BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA
D. Identifikasi Mikrobia
Identifikasi adalah penentuan ciri atau karakter suatu biakan murni hasil isolasi yang ditentukan berdasarkan pada morfologi, sifat biakan dan sifat biokimiawi. Morfologi mikrobia berdasarkan bentuk, ukuran, dan penataan biasanya tidak cukup untuk melakukan identifikasi. Ciri lainnya, seperti sifat pewarnaan, pola pertumbuhan koloni, reaksi pertumbuhan pada karbohidrat, dan penggunaan asam amino sangat membantu dalam identifikasi yang disesuaikan dengan sifat biokimiawi yeast (Lay, 1994).
Pada identifikasi yeast mula-mula diamati morfologi individual secara mikroskopik dan pertumbuhannya pada berbagai medium. Sifat-sifat morfologi sel dan morfologi koloni tidak cukup untuk melakukan identifikasi, tetapi sifat biokimianya juga perlu diuji. Karena suatu yeast tidak dapat dideterminasi hanya berdasarkan sifat-sifat morfologinya saja maka perlu diteliti pula sifat-sifat
biokimia dan faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhannya (Jutono dkk, 1980).
Ciri atau karakter yang diperoleh dari hasil identifikasi digunakan untuk mendeterminasi dengan tujuan memastikan kebenaran dari hasil identifikasi. Determinasi adalah penentuan nama ilmiah yang dilakukan dengan mencocokkan hasil identifikasi dengan literatur pustaka acuan, gambar-gambar yang dijadikan acuan ataupun membandingkan dengan strain pembanding. Strain pembanding (kultur standar) merupakan suatu spesies tertentu yang dianggap mewakili ciri-ciri suatu spesies dan dibiarkan sebagai acuan. Fungsi dari strain pembanding tersebut adalah sebagai standar atau kontrol yang memiliki ciri dan karakteristik yang sama untuk mendapatkan hasil yang pasti (Machmud dkk, 2002; Lay,1994).
a. Morfologi Koloni
Menurut Wuczkowski, Gerbawy, Kraus, Kubicek, Sterflinger, Prillinger (2007), karakteristik dari morfologi–makroskopik, mikroskopik dan fisiologi yeast sangat penting untuk mengidentifikasi yeast karena masing-masing spesies yeast mempunyai karakteristik dan morfologi yang berbeda-beda. Morfologi makroskopik yang biasa digunakan dalam identifikasi yeast adalah morfologi koloni. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam mengamati morfologi koloni antara lain warna permukaan koloni, yang mencakup miselium vegetatif dan konidia; waktu pertumbuhan dan diameter koloni, pada setiap spesies untuk mencapai waktu pertumbuhan dan diameter maksimum koloni berbeda-beda, ada yang cepat, lambat dan sangat lambat yang dipengaruhi oleh medium
(spesifik) yang digunakan; beberapa koloni mungkin mempunyai bentuk tepi koloni yang rata (entire), berlobus (lobate), berlekuk (undulate), dan meruncing (erose); bentuk-bentuk tekstur permukaan koloni antara lain seperti kapas, licin, padat (compact), dan kasar; bentuk koloni ada yang bulat (round), oval, tak beraturan (irregular) dan berfilamen (filamentous).
Gambar 2 Bentuk tepi koloni yeast (Hendrix, 2007).
Gambar 3 Bentuk koloni yeast (Hendrix, 2007).
Morfologi koloni bertujuan untuk melihat pola pertumbuhan yeast pada berbagai media (media cair, media agar petri, media agar miring, dan media agar tegak) Pola pertumbuhan dari suatu mikrobia tergantung pada penampilannya pada berbagai media. Pada media cair sifat berdasarkan kebutuhan akan O2 sangat mudah dilihat dan pola pertumbuhannya dapat dibedakan seperti endapan (sediment), cincin (ring), dan selaput (pellicle). Demikian pula pada media agar tegak atau miring, mempunyai bentuk yang spesifik untuk setiap spesies. Pola pertumbuhan pada agar miring, antara lain arborescent (menyerupai pohon yang bercabang-cabang), beaded (menyerupai rantai mutiara atau butir-butir sepanjang
bekas inokulasi), echinulate (pertumbuhan sepanjang bekas inokulasi bergerigi), filiform (pertumbuhan sepanjang bekas inokulasi merata), rhizoid (pertumbuhan dengan cabang-cabang tidak teratur/seperti susunan akar), dan spreading (pertumbuhan merata beberapa mm disekilas bekas inokulasi). Sedangkan bentuk koloni pada media agar tegak antara lain beaded, filiform, villous (bentuknya pendek, tebal, dan permukaan seperti rambut), rhizoid, arboresent, dan echinulate. Beberapa koloni mungkin mempunyai tepi koloni yang rata (entire), berlobus (lobate), berlekuk (undulate), dan meruncing (erose); tekstur permukaan koloni antara lain seperti kapas, permukaan licin (surface glistening), padat (compact), dan kasar; bentuk koloni ada yang bulat (round), oval, tak beraturan (irregular) dan berfilamen (filamentous) (Lay, 1994; Wuczkowski et al., 2007).
Gambar 4. Pola Pertumbuhan Pada Media Miring
Gambar 6. Pola Pertumbuhan Pada Media Cair
b. Morfologi Sel
Selain morfologi koloni, karakteristik yang sangat penting untuk identifikasi yeast adalah morfologi sel (mikroskopis) yang meliputi ukuran, bentuk, rangkaian sel, ada tidaknya spora dan kedudukan spora, ada tidaknya flagella dan kedudukan flagella, ada tidaknya kapsula, dan reaksi-reaksi pengecatan. Untuk dapat mengamati bentuk dan morfologi sel yeast diperlukan preparat yang diamati di bawah mikroskop untuk melihat bentuk dan warna bagian tubuh yeast seperti miselium, rhizoid, sporangiofor, sporangium, kolumela, sporangiospora, klamidospora, stolon, konidia, konidiospora, vesikel, dan lainnya. (Wuczkowski et al., 2007; Machmud, Sudjadi, Suryadi, 2002).
Untuk melihat struktur sel lebih seksama dapat dilakukan beberapa pengecatan yang penting antara lain:
1. Pengecatan sederhana
Pengecatan ini dipakai untuk melihat bentuk-bentuk sel dan penataan mikrobia dengan menggunakan 1 macam zat warna (methylen
blue) untuk mengikat kontras antara mikrobia dengan sekelilingnya (Lay, 1994).
2. Pengecatan Gram
Pengecatan ini dipakai untuk membedakan mikrobia yang bersifat gram positif dan gram negatif. Mikrobia gram negatif ditandai dengan warna biru ungu sedangkan gram positif berwarna merah. Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada mikrobia sehingga akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Sifat gram terutama ditentukan oleh sifat-sifat fisik dan kimia dinding sel dan membran sitoplasmanya. Dinding sel dan membran sitoplasma mikrobia gram positif mempunyai afinitas yang besar terrhadap kompleks cat kristal violet dan iodium; sedangkan pada mikrobia gram negatif afinitasnya sangat kecil. Pada waktu pengecatan, larutan kristal violet dan iodium menembus sel-sel mikrobia gram positif maupun gram negatif. Pada sel mikrobia gram positif, zat-zat ini membentuk suatu senyawa yang sukar larut, juga tidak larut dalam peluntur (alkohol). Hal ini terjadi pada sel mikrobia gram negatif, akibatnya cat dapat dilunturkan. Pada pemberian cat penutup, sel mikrobia gram positif tidak diwarnai, sedangkan sel mikrobia negatif diwarnai sehingga warnanya kontras terhadap cat utama (Jutono dkk, 1980).
3. Pengecatan Spora
Spora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis mikrobia. Karena kandungan air spora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka spora berbentuk sangat padat. Spora sangat
sukar diwarnai dengan pewarna biasa, sehingga harus digunakan pewarna spesifik dan yang biasa digunakan adalah Malachite Green (Ruly, 2008).
Spora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, tetapi sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan spora, spora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam spora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada spora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya (Ruly, 2008).
4. Motilitas (Pergerakan sel)
Untuk mengamati gerak pada mikrobia dengan baik maka bisa menggunakan metode tetesan bergantung. Untuk mengamati gerak pada mikrobia dengan baik maka bisa menggunakan metode tetesan bergantung. Dalam pengamatan gerak mikrobia, ada dua hal yang harus diperhatikan yaitu motilitas mikrobia dan gerak brown. Mikrobia yang bersifat motil akan nampak jelas bergerak, dan bergeraknya melaju kearah tertentu, sedangkan sel mikrobia yang tampak sebagai gerak brown adalah gerakan yang bukan berasal dari mikrobia itu sendiri melainkan dikarenakan adanya partikel-partikel air yang ada disekeliling sel atau adanya energi kinetik.
Pada gerak brown, organisme bergetar dengan laju yang sama dengan menjaga hubungan ruang yang sama satu sama yang lain (Riza, 2008).
Motilitas dapat diamati dengan baik pada biakan yang masih baru. Pada biakan yang sudah lama akan dapat menjadi penuh sesak dengan makhluk hidup yang giat dan banyak mikrobia yang sudah mati, sehingga sangat sukar untuk mendapatkan sel yang motil, selain itu produksi asam dan produk yang bersifat racun dapat menyebabkan hilangnya motilitas sel mikrobia pada biakan (Riza, 2008).
c. Sifat Biokimiawi
Sifat-sifat biokimia diuji didasarkan pada berbagai hasil metabolisme yang disebabkan oleh daya kerja enzim. Pengujian sifat biokimia yeast meliputi uji oksidasi-fermentasi (O-F), uji fermentasi gula-gula, uji pembentukan gas, dan uji asimilasi nitrat (Lay, 1994).
1. Uji Oksidasi-Fermentasi (O-F)
Uji ini bertujuan untuk mengidentifikasi kemampuan yeast memetabolisme karbohidrat secara oksidasi yang terjadi pada mikrobia aerobik atau fermentasi yang terjadi pada mikrobia anaerobik. Metabolisme karbohidrat dapat terjadi secara fermentasi dan oksidasi untuk menghasilkan energi. Jika terdapat O2 maka mikrobia memetabolisme karbohidrat secara oksidasi, namun jika tidak ada O2 maka mikrobia akan memetabolisme karbohidrat secara fermentasi. Pengujian ini dilakukan secara tusukan pada medium O-F yang ditutup paraffin dan pada medium O-F tanpa paraffin. Hasil positif yang menunjukkan adanya kemampuan memetabolisme karbohidrat
secara oksidasi ditandai dengan terbentuknya warna kuning pada tabung yang tidak ditutup paraffin. Sedangkan hasil positif yang menunjukkan adanya kemampuan memetabolisme karbohidrat secara fermentasi ditandai dengan terbentuknya warna kuning pada tabung yang ditutup paraffin. Mikrobia fakultatif dapat dilihat dari terbentuknya warna kuning pada kedua tabung. Bila dalam proses fermentasi, yeast ditumbuhkan dalam medium yang mengandung glukosa (medium O-F), maka hasil proses fermentasi dapat berupa asam. Asam yang dihasilkan akan menurunkan pH medium biakan sehingga pembentukan asam ini ditandai oleh perubahan warna medium dari warna hijau menjadi kuning.
2. Uji Fermentasi Gula-gula dan Pembentukan Gas
Uji ini bertujuan untuk mengidentifikasi kemampuan yeast memfermentasikan glukosa, laktosa, atau sukrosa. Pengujian ini dilakukan secara tusukan pada medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) pada bagian bawah yang disebut butt dan secara goresan pada bagian atas yang disebut slant. Hasil positif yang menunjukkan adanya kemampuan memfermentasikan glukosa, laktosa, dan sukrosa yaitu terbentuknya warna kuning pada bagian butt dan slant. Sedangkan hasil positif yang menunjukkan adanya kemampuan hanya memfermentasikan glukosa yaitu terbentuknya warna kuning pada bagian butt dan terbentuknya warna merah pada bagian slant. Apabila terbentuk warna kuning pada bagian slant dan terbentuk warna merah pada bagian butt berarti tidak terjadi fermentasi glukosa, laktosa, atau sukrosa.
Uji ini juga bertujuan untuk mengamati kemampuan yeast menghasilkan gas. Pengujian ini dilakukan secara tusukan pada medium TSIA. Hasil positif adanya pembentukan gas ditunjukkan dengan naiknya medium ke permukaan.
3. Uji Asimilasi Nitrat
Uji ini bertujuan untuk mengamati kemampuan yeast tidak mengasimilasikan nitrat menjadi nitrogen bebas (N2). Pengujian ini dilakukan dengan menginokulasikan pada medium nitrat-cair yang kemudian ditambahkan 1ml asam sulfanilat dan 1 ml alpha naphtylamine. Apabila digojog akan terbentuk warna merah menunjukkan adanya nitrat. Penambahan 1ml asam sulfanilat dan 1 ml alpha naphtylamine dalam media biakan tersebut menyebabkan pembentukan gelembung gas (N2) sebagai
hasil reduksi NO2 menjadi menjadi N2.
(Lay,1994).
E. Deskripsi Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae digunakan secara luas dalam produksi alkohol dan makanan melalui proses fermentasi. S.cerevisiae merupakan yeast fermentatif kuat yang dapat memfermentasikan glukosa. S.cerevisiae memiliki daya fermentasi yang tinggi, selektivitas yang tinggi dalam menghasilkan produk, dapat menguraikan berbagai jenis gula, tahan terhadap kadar etanol yang tinggi yaitu antara 9-10% volume, tahan terhadap kadar glukosa yang tinggi 14-25°Brix, pH optimum pertumbuhan yang rendah 4,5-5, suhu optimum pertumbuhan yang
relatif tinggi yaitu 25-30°C, dan akumulasi produk samping yang rendah (Prescott, 1990).
Saccharomyces cerevisiae tumbuh secara menggerombol, tidak berflagel dan dapat melepaskan CO2 dengan cepat, menyebabkan sel terapung pada permukaan. Koloni S.cerevisiae berwarna putih kekuningan, mempunyai bentuk tepi yang circular, dan permukaannya mengkilat (surface glistening). Sel S.cerevisiae berbentuk bundar (spherical), adakalanya berbentuk ellipsoidal (lonjong, memanjang) sampai cylindrical, dan menghasilkan pseudomiselium. Berkembangbiak secara vegetatif dengan cara pertunasan multilateral (budding). Konjugasi isogam atau heterogam dapat mendahului atau dapat terjadi setelah pembentukan askus. Dapat berbentuk tonjolan-tonjolan. Setiap askus dapat mengandung 1-4 spora dengan berbagai bentuk. Spora dapat berkonjugasi. Disimilasi berlangsung dari oksidatif yang disukai sampai kepada fermentatif yang dominan. Dalam medium biakan cair biasanya terjadi pertumbuhan di dasar medium. Senyawa-senyawa gula yang umum biasanya difermentasikan dengan kuat; nitrat tidak diasimilasikan (Pelczar, 1988; Pitt & Hocking, 1997).
Struktur dinding sel S.cerevisiae
Bagian paling luar S.cerevisiae terdiri terutama dari glukan. Senyawa glukan tersebut bertanggung jawab mempertahankan bentuk dari sel S.cerevisiae. Bagian dinding sel S.cerevisiae yang paling luar terdiri dari mannan yang terikat pada protein. Mannan menggantikan peran kitin dan glukan. Kitin ditemukan pada pertunasan sel S.cerevisiae dalam jumlah yang sangat sedikit sepanjang bagian dalam dinding sel. Begitu pula dengan senyawa lipid yang terdapat pada lapisan
dalam dinding sel berfungsi untuk mencegah kekeringan (Gandjar, Sjamsuridzal, Octari, 2006). 1 2
Gambar 7. Sel Saccharomyces cerevisiae Keterangan gambar:
1 = Sel Saccharomyces cerevisiae 2 = Pembentukan tunas (budding)