogen yang merupakan
bahan bersifat mitogenik, serta progesteron yang bersifat antimitogenik dapat diproduksi
melalui kultur monolayer sel hepar dan sel kumulus sapi, dan progesteron dapat
dipisahkan dari IGF-1 dan estrogen dengan cara mengikat/mengabsorbsi dengan
antiprogesteron (antiP4). Faktor pertumbuhan IGF-1 dan estrogen hasil kultur monolayer
sel hepar dan sel kumulus secara in vitro dapat digunakan sebagai suplemen media pada
fertilisasi dan kultur embrio sapi in vitro, sehingga menghasilkan cleavage dan
perkembangan embrio yang lebih baik, dan dapat menghambat kejadian apoptosis pada
