i Skripsi
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi ( S. Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Elisabeth Estelita Septriani
NIM: 058114148
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
ii Skripsi
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi ( S. Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Elisabeth Estelita Septriani
NIM: 058114148
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
v
vi
rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul : “Isolasi dan Identifikasi Saccharomyces cerevisiae yang Diperoleh dari PG-PS Madukismo Yogyakarta yang Digunakan dalam Proses Fermentasi Alkohol”.
Penyusunan skripsi ini dilakukan untuk memenuhi syarat memperoleh
gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Skripsi ini dapat diselesaikan dengan baik berkat bantuan, dorongan, bimbingan, dan perhatian serta kemudahan dari
berbagai pihak. Untuk itu penulis menghaturkan rasa terima kasih kepada:
1. Tuhan Yesus Kristus yang telah melimpahkan segala rahmat dan karunia-Nya untuk setiap umat-karunia-Nya.
2. Bapak, Ibu, kakak-kakakku yang selalu memberikan doa, semangat, dan dukungan baik moril maupun materiil.
3. Ibu Maria Dwi Budi Jumpowati, S.Si., selaku dosen pembimbing yang dengan penuh kesabaran telah meberikan bimbingan, saran, petunjuk dan arahan dalam penyusunan skripsi ini.
4. Ibu Yustina Sri Hartini,M.Si.,Apt., selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan saran dan masukan kepada penulis.
vii
7. Pihak Laboratorium PG-PS Madukismo Yogyakarta terutama Bapak Eko dan Ibu Hasti. Terima kasih telah membantu dalam pengadaan kultur Saccharomyces cerevisiae dan molase sebagai substrat untuk fermentasi alkohol.
8. Pihak Laboratorium Pangan Gizi PAU Bioteknologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta yang telah membantu dalam pengadaan kultur standar yang digunakan dalam penelitian ini.
9. Mas Sarwanto, Mas Sigit, dan Mas Wagiran selaku Laboran Laboratorium Biologi Farmasi, terima kasih atas bantuan dan kemudahan-kemudahan yang diberikan selama ini.
10.Teman-teman kelompok penelitian: Imel, Ermin, Yuna, Angel, Reni, dan Prima yang telah berjuang bersama. Terima kasih atas kerjasama dan semua bantuannya selama ini.
11.Seseorang yang paling spesial dalam hidupku: Adi Sukma Agung Nugroho yang selalu memberikan doa, semangat, cinta, kesabaran dan dukungan hingga tersusunnya skripsi ini.
viii selama ini.
15.Semua pihak yang telah membantu dan mendukung penulis dalam penyusunan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun demi kesempurnaan penulisan skripsi ini.
Akhir kata, besar harapan penulis semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan dan pengembangan ilmu farmasi.
Yogyakarta, 6 Desember 2008 Hormat penulis,
x
alkohol. Satu-satunya Pabrik Gula dan Pabrik Alkohol/Spiritus di Yogyakarta yang memproduksi alkohol berbahan dasar molase (tetes tebu) dengan proses fermentasi adalah PG-PS Madukismo. Yeast yang digunakan adalah S.cerevisiae yang menghasilkan enzim yang mengubah gula dalam molase menjadi alkohol dan CO2. Sejak tahun 1955 belum pernah dilakukan identifikasi dan determinasi
untuk memastikan apakah strain S.cerevisiae yang digunakan dalam proses fermentasi alkohol masih murni atau tidak. Yeast sebagai agen pemfermentasi yang dapat menghasilkan alkohol harus murni.
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengidentifikasi S.cerevisiae sebagai agen pemfermentasi yang digunakan di PG-PS Madukismo. Pengujian tersebut diharapkan dapat dijadikan informasi untuk produksi alkohol yang dihasilkan sehingga dapat meningkatkan kualitas alkohol.
Penelitian ini termasuk non eksperimental dengan rancangan penelitian eksploratif deskriptif. Tahapan penelitian yang dilakukan adalah isolasi strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo Yogyakarta dengan metode streak platting untuk memisahkan koloni dan memperoleh biakan murni yang lebih spesifik, serta identifikasi berdasarkan ciri morfologi sel, morfologi koloni dan sifat biokimiawinya yang dibandingkan dengan kultur standar (S.cerevisiae ATCC 3015). Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat S.cerevisiae yang diperoleh dari PG-PS Madukismo Yogyakarta merupakan kultur murni yang menghasilkan alkohol di PG-PS Madukismo dan memiliki kesamaan identitas morfologi dan biokimiawi dengan kultur standarnya.
xi
PG-PS Madukismo is the only sugar and alcohol factory in Yogyakarta that produces alcohol using molase as the substrate and process it by fermentation. The yeast that they use is S. cerevisiae which produces enzyme that changes the sugar in the molase to be alcohol and CO2. Since 1955, there were no identification and determination to make sure whether the strain S. cerevisiae in alcohol fermentation process was pure or not. Yeast, as the agent of the fermentetion that can produce alcohol, must be pure.
This research was aimed to isolate and identify S.cerevisiae as the agent of the fermentation in PG-PS Madukismo Yogyakarta so that the product could be optimalized, and the product could be standarized.
This research was non experimental with its explorative descriptive design. Research phases that were conducted were firstly the isolation of strain S.cerevisiae of PG-PS Madukismo using streak platting method to separate the colony and acquire pure culture which was more specific. After that the pure culture was identified based on the cell morphology, colony morphology and the biochemical characteristic which was compared with the standard culture (S.cerevisiae ATCC 3015). The result of the research showed that the isolate S.cerevisiae that was acquired from PG-PS Madukismo Yogyakarta was pure culture that produced alcohol in PG-PS Madukismo and it had the same morphology identity and biochemical characteristic with the standard culture. Keyword: alcohol, molase, PG-PS Madukismo, isolation, identify,
xii
C. Isolasi Mikroba dan Media Pertumbuhan Mikroba... D. Identifikasi Mikrobia………... 11 16 E. Deskripsi Saccharomyces cerevisiae……… 25
F. Landasan Teori………. 27
G. Hipotesis ……….. 29
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian……… 30
xiii
E. Tata Cara Penelitian………. 33
1. Uji Kemurnian Molase……… 33
2. Pembuatan Media Isolasi dan Media Pertumbuhan S.cerevisiae a. Pembuatan Media Agar Tegak, Agar Miring, dan Agar Cawan………. 34
b. Pembuatan Media Cair……… 34
c. Pembuatan Media SDA………. 35
d. Pembuatan Media SDL……….. 35
3. Isolasi S.cerevisiae dengan Metode Streak platting……….. 36
4. Identifikasi S.cerevisiae dengan Pengamatan Morfologi Koloni, Morfologi Sel, dan Sifat Biokimiawi……… 36
a. Morfologi Koloni………... 36
1). Uji O-F (Oksidasi-Fermentasi)……….. 40
2). Uji Fermentasi Gula-gula dan Pembentukan Gas ……… 41
3). Uji Asimilasi Nitrat……… 42
5. Determinasi S.cerevisiae………... 43
F. Tata Cara Analisis Hasil……….. 43
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN……….. 45
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN A.Kesimpulan……… 77
xv
Table II. Hasil Uji Biokimia Isolat strain S. cerevisiae dari PG-PS
Madukismo dan S. cerevisiae ATCC 3015………. 73 Table III. Hasil Identifikasi Isolat strain S. cerevisiae dari PG-PS
xvi
Gambar 2 Bentuk Tepi Koloni yeast………. 18 Gambar 3 Bentuk Koloni yeast……… Gambar 4. Pola Pertumbuhan pada Media Miring... Gambar 5. Pola Pertumbuhan pada Media Tegak... Gambar 6. Pola Pertumbuhan pada Media Cair... Gambar 7. Sel Saccharomyces cerevisiae………
18 19 19 20 27 Gambar 8. Skema Kerja Penelitian……… 44 Gambar 9. Hasil Isolasi strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo
dan S.cerevisiae ATCC 3015 Secara Streak platting
dengan Waktu Inkubasi 24 jam……… 50 Gambar 10. Pengecatan Sederhana Isolat strain S.cerevisiae dari
PG-PS Madukismo dan Isolat S.cerevisiae ATCC
3015……… 61
Gambar 11. Pengecatan Gram Isolat strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dan Isolat S. cerevisiae ATCC 3015…………... 63 Gambar 12. Pengecatan Spora Isolat strain S.cerevisiae dari PG-PS
Madukismo dan isolat S.cerevisiae ATCC
xvii
Lampiran 2: Hasil Pengamatan Morfologi Koloni strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dan S.cerevisiae ATCC 3015…… 81 Lampiran 3: Hasil Uji O-F tanpa paraffin……… 83 Lampiran 4: Hasil Uji O-F dengan paraffin……… 84 Lampiran 5: Hasil Uji Fermentasi Gula-gula dan Pembentukan Gas……. Lampiran 6: Hasil Uji Asimilasi Nitrat……….. Lampiran 7: Surat Keterangan Kerjasama Penelitian...
1
Satu-satunya Pabrik Gula dan Pabrik Alkohol/Spiritus di Propinsi Daerah Istimewa Yogyakarta yang memproduksi alkohol berbahan dasar molase adalah PG-PS Madukismo. Produk yang dihasilkan salah satunya adalah alkohol. Produksi alkohol ini berbahan dasar molase sebagai salah satu sumber karbon organik yang murah dan mengandung glukosa yang cukup tinggi, substansi nitrogen, vitamin, dan mineral serta senyawa yang dapat berfungsi sebagai faktor tumbuh. Molase merupakan hasil samping dari Pabrik Gula Madukismo. Alkohol yang dihasilkan tersebut terdiri dari 70% alkohol murni dengan kadar 95% merupakan alkohol bebas aldehida yang dapat digunakan pada industri minuman, farmasi dan kosmetik, sedangkan 30% alkohol teknis yang masih mengandung aldehida dengan kadar < 95% yang diharapkan dapat diproses menjadi alkohol absolut dan dioptimalkan kualitasnya (Anonim, 1984).
Fermentasi alkohol oleh S.cerevisiae yang digunakan di PG-PS Madukismo Yogyakarta mampu memproduksi alkohol dalam jumlah tinggi yaitu sekitar 25.000 liter alkohol/hari, yang terdiri dari 70% alkohol murni dan 30% alkohol teknis (Anonim, 1984). Keistimewaan lain dari S.cerevisiae adalah memiliki daya fermentasi yang tinggi, selektivitas yang tinggi dalam menghasilkan produk, dapat menguraikan berbagai jenis gula, tahan terhadap kadar etanol yang tinggi yaitu antara 9-10% volume, tahan terhadap kadar glukosa yang tinggi 14-25°Brix, pH optimum pertumbuhan yang rendah 4,5-5, suhu optimum pertumbuhan yang relatif tinggi yaitu 25-30°C, dan akumulasi produk samping yang rendah (Prescott, 1990).
tindak lanjut produksi alkohol yang dihasilkan sehingga dapat meningkatkan kualitas alkohol (Anonim, 1984).
1. Rumusan Permasalahan
Berdasarkan latar belakang tersebut, maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut:
a. Apakah Saccharomyces cerevisiae dari PG-PS Madukismo Yogyakarta yang digunakan dalam proses fermentasi alkohol merupakan kultur murni?
b. Bagaimana identitas S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo Yogyakarta yang merupakan agen pemfermentasi molase untuk meningkatkan kualitas alkohol?
2. Manfaat Penelitian
a. Manfaat teoritis
Sumbangan informasi mengenai identitas atau karakteristik S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo Yogyakarta yang berperan dalam
proses fermentasi alkohol. b. Manfaat praktis
c. Manfaat metodologis
Sumber referensi secara metodologis yang dapat digunakan dan dikembangkan dalam upaya mengisolasi dan mengidentifikasi S.cerevisiae yang berperan dalam proses fermentasi alkohol untuk
peningkata kualitas produksi alkohol di PG-PS Madukismo Yogyakarta. 3. Keaslian Penelitian
Sejauh penelusuran pustaka dan jurnal yang dilakukan oleh penulis, penelitian mengenai isolasi dan identifikasi S.cerevisiae dalam proses fermentasi di PG-PS Madukismo Yogyakarta belum pernah dilakukan.
B. Tujuan Penelitian
1. Tujuan Umum:
Mengoptimalisasi dan meningkatkan kualitas produksi alkohol di PG-PS Madukismo Yogyakarta.
2. Tujuan Khusus:
a. Mengetahui apakah S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo Yogyakarta yang digunakan dalam proses fermentasi alkohol merupakan kultur murni.
5 BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Fermentasi Alkohol
Fermentasi merupakan suatu proses di mana komponen-komponen kimiawi dihasilkan sebagai akibat adanya pertumbuhan maupun metabolisme mikrobia. Fermentasi adalah proses metabolisme oleh mikrobia di mana akan terjadi perubahan-perubahan kimia dalam substrat organik. Perubahan-perubahan kimia tadi tergantung pada macam substrat, macam mikrobia, pH, temperatur, adanya aerasi atau tidak, dan penambahan bahan-bahan tertentu untuk menggiatkan fermentasi. Industri fermentasi sangat tergantung pada mikrobia dan variasi faktor pertumbuhan yang mempengaruhinya (Jimmy, 2008; Tarigan,1988). Kualitas alkohol hasil fermentasi dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain:
1. Agen pemfermentasi
Yeast sebagai agen pemfermentasi yang dapat menghasilkan alkohol harus murni (dari satu strain tertentu) yang telah diketahui sifat-sifatnya. Pada kondisi fermentasi yang diberikan harus mampu menghasilkan perubahan-perubahan yang dikehendaki secara cepat dan hasil yang besar.
2. Substrat
menyediakan nutrien yang cukup untuk pertumbuhan agen pemfermentasi, misalnya, unsur karbon (C), nitrogen (N), fosfor (P), mineral-mineral dan vitamin-vitamin.
3. Lingkungan tempat terjadinya fermentasi.
Lingkungan harus disesuaikan dengan kondisi yang dibutuhkan oleh yeast sebagai agen pemfermentasi. Faktor lingkungan yang perlu dioptimalisasi adalah pH, suhu, dan waktu inkubasi. Untuk fermentasi alkohol, yeast tumbuh dalam keadaan pH rendah antara 4,8-5,0 (suasana asam), maka biasanya ada penambahan asam selama proses, yaitu dengan asam sulfat. Sementara temperatur yang diperlukan berkisar antara 28-30°C (Anonim, 1984).
Fermentasi alkohol adalah proses peruraian gula menjadi alkohol dan karbondioksida yang disebabkan oleh aktivitas sel-sel yeast yang hidup dan berkembangbiak dalam cairan fermentasi tanpa pemberian udara. Cairan ini mengandung suatu zat aktif yang mampu memecah molekul gula dan diberi nama ferment, enzyme atau zymase yang dihasilkan oleh sel-sel yeast yang hidup. Jadi,
proses fermentasi terjadi karena adanya enzim yang dihasilkan oleh yeast (Prescott & Dunn, 1999).
Gambar 1. Skema Proses Fermentasi Alkohol di PG-PS Madukismo Yogyakarta (Anonim, 1984).
B. Yeast
Yeast merupakan mikrobia uniseluler yang ukurannya lebih besar dari
mengandung gula. Yeast yang sering digunakan dalam proses pembentukan alkohol dari molase adalah strain Saccharomyces cerevisiae, yang memiliki daya konversi alkohol paling besar dari spesies lainnya. Mikrostruktur sel yeast terdiri dari kapsul, dinding sel, membran sitoplasma, nukleus, satu atau lebih vakuola, mitokondria, globula lipid, volutin atau polifosfat, dan sitoplasma (Fardiaz, 1992; Prescott & Dunn, 1999).
Penggunaan yeast dalam industri terutama adalah dalam produksi alkohol dari sumber karbohidrat, misalnya pati dan molase. Prinsip fermentasi ini digunakan dalam produksi alkohol, anggur, brem, minuman keras, dan sebagainya. Jika sebagai sumber karbohidrat digunakan pati, misalnya pati jagung, ubi kayu, beras dan pati lain-lainnya, pati tersebut harus terlebih dahulu dihidrolisis menjadi gula-gula sederhana yaitu glukosa (Fardiaz, 1992).
Yeast yang penting dalam industri umumnya mempunyai sifat-sifat
fisiologi yang umum. Yeast yang digunakan dalam proses fermentasi harus memenuhi syarat-syarat yaitu cepat berkembangbiak, tahan pada suhu tinggi, mempunyai sifat yang stabil, tahan terhadap kadar alkohol tinggi. Kebanyakan yeast tumbuh paling baik pada kondisi dengan persediaan air cukup. Tetapi karena
Yeast yang berperan dalam pembuatan alkohol adalah Saccharomyces
cerevisiae dan beberapa jenis lainnya seperti S.anamensis. Pada fermentasi alkohol, alkohol yang dihasilkan itu disebabkan oleh karena S.cerevisiae yang merupakan yeast fermentatif kuat dan dapat mengubah sistem metabolismenya dari jalur fermentatif menjadi oksidatif. Yeast yang bersifat fermentatif jika diberi aerasi aktivitas fermentasinya menurun dan sebagian akan dioksidasi menjadi karbondioksida dan air. S.cerevisiae adalah strain yang memproduksi alkohol jumlah tinggi sehingga sering digunakan dalam produksi alkohol, anggur, dan minuman keras (Fardiaz, 1992).
Kegunaan yeast menjadi semakin penting di dunia industri fermentasi. Saat ini S.cerevisiae tidak saja digunakan dalam bidang fermentasi tradisional, tetapi S.cerevisiae baru yang didapatkan dari riset dan aplikasi bioteknologi telah merambah sektor-sektor komersial yang penting, termasuk makanan, minuman, biofuel, kimia, industri enzim, pharmaceutical, agrikultur, dan lingkungan. Biofuel dalam bentuk etanol merupakan harapan masa depan dari superjamur ini. Alasan utama dari penggunaan etanol adalah sumber energi yang sustainable dan ramah lingkungan, serta sangat menguntungkan secara ekonomi makro terhadap komunitas pedesaan (Narita, 2005).
C. Isolasi Mikrobia dan Media Pertumbuhan Mikrobia
a. Definisi
Mengisolasi suatu mikrobia ialah memisahkan mikrobia tersebut dari lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan. Untuk mencirikan dan mengidentifikasi suatu spesies mikrobia tertentu, pertama-tama spesies tersebut harus dapat dipisahkan dari mikrobia lain yang umum dijumpai dalam habitatnya, lalu ditumbuhkan menjadi biakan murni yaitu biakan di mana sel-selnya berasal dari pembelahan satu sel tunggal (Jutono, Soedarsono, Hartadi, Kabirun, Suhadi, Soesanto, 1980).
b. Metode
Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi mikrobia, fungi, dan yeast yaitu dengan menggunakan metode gores, metode tuang, metode sebar, metode pengenceran serta micromanipulator. Dua di antaranya yang paling sering digunakan adalah teknik metode tuang dan metode gores (Jimmy, 2008).
koloni terpisah dan merupakan biakan murni. Biakan murni adalah biakan yang hanya berasal dari satu jenis mikrobia saja, dan ditandai dengan adanya koloni terpisah yang seragam baik warna, konsistensi, maupun bentuknya. Prinsip metode ini adalah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikrobia pada permukaan medium agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah diinkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel mikrobia, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Rachdie, 2006).
Dalam metode gores, kita akan melihat beberapa koloni. Jika kita akan mengisolasi salah satu dari koloni tersebut maka kita dapat memilih salah satu di antaranya, misalnya koloni yang berwarna kuning. Dengan menggunakan ose, kita buat lagi suspensi dengan air steril untuk kemudian dibuat lagi metode goresan, sehingga kita memperoleh satu macam mikrobia saja (Tarigan, 1988).
Untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikrobia, diperlukan suatu substrat yang disebut media. Sebelum dipergunakan harus dalam keadaan steril, artinya tidak ditumbuhi oleh mikrobia lain yang tidak diharapkan. Penggunaan media bukan hanya untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan mikrobia tetapi juga untuk tujuan-tujuan lain, misalnya untuk isolasi, seleksi, evaluasi dan diferensiasi biakan yang didapatkan (Suriawiria,1986)
1. Bahwa di dalam media harus terkandung semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan mikrobia. 2. Bahwa media harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan
permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikrobia. 3. Bahwa media harus dalam keadaan steril, artinya sebelum ditanami
mikrobia yang dimaksud tidak ditumbuhi oleh mikrobia lain yang tidak diharapkan (Suriawiria,1986).
Bahan-bahan dalam medium harus mencukupi kebutuhan elemen yang akan dipergunakan biomassa sel dan produksi metabolit, serta harus cukup memberi energi untuk biosintesa dan pemeliharaan selama proses. Karena itu perlu penelitian yang lebih rinci untuk membuat medium yang cocok untuk proses fermentasi, walupun elemen dasar tertentu yang harus ada pada setiap medium sudah diketahui. Semua mikrobia membutuhkan air, energi, C, N, elemen mineral, vitamin, dan oksigen. Penyediaan sumber C yang cukup, sangat perlu untuk proses pembentukan produk pada fermentasi (Salmah, 2004).
1. Nutrisi
Dalam kegiatannya yeast memerlukan penambahan nutrisi untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan, misalnya: unsur C pada karbohidrat; N dengan penambahan pupuk yang mengandung nitrogen, ZA, urea, amonia, pepton dan sebagainya; P dengan penambahan pupuk fosfat dari NPK, TSP, dan sebagainya; mineral-mineral; dan vitamin-vitamin.
2. Keasaman (pH)
Untuk fermentasi alkoholis, yeast memerlukan media suasana asam, yaitu antara pH 4,8– 5,0. Pengaturan pH dilakukan penambahan asam sulfat jika substratnya alkalis atau natrium bikarbonat jika substratnya asam.
3. Temperatur
Temperatur optimum untuk pengembangbiakan adalah 28 – 300C pada waktu fermentasi, terjadi kenaikan panas karena ekstrem. Untuk mencegah agar suhu fermentasi tidak naik perlu pendinginan supaya suhu dipertahankan tetap 28-300C.
4. Udara/ ketersediaan oksigen
Fermentasi alkohol berlangsung secara anaerobik (tanpa udara/O2). Namun demikian, oksigen diperlukan pada proses pembibitan sebelum fermentasi untuk pertumbuhan yeast (Hamidah, 2003). Yeast yang digunakan oleh PG-PS Madukismo ditumbuhkan di
media agar baru. Media modifikasi dari PG-PS Madukismo yang digunakan untuk menumbuhkan yeast tersebut mengandung komposisi, antara lain molase yang berfungsi sebagai sumber karbon organik yang mengandung gula cukup tinggi, substansi nitrogen, vitamin, dan mineral serta senyawa yang dapat berfungsi sebagai faktor pertumbuhan yeast; tauge digunakan sebagai sumber asam amino untuk pertumbuhan yeast; pisang ambon sebagai sumber protein, glukosa, dan karbohidrat; pepton sebagai sumber asam amino untuk pertumbuhan yeast; glukosa sebagai sumber karbon untuk pertumbuhan yeast; agar-agar digunakan untuk memadatkan media, menyediakan nutrien dan mencegah kultur tergoncang. Selain itu, juga digunakan bahan tambahan seperti urea {(NH2)2CO} yang berfungsi sebagai sumber nitrogen untuk pertumbuhan yeast yang ditambahkan ke dalam media fermentasi pada saat pemasakan;
NPK {CaH(PO4)2} sebagai nutrien untuk pertumbuhan yeast yaitu sebagai sumber Ca dan P, ditambahkan ke dalam media fermentasi pada saat pemasakan; asam sulfat (H2SO4) sebagai sumber sulfur, mengatur pH dan di samping itu juga untuk menghambat pertumbuhan jenis mikrobia yang mengganggu proses fermentasi (Anonim, 1984).
Sebagai sumber nitrogen untuk sintesis protein, kebanyakan spesies yeast dapat menggunakan ion amonium, sedangkan beberapa dapat
dibutuhkan oleh yeast adalah kalium, magnesium, natrium, dan kalsium. Untuk pertumbuhan di dalam medium sintetik yeast membutuhkan unsur, berupa boron (Br), koper (Co), zink (Zn), mangan (Mn), besi (Fe), iodium (I) dan molibdenum (Mo) (Fardiaz, 1992).
Kebanyakan yeast tumbuh paling baik pada kondisi dengan persediaan air cukup, tetapi karena yeast dapat tumbuh pada medium dengan konsentrasi solut (gula atau garam) lebih tinggi daripada mikrobia, dapat disimpulkan bahwa yeast membutuhkan air untuk pertumbuhan lebih kecil dibandingkan kebanyakan mikrobia (Fardiaz, 1992).
D. Identifikasi Mikrobia
Identifikasi adalah penentuan ciri atau karakter suatu biakan murni hasil isolasi yang ditentukan berdasarkan pada morfologi, sifat biakan dan sifat biokimiawi. Morfologi mikrobia berdasarkan bentuk, ukuran, dan penataan biasanya tidak cukup untuk melakukan identifikasi. Ciri lainnya, seperti sifat pewarnaan, pola pertumbuhan koloni, reaksi pertumbuhan pada karbohidrat, dan penggunaan asam amino sangat membantu dalam identifikasi yang disesuaikan dengan sifat biokimiawi yeast (Lay, 1994).
Pada identifikasi yeast mula-mula diamati morfologi individual secara
biokimia dan faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhannya (Jutono dkk, 1980).
Ciri atau karakter yang diperoleh dari hasil identifikasi digunakan untuk mendeterminasi dengan tujuan memastikan kebenaran dari hasil identifikasi. Determinasi adalah penentuan nama ilmiah yang dilakukan dengan mencocokkan hasil identifikasi dengan literatur pustaka acuan, gambar-gambar yang dijadikan acuan ataupun membandingkan dengan strain pembanding. Strain pembanding (kultur standar) merupakan suatu spesies tertentu yang dianggap mewakili ciri-ciri suatu spesies dan dibiarkan sebagai acuan. Fungsi dari strain pembanding tersebut adalah sebagai standar atau kontrol yang memiliki ciri dan karakteristik yang sama untuk mendapatkan hasil yang pasti (Machmud dkk, 2002; Lay,1994).
a. Morfologi Koloni
(spesifik) yang digunakan; beberapa koloni mungkin mempunyai bentuk tepi koloni yang rata (entire), berlobus (lobate), berlekuk (undulate), dan meruncing (erose); bentuk-bentuk tekstur permukaan koloni antara lain seperti kapas, licin, padat (compact), dan kasar; bentuk koloni ada yang bulat (round), oval, tak beraturan (irregular) dan berfilamen (filamentous).
Gambar 2 Bentuk tepi koloni yeast (Hendrix, 2007).
Gambar 3 Bentuk koloni yeast (Hendrix, 2007).
bekas inokulasi), echinulate (pertumbuhan sepanjang bekas inokulasi bergerigi), filiform (pertumbuhan sepanjang bekas inokulasi merata), rhizoid (pertumbuhan dengan cabang-cabang tidak teratur/seperti susunan akar), dan spreading (pertumbuhan merata beberapa mm disekilas bekas inokulasi). Sedangkan bentuk koloni pada media agar tegak antara lain beaded, filiform, villous (bentuknya pendek, tebal, dan permukaan seperti rambut), rhizoid, arboresent, dan echinulate. Beberapa koloni mungkin mempunyai tepi koloni yang rata (entire),
berlobus (lobate), berlekuk (undulate), dan meruncing (erose); tekstur permukaan koloni antara lain seperti kapas, permukaan licin (surface glistening), padat (compact), dan kasar; bentuk koloni ada yang bulat (round), oval, tak beraturan (irregular) dan berfilamen (filamentous) (Lay, 1994; Wuczkowski et al., 2007).
Gambar 4. Pola Pertumbuhan Pada Media Miring
Gambar 6. Pola Pertumbuhan Pada Media Cair
b. Morfologi Sel
Selain morfologi koloni, karakteristik yang sangat penting untuk identifikasi yeast adalah morfologi sel (mikroskopis) yang meliputi ukuran, bentuk,
rangkaian sel, ada tidaknya spora dan kedudukan spora, ada tidaknya flagella dan kedudukan flagella, ada tidaknya kapsula, dan reaksi-reaksi pengecatan. Untuk dapat mengamati bentuk dan morfologi sel yeast diperlukan preparat yang diamati di bawah mikroskop untuk melihat bentuk dan warna bagian tubuh yeast seperti miselium, rhizoid, sporangiofor, sporangium, kolumela, sporangiospora, klamidospora, stolon, konidia, konidiospora, vesikel, dan lainnya. (Wuczkowski et al., 2007; Machmud, Sudjadi, Suryadi, 2002).
Untuk melihat struktur sel lebih seksama dapat dilakukan beberapa pengecatan yang penting antara lain:
1. Pengecatan sederhana
blue) untuk mengikat kontras antara mikrobia dengan sekelilingnya (Lay, 1994).
2. Pengecatan Gram
Pengecatan ini dipakai untuk membedakan mikrobia yang bersifat gram positif dan gram negatif. Mikrobia gram negatif ditandai dengan warna biru ungu sedangkan gram positif berwarna merah. Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada mikrobia sehingga akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Sifat gram terutama ditentukan oleh sifat-sifat fisik dan kimia dinding sel dan membran sitoplasmanya. Dinding sel dan membran sitoplasma mikrobia gram positif mempunyai afinitas yang besar terrhadap kompleks cat kristal violet dan iodium; sedangkan pada mikrobia gram negatif afinitasnya sangat kecil. Pada waktu pengecatan, larutan kristal violet dan iodium menembus sel-sel mikrobia gram positif maupun gram negatif. Pada sel mikrobia gram positif, zat-zat ini membentuk suatu senyawa yang sukar larut, juga tidak larut dalam peluntur (alkohol). Hal ini terjadi pada sel mikrobia gram negatif, akibatnya cat dapat dilunturkan. Pada pemberian cat penutup, sel mikrobia gram positif tidak diwarnai, sedangkan sel mikrobia negatif diwarnai sehingga warnanya kontras terhadap cat utama (Jutono dkk, 1980).
3. Pengecatan Spora
sukar diwarnai dengan pewarna biasa, sehingga harus digunakan pewarna spesifik dan yang biasa digunakan adalah Malachite Green (Ruly, 2008).
Spora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, tetapi sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan spora, spora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam spora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada spora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya (Ruly, 2008).
4. Motilitas (Pergerakan sel)
Pada gerak brown, organisme bergetar dengan laju yang sama dengan menjaga hubungan ruang yang sama satu sama yang lain (Riza, 2008).
Motilitas dapat diamati dengan baik pada biakan yang masih baru. Pada biakan yang sudah lama akan dapat menjadi penuh sesak dengan makhluk hidup yang giat dan banyak mikrobia yang sudah mati, sehingga sangat sukar untuk mendapatkan sel yang motil, selain itu produksi asam dan produk yang bersifat racun dapat menyebabkan hilangnya motilitas sel mikrobia pada biakan (Riza, 2008).
c. Sifat Biokimiawi
Sifat-sifat biokimia diuji didasarkan pada berbagai hasil metabolisme yang disebabkan oleh daya kerja enzim. Pengujian sifat biokimia yeast meliputi uji oksidasi-fermentasi (O-F), uji fermentasi gula-gula, uji pembentukan gas, dan uji asimilasi nitrat (Lay, 1994).
1. Uji Oksidasi-Fermentasi (O-F)
secara oksidasi ditandai dengan terbentuknya warna kuning pada tabung yang tidak ditutup paraffin. Sedangkan hasil positif yang menunjukkan adanya kemampuan memetabolisme karbohidrat secara fermentasi ditandai dengan terbentuknya warna kuning pada tabung yang ditutup paraffin. Mikrobia fakultatif dapat dilihat dari terbentuknya warna kuning pada kedua tabung. Bila dalam proses fermentasi, yeast ditumbuhkan dalam medium yang mengandung glukosa (medium O-F), maka hasil proses fermentasi dapat berupa asam. Asam yang dihasilkan akan menurunkan pH medium biakan sehingga pembentukan asam ini ditandai oleh perubahan warna medium dari warna hijau menjadi kuning.
2. Uji Fermentasi Gula-gula dan Pembentukan Gas
Uji ini juga bertujuan untuk mengamati kemampuan yeast menghasilkan gas. Pengujian ini dilakukan secara tusukan pada medium TSIA. Hasil positif adanya pembentukan gas ditunjukkan dengan naiknya medium ke permukaan.
3. Uji Asimilasi Nitrat
Uji ini bertujuan untuk mengamati kemampuan yeast tidak mengasimilasikan nitrat menjadi nitrogen bebas (N2). Pengujian ini dilakukan dengan menginokulasikan pada medium nitrat-cair yang kemudian ditambahkan 1ml asam sulfanilat dan 1 ml alpha naphtylamine. Apabila digojog akan terbentuk warna merah menunjukkan adanya nitrat. Penambahan 1ml asam sulfanilat dan 1 ml alpha naphtylamine dalam media biakan tersebut menyebabkan pembentukan gelembung gas (N2) sebagai
hasil reduksi NO2 menjadi menjadi N2.
(Lay,1994).
E. Deskripsi Saccharomyces cerevisiae
relatif tinggi yaitu 25-30°C, dan akumulasi produk samping yang rendah (Prescott, 1990).
Saccharomyces cerevisiae tumbuh secara menggerombol, tidak
berflagel dan dapat melepaskan CO2 dengan cepat, menyebabkan sel terapung pada permukaan. Koloni S.cerevisiae berwarna putih kekuningan, mempunyai bentuk tepi yang circular, dan permukaannya mengkilat (surface glistening). Sel S.cerevisiae berbentuk bundar (spherical), adakalanya berbentuk ellipsoidal
(lonjong, memanjang) sampai cylindrical, dan menghasilkan pseudomiselium. Berkembangbiak secara vegetatif dengan cara pertunasan multilateral (budding). Konjugasi isogam atau heterogam dapat mendahului atau dapat terjadi setelah pembentukan askus. Dapat berbentuk tonjolan-tonjolan. Setiap askus dapat mengandung 1-4 spora dengan berbagai bentuk. Spora dapat berkonjugasi. Disimilasi berlangsung dari oksidatif yang disukai sampai kepada fermentatif yang dominan. Dalam medium biakan cair biasanya terjadi pertumbuhan di dasar medium. Senyawa-senyawa gula yang umum biasanya difermentasikan dengan kuat; nitrat tidak diasimilasikan (Pelczar, 1988; Pitt & Hocking, 1997).
Struktur dinding sel S.cerevisiae
dalam dinding sel berfungsi untuk mencegah kekeringan (Gandjar, Sjamsuridzal, Octari, 2006).
1
2
Gambar 7. Sel Saccharomyces cerevisiae Keterangan gambar:
1 = Sel Saccharomyces cerevisiae 2 = Pembentukan tunas (budding)
F. Landasan Teori
Yeast sebagai agen pemfermentasi seperti Saccharomyces cerevisiae
memfermentasi molase merupakan kultur murni yang berperan sebagai agen pemfermentasi molase yang menghasilkan alkohol di PG-PS Madukismo. Pengujian tersebut diharapkan dapat dijadikan sebagai informasi untuk tindak lanjut produksi alkohol yang dihasilkan sehingga dapat meningkatkan kualitas alkohol.
G. Hipotesis
30 BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk penelitian non eksperimental, dengan rancangan penelitian eksploratif deskriptif. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel Penelitian
Variabel penelitian berupa identitas S.cerevisiae yang ditentukan berdasarkan pada morfologi sel (bentuk sel, sifat Gram, ada tidaknya spora, dan sifat motilitas) dan morfologi koloni (bentuk, tekstur, dan warna koloni) serta sifat biokimiawi (fermentasi gula, sifat oksidasi-fermentasi, pembentukan gas, asimilasi nitrat) yang diamati pada media pertumbuhan (media modifikasi dari PG-PS Madukismo baik media cair, media agar miring, media agar tegak, maupun media agar petri) dan media identifikasi (SDA&SDL) yang dikondisikan dengan suhu inkubasi 30°C, waktu inkubasi 48 jam, pH pertumbuhan optimum 4,8. 2. Definisi Operasional
a. Saccharomyces cerevisiae adalah strain yeast yang digunakan oleh PG-PS Madukismo untuk fermentasi molase menghasilkan alkohol.
c. Kultur murni adalah kultur yang terdiri dari 1 spesies dan merupakan perbanyakan dari 1 sel tunggal.
d. Isolasi adalah usaha untuk memisahkan S.cerevisiae yang diperoleh dari isolat PG-PS Madukismo Yogyakarta yang digunakan dalam proses fermentasi alkohol ke medium buatan untuk memperoleh kultur murni. e. Identifikasi adalah penentuan identitas S.cerevisiae yang berperan dalam
fermentasi alkohol didasarkan pada morfologi sel (bentuk sel, sifat Gram, ada tidaknya spora, pergerakan sel) dan morfologi koloni (bentuk, tekstur, dan warna koloni) serta sifat biokimiawi (fermentasi gula, oksidasi-fermentasi, pembentukan gas, asimilasi nitrat).
f. Determinasi adalah penentuan mikrobia pemfermentasi yaitu S. cerevisiae dengan mencocokkan hasil identifikasi dibandingkan dengan kultur standar (S. cerevisiae ATCC 3015).
g. Kemurniaan adalah tidak adanya kontaminan dan memiliki karakteristik yang sesuai kultur standar.
h. Media identifikasi S.cerevisiae adalah media Saboraud Dextrose Agar (SDA) dan media modifikasi dari PG-PS Madukismo.
C. Bahan Penelitian
1. Kultur Saccharomyces cerevisiae dari PG-PS Madukismo Yogyakarta. 2. Kultur murni S. cerevisiae ATCC 3015 dari Lab. Pangan Gizi PAU
Bioteknologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta sebagai kultur standar. 3. Media identifikasi S.cerevisiae yaitu media Saboraud Dextrose Agar
(SDA) dengan komposisi (g/l): pepton 5, glukosa 10, agar-agar 20; dan media modifikasi dari PS Madukismo dengan komposisi: molase 1 l, pisang ambon 5 buah, tauge 250 g, pepton putih 10 g, urea 1 g, NPK 0,3 g, H2SO4 p.a ± 1 ml, glukosa 20 g, dan agar-agar ± 2 bungkus.
4. Molase dari PG-PS Madukismo Yogyakarta sebagai substrat fermentasi alkohol.
5. Bahan-bahan untuk morfologi sel S.cerevisiae : pengecatan sederhana (methyl blue); pengecatan gram (kristal violet (gram A), larutan iodine (gram B), alkohol 95% (gram C), safranin (gram D)); dan pengecatan spora (malachite green 5%, safranin).
6. Bahan-bahan untuk uji biokimia: media O-F (uji oksidasi-fermentasi), TSIA medium (uji fermentasi gula-gula dan pembentukan gas), media nitrat-cair, larutan asam sulfanilat dan alpha naphtylamine (uji asimilasi nitrat).
D. Alat Penelitian
Petridish steril, tabung reaksi, erlenmeyer (Merck. Duran Schott Germany), pipet ukur, gelas ukur, gelas objek, pengaduk, penyaring, spreader, jarum ose, jarum enten, jarum inokulasi, laminar air flow, autoclave (model: KT-40 No.108049 Midorigaoka Japan), inkubator (Merck. Heraeus type B5050 Amsterdam), refrigerator (Merck.Sharp), dan mikroskop (Merck. Olympus Vanox 1974 0010).
E. Tata Cara Penelitian
1. Uji Kemurnian Molase
2. Pembuatan Media Isolasi dan Media Pertumbuhan S. cerevisiae
a. Pembuatan Media Agar Tegak, Agar Miring, dan Agar Cawan
Media isolasi dan media pertumbuhan yang digunakan merupakan media modifikasi dari PS Madukismo dengan komposisi: molase, pisang ambon, tauge, pepton putih, glukose, urea, NPK, H2SO4, dan agar-agar. Media agar dibuat dengan cara sebagai berikut: molase dari tahap pemurnian ditambah dengan urea, NPK, H2SO4, dan tauge, kemudian direbus lalu disaring. Filtrat ditambahkan dengan pisang ambon yang telah dilumatkan terlebih dahulu, lalu direbus dan dibiarkan ± 10 menit kemudian disaring lagi. Ditambah dengan pepton, glukosa, dan agar-agar sambil diaduk pelan-pelan sampai seragam. Larutan ini dituang ke dalam cawan petri dan tabung reaksi 10 ml lalu ditutup dengan kapas yang telah dicelup paraffin, disterilkan. Larutan dalam cawan petri dibiarkan memadat, sebagian larutan dalam tabung reaksi dimiringkan sampai memadat dan sebagian lagi dalam tabung reaksi dibiarkan tegak sampai memadat. Setelah dingin media agar tegak, agar miring, dan agar cawan ini siap digunakan sebagai media untuk pertumbuhan kultur strain S.cerevisiae dari PG- PS Madukismo dan sebagai media untuk identifikasi
morfologi koloninya.
b. Pembuatan Media Cair
0,3 g dan H2SO4 sesuai kebutuhan untuk menurunkan pH sampai diperoleh pH optimum 4,8. Kemudian direbus lalu disaring. Larutan ini dituang ke dalam tabung reaksi 10 ml, ditutup dengan kapas yang telah dicelup paraffin, lalu disterilkan. Setelah dingin media cair ini siap digunakan sebagai media pertumbuhan kultur strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dan sebagai media untuk identifikasi morfologi koloninya.
c. Pembuatan Media SDA
Media SDA untuk mengisolasi dan menumbuhkan kultur standar (S.cerevisiae ATCC 3015) dipersiapkan sebagai berikut: sebanyak 65 g SDA (Saboraud Dextrose Agar) yang mengandung pepton, glukosa, dan agar-agar dilarutkan dalam 1 liter aquades. Kemudian direbus sampai mendidih lalu sterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit. Larutan ini dituang ke dalam cawan petri, lalu dibiarkan memadat. Larutan tersebut juga dituang ke dalam tabung reaksi yang ditutup dengan kapas, lalu dimiringkan dan dibiarkan tegak samapai memadat. Setelah dingin media SDA tegak, media SDA miring, dan media SDA cawan ini siap digunakan sebagai media untuk pertumbuhan kultur standar dan sebagai media untuk identifikasi morfologi koloninya.
d. Pembuatan Media SDL
Larutan tersebut dituang ke dalam tabung reaksi yang ditutup dengan kapas lalu sterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit. Setelah dingin media SDL ini siap digunakan sebagai media untuk pertumbuhan kultur standar dan sebagai media untuk identifikasi morfologi koloninya.
3. Isolasi S. cerevisiae dengan Metode Streak platting
Sumber isolat S.cerevisiae diinokulasikan secara streak platting dengan pemindahan secara aseptik dengan cara mengambil isolat S. cerevisiae menggunakan jarum ose dan digoreskan pada media agar petri yang dimulai pada satu ujung. Setiap kali ose digoreskan pada media agar petri, ose tersebut dipanaskan terlebih dahulu untuk kuadran berikutnya. Kemudian diinkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam dan diamati pertumbuhannya. Jika setelah inkubasi ternyata terdapat beberapa koloni maka dilakukan reisolasi sebanyak 2-3 kali sampai diperoleh biakan murni yang seragam baik warna, konsistensi, maupun bentuk koloninya. Isolat biakan murni dari reisolasi yang diperoleh tersebut kemudian diidentifikasi dalam berbagai media (media cair, media agar petri, media agar miring, dan media agar tegak) dan dibandingkan dengan kultur standar (S. cerevisiae ATCC 3015).
4. Identifikasi S.cerevisiae dengan Pengamatan Morfologi Koloni, Morfologi
Sel dan Sifat Biokimiawi.
a. Morfologi Koloni:
Morfologi koloni bertujuan untuk melihat sifat pertumbuhan S. cerevisiae pada berbagai media (media cair, media agar miring, dan media agar
permukaan dan dasar tabung. Uji ini dilakukan dengan menggunakan berbagai media, baik media modifikasi dari PG-PS Madukismo maupun media SDA. Biakan murni strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dinokulasikan pada media cair yang telah disterilkan, pada media agar tegak secara tusukan menggunakan jarum inokulasi, pada media agar miring dan media cawan agar secara goresan menggunakan jarum ose. Inkubasi dilakukan pada suhu 30°C selama 48 jam. Hal yang sama juga dilakukan pada kultur standa (S.cerevisiae ATCC 3015) pada media SDA dan media SDL. Pada media cair diamati pertumbuhannya pada permukaan media, kekeruhan, bau, dan ada tidaknya endapan untuk mengidentifikasi mikrobia berdasarkan kebutuhan akan oksigen. Pada media agar tegak diamati bentuk pertumbuhannya pada bekas tusukan dan tingkat pertumbuhannya merata atau tidak. Pada media agar miring diamati tingkat pertumbuhannya, bentuk pertumbuhan pada goresan, elevasi, topografi, warna, bau, dan konsistensinya. Sedangkan pada media cawan agar diamati bentuk pertumbuhannya, struktur dalamnya, tepi, elevasi, dan warna koloninya. Hasil pengamatan sifat pertumbuhan S.cerevisiae dibandingkan dengan kultur standar (S.cerevisiae ATCC 3015).
b. Morfologi Sel:
1). Pengecatan Sederhana
Pengecatan sederhana bertujuan untuk mempermudah mengamati bentuk sel dan penataan mikrobia dengan menggunakan 1 macam zat warna (methylen blue) untuk mengikat kontras antara mikrobia dengan sekelilingnya. Pengecatan sederhana dilakukan sebagai berikut: dibuat pulasan yeast terlebih dahulu lalu difiksasi dan digenangi dengan cat methylen blue selama ½-2 menit. Kemudian cat dibuang dan preparat dicuci dengan air mengalir. Setelah dikeringkan dalam udara kamar, preparat diperiksa di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat. Diamati bentuk selnya untuk mempermudah identifikasi. Hasil pengamatan bentuk sel strain S. cerevisiae dari PG-PS Madukismo dibandingkan dengan bentuk sel kultur standarnya (S.cerevisiae ATCC 3015). 2). Pengecatan Gram
berwarna merah berarti isolat tersebut termasuk Gram negatif. Hasil pengamatan sifat gram kultur strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dibandingkan dengan kultur standarnya (S. cerevisiae ATCC 3015).
3). Pengecatan Spora
Pengecatan spora bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya spora pada kultur S.cerevisiae dengan cara sebagai berikut: dibuat pulasan yeast terlebih dahulu lalu difiksasi di atas Bunsen, kemudian ditetesi dengan cat malachite green dan dipanasi kira-kira 1 menit. Dicuci dengan dengan air mengalir dan ditambahkan cat safranin selama 30-40 detik. Kemudian dicuci kembali dan diamati dengan perbesaran kuat. Spora berwarna hijau dan sel vegetatif berwarna merah. Hasil pengamatan ada tidaknya spora pada kultur strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dibandingkan dengan kultur standarnya (S.cerevisiae ATCC 3015).
4). Uji Motilitas
S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dibandingkan dengan kultur standarnya (S.cerevisiae ATCC 3015).
c. Uji Biokimiawi:
Setelah diperoleh koloni yang terpisah dapat dilakukan berbagai uji biokimiawi didasarkan pada identitas S. cerevisiae yang memiliki kemampuan memfermentasikan karbohidrat dan produk fermentasi yang dihasilkan merupakan ciri yang sangat berguna dalam identifikasi. Uji biokimiawi yang dilakukan meliputi:
1). Uji O-F (Oksidasi-Fermentasi)
tabung yang tidak ditutup dengan paraffin terbentuk perubahan warna dari hijau menjadi kuning berarti S.cerevisiae mampu memetabolisme karbohidrat secara oksidasi yang terjadi pada organisme yang aerobik. Apabila terjadi perubahan warna dari hijau menjadi kuning baik pada medium O-F yang ditutup paraffin maupun pada medium O-F tanpa paraffin berarti S.cerevisiae mampu memetabolisme karbohidrat secara oksidasi ataupun fermentatif sehingga dapat digolongkan dalam organisme yang bersifat fakultatif anaerobik. Hasil pengamatan kemampuan S.cerevisiae dalam memetabolisme karbohidrat secara oksidasi atau fermentasi dibandingkan dengan kontrol (medium tanpa inokulasi isolat S. cerevisiae) dan kultur standarnya (S.cerevisiae ATCC 3015).
2). Uji Fermentasi Gula-gula dan Pembentukan Gas
Uji ini bertujuan untuk mengidentifikasi kemampuan S. cerevisiae dalam memfermentasi glukosa, laktosa, atau sukrosa. Pada uji ini, S. cerevisiae diinokulasikan pada medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
miring dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan dan pada permukaan medium diinokulasi secara goresan menggunakan jarum ose. Inkubasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 30°C. Diamati perubahan warna yang terjadi dibandingkan kontrol (medium tanpa inokulasi isolat S. cerevisiae). Apabila slant (bagian atas) dan butt (bagian bawah) berwarna
butt berwarna kuning maka yang difermentasikan hanya glukosa. Hasil
pengamatan kemampuan S.cerevisiae dalam memfermentasi glukosa, laktosa, atau sukrosa dibandingkan dengan kontrol (medium tanpa inokulasi isolat S. cerevisiae) dan kultur standarnya (S.cerevisiae ATCC 3015).
Uji ini juga bertujuan untuk mengidentifikasi kemampuan S.cerevisiae membentuk gas dalam proses fermentasi. Pada uji ini, S.cerevisiae diinokulasikan juga pada medium TSIA (Triple Sugar Iron
Agar) miring dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan. Inkubasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 30°C. Diamati adanya kenaikkan medium kepermukaan menunjukan adanya pembentukan gas. Hasil pengamatan kemampuan S.cerevisiae dalam menghasilkan gas dibandingkan dengan kontrol (medium tanpa inokulasi isolat S.cerevisiae) dan kultur standarnya (S.cerevisiae ATCC 3015).
3). Uji Asimilasi Nitrat
dengan kontrol (medium tanpa inokulasi isolat S.cerevisiae) dan kultur standarnya (S.cerevisiae ATCC 3015).
5. Determinasi S. cerevisiae
Hasil identifikasi berupa foto dan gambar mikrofotografi identitas strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dideterminasi dengan cara mencocokkan dengan pustaka acuan (Pitt & Hocking, 1997) ataupun gambar-gambar yang dijadikan panduan dan dibandingkan dengan kultur standar (S. cerevisiae ATCC 3015) berdasarkan morfologi sel (bentuk sel, sifat gram, ada
tidaknya spora, dan sifat motilitas), dan morfologi koloni (bentuk, tekstur, dan warna koloni), serta sifat biokimiawi (fermentasi gula, sifat oksidasi-fermentasi, pembentukan gas, dan asimilasi nitrat).
F. Tata Cara Analisis Hasil
Gambar 8. Skema Kerja Penelitian PS Madukismo Yogyakarta
Penanaman kultur S.cerevisiae strain ATCC 3015 sebagai kultur standar pada media Saboraud Dextrose Agar (SDA) dan Saboraud Dextrose Liquid (SDL)
Isolasi dan reisolasi S.cerevisiae dengan metode Streak platting
Kultur murni S.cerevisiae
Identifikasi S.cerevisiae dengan pengamatan morfologi sel, morfologi koloni, dan sifat biokimiawi
Determinasi kultur S.cerevisiae dari hasil identifikasi dengan mencocokkan dengan pustaka acuan dan dibandingkan dengan kultur standar
45 BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
Saccharomyces cerevisiae adalah yeast yang memproduksi alkohol dalam jumlah tinggi dan merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi kualitas alkohol. Satu-satunya Pabrik Gula dan Pabrik Alkohol/Spiritus di Yogyakarta yang memproduksi alkohol berbahan dasar molase (tetes tebu) dengan proses fermentasi adalah PG-PS Maduskismo. Yeast yang digunakan adalah S.cerevisiae yang menghasilkan enzim yang mengubah gula dalam molase menjadi alkohol dan CO2. Sejak tahun 1955 tidak pernah ada identifikasi dan determinasi untuk memastikan apakah strain S.cerevisiae yang digunakan masih murni atau tidak. Yeast sebagai agen pemfermentasi yang dapat menghasilkan alkohol harus murni (terdiri dari 1 spesies dan merupakan perbanyakan dari 1 sel tunggal) sehingga perlu identifikasi ulang kultur dan kemurnian untuk meningkatkan kualitas produksi alkohol. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengidentifikasi apakah strain S.cerevisiae tersebut merupakan kultur murni yang berperan sebagai agen pemfermentasi molase yang menghasilkan alkohol di PG-PS Madukismo. Pengujian tersebut diharapkan dapat dijadikan sebagai informasi untuk tindak lanjut produksi alkohol yang dihasilkan sehingga dapat meningkatkan kualitas alkohol.
S.cerevisiae memiliki ciri-ciri karakteristik yaitu selnya tumbuh secara
mengkilat (surface glistening). Sel S.cerevisiae berbentuk bundar (spherical), adakalanya berbentuk ellipsoidal (lonjong, memanjang) sampai cylindrical, dan berkembangbiak secara vegetatif dengan cara pertunasan multilateral (budding). Dalam medium biakan cair biasanya terjadi pertumbuhan di dasar medium. Senyawa-senyawa gula yang umum biasanya difermentasikan dengan kuat; nitrat tidak diasimilasikan (Pelczar, 1988; Pitt & Hocking, 1997).
Keistimewaan S.cerevisiae antara lain memiliki daya fermentasi yang tinggi, selektifitas yang tinggi dalam menghasilkan produk, dapat menguraikan berbagai jenis gula, tahan terhadap kadar etanol yang tinggi yaitu antara 9-10% volume, tahan terhadap kadar glukosa yang tinggi 14-25°Brix, pH optimum pertumbuhan yang rendah 4,5-5, suhu optimum pertumbuhan yang relatif tinggi yaitu 25-30°C, dan akumulasi produk samping yang rendah (Prescott, 1990).
A. Uji Kemurnian Molase
di PG Madukismo karena sebagai substrat mensyaratkan kondisi yang harus bersih dan steril untuk menghindari kontaminasi sehingga didapatkan kondisi yang optimum untuk fermentasi alkohol (Anonim, 1984).
B. Pembuatan Media Isolasi dan Media Pertumbuhan S. cerevisiae
Media adalah bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikrobia yang terdiri atas nutrisi atau zat-zat makanan. Media modifikasi dari PG-PS Madukismo (seperti: media cair, media agar tegak, dan media agar miring) digunakan untuk mengisolasi dan menumbuhkan strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo, sedangkan kultur standarnya (S.cerevisiae ATCC 3015) ditumbuhkan pada media Saboraud Dextrose Agar (SDA) dan media Saboraud Dextrose Liquid (SDL) yang mengandung pepton sebagai sumber asam amino dan glukosa sebagai sumber karbon yang berguna untuk pertumbuhan yeast. Media cair untuk fermentasi yang digunakan di PG-PS Madukismo antara lain mengandung molase, urea {(NH2)2CO}, NPK {CaH(PO4)2}, dan asam sulfat. Di dalam media-media tersebut terkandung nutrien yang berguna untuk pertumbuhan yeast. Nutrisi merupakan substansi anorganik dan organik yang diperoleh dari lingkungan, diperlukan pada biosintesis dan produksi energi dari sel dan digunakan sebagai sumber energi untuk mendukung pertumbuhan (Prescott et al., 1999).
nitrogen, vitamin, dan mineral. Pisang ambon sebagai sumber protein, glukosa, dan karbohidrat. Glukosa sebagai sumber karbon untuk pertumbuhan yeast. Tauge dan pepton merupakan sumber asam amino untuk pertumbuhan yeast. Urea {(NH2)2CO} sebagai sumber nitrogen yang ditambahkan ke dalam media fermentasi pada saat pemasakan, NPK {CaH(PO4)2} sebagai nutrien untuk pertumbuhan yeast yaitu sebagai sumber Ca dan P. Asam sulfat merupakan sumber sulfur yang dalam proses produksi digunakan untuk mengatur pH, disamping itu juga untuk menghambat pertumbuhan jenis mikrobia yang mengganggu proses fermentasi sehingga pertumbuhannya jauh lebih subur. Pertumbuhan yang dimaksudkan adalah pertambahan jumlah sel yeast yang hidup dan berkembangbiak dimana dalam sel-sel yeast tersebut mengandung enzim yang berperan dalam proses peruraian glukosa menjadi alkohol dan CO2. Oleh karena itu, pertumbuhan berpengaruh terhadap proses fermentasi karena adanya enzim yang dihasilkan oleh sel-sel yeast (Prescott & Dunn, 1999).
C. Isolasi S. cerevisiae dengan Metode Streak platting
Menurut Jutono, Soedarsono, Hartadi, Kabirun, Suhadi, Soesanto (1980), mengisolasi suatu mikrobia ialah memisahkan mikrobia dari lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai kultur murni dalam medium buatan. Kultur strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dan kultur standar diinokulasikan secara streak platting dengan pemindahan secara aseptik pada media agar modifikasi dari PG-PS Madukismo dalam cawan petri. Metode streak platting umum digunakan untuk mengisolasi koloni mikrobia sehingga
menggoreskan koloni mikrobia pada cawan agar sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni. Biakan murni adalah biakan yang hanya berasal dari satu jenis mikrobia saja atau berasal dari perbanyakan satu sel mikrobia, dan ditandai dengan adanya koloni terpisah yang seragam baik warna, konsistensi, maupun bentuknya. Koloni yang terpisah tidak selalu diperoleh hanya dengan 1 kali isolasi saja namun memerlukan reisolasi sebanyak 2-3 kali hingga diperoleh koloni terpisah. Reisolasi adalah mengisolasi koloni mikrobia lebih lanjut beberapa kali dengan tujuan diperoleh koloni terpisah dan merupakan biakan murni yang hasilnya dapat diamati dari seragamitas warna, bentuk, dan konsistensinya (Pelczar, 1988).
Strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dan kultur standar yang
A B
C D
Gambar 9. Hasil Isolasi strain S. cerevisiae dari PG-PS Madukismo dan S.cerevisiae ATCC 3015 Secara Streak platting dengan waktu inkubasi 24 jam
Keterangan gambar:
A= hasil reisolasi strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dengan waktu inkubasi 24 jam
B= kontrol media tanpa inokulasi strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dengan waktu inkubasi 24 jam
C= hasil isolasi S.cerevisiae ATCC 3015 (kultur standar) dengan waktu inkubasi 24 jam
Dari gambar 9 menunjukkan adanya koloni terpisah yang seragam berbentuk bulat/oval memanjang (ellipsoidal sampai cylindrical) dan berwarna putih kekuningan dari kultur standar (S. cerevisiae ATCC 3015) yang telah diinokulasikan secara streak platting. Akan tetapi, setelah diinkubasikan pada suhu 30°C selama 24 jam kultur strain S. cerevisiae dari PG-PS Madukismo dalam 1 petri belum menunjukkan adanya koloni terpisah yang seragam baik warna, bentuk, dan konsistensinya sehingga dilakukan reisolasi. Koloni terpisah yang diperoleh dari tahap reisolasi digunakan sebagai stok untuk identifikasi dan determinasi berdasarkan pada morfologi koloni, morfologi sel, dan sifat biokimiawi. Kedua strain tersebut dibandingkan dan diperoleh hasil yang menunjukkan adanya koloni terpisah yang seragam baik warna, bentuk, dan konsistensinya. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa isolat S.cerevisiae yang diperoleh dari PG-PS Madukismo Yogyakarta merupakan kultur murni yang berperan menghasilkan alkohol di PG-PS Madukismo Yogyakarta.
D. Identifikasi dan Determinasi Yeast Pemfermentasi (S. cerevisiae)
membantu dalam identifikasi yang disesuaikan dengan sifat biokimiawi yeast (Wuczkowski et al., 2007).
Koloni merupakan populasi mikrobia yang secara makroskopik memiliki parameter tertentu seperti bentuk maupun ukuran yang khas untuk masing-masing spesies. Karakteristik dari morfologi makroskopik atau mikroskopik dan fisiologi yeast sangat penting untuk mengidentifikasi yeast karena masing-masing spesies yeast mempunyai karakteristik dan morfologi yang berbeda-beda. Morfologi makroskopik yang biasa digunakan dalam identifikasi yeast adalah morfologi koloni (Wuczkowski et al., 2007).
1. Pengamatan Morfologi Koloni strain S cerevisiae dari PG-PS Madukismo
dan S. cerevisiae ATCC 3015
Pengamatan morfologi koloni strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dilakukan dengan menginokulasikan pada beberapa media hasil modifikasi dari PG-PS Madukismo seperti media cair, media agar tegak, dan media agar miring dibandingkan dengan kultur standar (S. cerevisiae ATCC 3015). Pengamatan morfologi koloni S.cerevisiae ATCC 3015 sebagai kultur standar dilakukan dengan menginokulasikannya pada beberapa media seperti media SDA tegak, media media SDA miring, dan media SDL. Kultur standar digunakan sebagai pembanding yang dianggap memiliki ciri atau karakteristik yang mewakili dan dibiarkan sebagai acuan untuk mendapatkan hasil yang pasti. Apabila ciri atau karakteristik strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo sama dengan ciri kultur standar yang digunakan sebagai pembanding maka dapat dikatakan bahwa strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo merupakan biakan murni.
yang bercabang-cabang), beaded (menyerupai rantai mutiara atau butir-butir sepanjang bekas inokulasi), echinulate (pertumbuhan sepanjang bekas inokulasi bergerigi), filiform (pertumbuhan sepanjang bekas inokulasi merata), rhizoid (pertumbuhan dengan cabang-cabang tidak teratur/seperti susunan akar), dan spreading (pertumbuhan merata beberapa mm disekilas bekas inokulasi). Sedangkan bentuk koloni pada media agar tegak antara lain beaded, filiform, villous (bentuknya pendek, tebal, dan permukaan seperti rambut), rhizoid, arboresent, dan echinulate. Beberapa koloni mungkin mempunyai tepi
koloni yang rata (entire), berlobus (lobate), berlekuk (undulate), dan meruncing (erose); tekstur permukaan koloni antara lain seperti kapas, permukaan licin (surface glistening), padat (compact), dan kasar; bentuk koloni ada yang bulat (round), oval, tak beraturan (irregular) dan berfilamen (filamentous) (Lay, 1994; Wuczkowski et al., 2007).
a. Morfologi koloni srain S. cerevisiae dari PG-PS Madukismo dan S.
cerevisiae ATCC 3015 dalam media cair
protein, glukosa, dan karbohidrat. Glukosa sebagai sumber karbon untuk pertumbuhan yeast. Tauge dan pepton merupakan sumber asam amino untuk pertumbuhan yeast. urea {(NH2)2CO} sebagai sumber nitrogen yang ditambahkan ke dalam media fermentasi pada saat pemasakan, NPK {CaH(PO4)2} sebagai nutrien untuk pertumbuhan yeast yaitu sebagai sumber Ca dan P. Asam sulfat merupakan sumber sulfur yang dalam proses produksi digunakan untuk mengatur pH, disamping itu juga untuk menghambat pertumbuhan jenis mikrobia yang mengganggu proses fermentasi. Sedangkan pengamatan morfologi koloni S.cerevisiae strain ATCC 3015 dilakukan menggunakan media SDL untuk kultur standar dengan komposisi yang terkandung didalam media tersebut merupakan unsur-unsur yang penting bagi pertumbuhan yeast seperti pepton dan glukosa. Pepton merupakan sumber utama nitrogen organik, dapat juga mengandung vitamin dan karbohidrat. Sedangkan glukosa sebagai sumber karbon untuk pertumbuhan yeast.
standarnya (S.cerevisiae ATCC 3015) bersifat fakultatif anaerob karena dapat tumbuh di dasar media dan juga pada permukaan media. Hal ini berarti S.cerevisiae mampu memetabolisme karbohidrat secara oksidasi ataupun fermentatif sehingga dapat digolongkan dalam organisme yang bersifat fakultatif anaerobik (Lampiran 2).
b. Morfologi koloni strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dan S.
cerevisiae ATCC 3015 dalam media agar tegak
c. Morfologi koloni strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dan S.
cerevisiae ATCC 3015 dalam media agar miring
Pengamatan morfologi koloni strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dan kultur standarnya dilakukan menggunakan media agar miring modifikasi dari PG-PS Madukismo di mana kandungan dalam media ini sama dengan media agar tegak modifikasi PG-PS Madukismo, sedangkan pengamatan morfologi S.cerevisiae ATCC 3015 dilakukan dengan menggunakan media SDA miring. Pada media tersebut diamati tingkat pertumbuhan, bentuk, elevasi, warna, dan tekstur pertumbuhannya. Dari hasil pengamatan terlihat bentuk pertumbuhan koloni strain S. cerevisiae dari PG-PS Madukismo dibandingkan S. cerevisiae ATCC 3015
yang sama-sama seperti rantai-rantai mutiara atau butir-butir disepanjang berkas inokulasi (beaded), elevasi bergelombang (undulate), berwarna putih kekuningan, tingkat pertumbuhan koloni yang lebat, dan tekstur permukaan yang licin (surface glistening) (Lampiran 2).
Tabel I. Hasil Pengamatan Morfologi Koloni strain S. cerevisiae dari PG-PS Madukismo S. cerevisiae ATCC 3015
Tabel I yang menunjukkan hasil pengamatan morfologi koloni strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo memiliki kesamaan sifat/karakter morfologi koloni dengan kultur standar (S.cerevisiae ATCC 3015) berdasarkan parameter pertumbuhan yang diamati pada berbagai media seperti media cair, media agar tegak, dan media agar miring baik pada media modifikasi PG-PS Madukismo maupun media SDA dan SDL. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa S.cerevisiae penghasil alkohol yang digunakan di PG-PS Madukismo diduga merupakan biakan murni dengan sifat morfologi koloni yang sama dengan kultur standar dan pustaka acuan.
2. Pengamatan Morfologi Sel strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo
dan S.cerevisiae ATCC 3015
Selain morfologi koloni, karakteristik yang sangat penting untuk identifikasi yeast adalah morfologi sel (mikroskopis) meliputi bentuk sel dan sifat sel berdasarkan pewarnaan, sifat gram, ada tidaknya spora, dan sifat motilitas. Untuk dapat mengamati bentuk dan morfologi sel yeast diperlukan preparat ulas diikuti oleh pengecatan yang diamati di bawah mikroskop (Wuczkowski et al., 2007).
ciri dan karakteristik yang sama untuk memastikan kebenaran dari hasil identifikasi (Machmud, Sudjadi, Suryadi, 2002).
Pengecatan dapat melihat struktur sel mikrobia lebih seksama. Fungsi dari pengecatan tersebut, antara lain memberi warna pada bagian-bagian sel sehingga menjadi kontras dan jelas; menunjukkan bagian struktur sel; dan membedakan jenis mikrobia satu dengan yang lain (Jutono dkk, 1980).
Untuk mengetahui ciri morfologi sel kultur S.cerevisiae seperti bentuk sel dan sifat sel berdasarkan pewarnaan dapat dilakukan dengan pengecatan sederhana, mengetahui sifat gram, ada tidaknya spora, dan sifat motilitas.
a. Pengecatan Sederhana
A B
Gambar 10. Hasil Pengecatan Sederhana isolat S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dan S.cerevisiae ATCC 3015
Keterangan:
A= Sel S.cerevisiae yang diisolasi dari PG-PS Madukismo B= Sel S.cerevisiae ATCC 3015 (kultur standar)
Keterangan gambar:
1= Sel berbentuk ellipsoidal 2= Sel berbentuk cylindrical 3= Budding
Perbesaran: 400x
Dari hasil pengamatan terlihat sel strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo yang dibandingkan dengan kultur standarnya yaitu berbentuk ellipsoidal sampai cylindrical. Bentuk sel ini sesuai dengan identitas S.cerevisiae dalam pustaka acuan untuk identifikasi (Pitt & Hocking, 1997). Perbedaan warna yang terlihat pada kedua sel S.cerevisiae yang dibandingkan kemungkinan disebabkan karena waktu pewarnaan yang terlalu lama dan terlalu tebal.
b. Pengecatan Gram
