BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
4. Identifikasi S.cerevisiae dengan Pengamatan Morfologi Koloni,
a. Morfologi Koloni:
Morfologi koloni bertujuan untuk melihat sifat pertumbuhan S. cerevisiae pada berbagai media (media cair, media agar miring, dan media agar tegak) dengan melihat pertumbuhan pada bagian permukaan, di bawah
permukaan dan dasar tabung. Uji ini dilakukan dengan menggunakan berbagai media, baik media modifikasi dari PG-PS Madukismo maupun media SDA. Biakan murni strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dinokulasikan pada media cair yang telah disterilkan, pada media agar tegak secara tusukan menggunakan jarum inokulasi, pada media agar miring dan media cawan agar secara goresan menggunakan jarum ose. Inkubasi dilakukan pada suhu 30°C selama 48 jam. Hal yang sama juga dilakukan pada kultur standa (S.cerevisiae ATCC 3015) pada media SDA dan media SDL. Pada media cair diamati pertumbuhannya pada permukaan media, kekeruhan, bau, dan ada tidaknya endapan untuk mengidentifikasi mikrobia berdasarkan kebutuhan akan oksigen. Pada media agar tegak diamati bentuk pertumbuhannya pada bekas tusukan dan tingkat pertumbuhannya merata atau tidak. Pada media agar miring diamati tingkat pertumbuhannya, bentuk pertumbuhan pada goresan, elevasi, topografi, warna, bau, dan konsistensinya. Sedangkan pada media cawan agar diamati bentuk pertumbuhannya, struktur dalamnya, tepi, elevasi, dan warna koloninya. Hasil pengamatan sifat pertumbuhan S.cerevisiae dibandingkan dengan kultur standar (S.cerevisiae ATCC 3015).
b. Morfologi Sel:
Untuk mengetahui ciri morfologi sel kultur S.cerevisiae seperti bentuk sel dan sifat sel berdasarkan pewarnaan dapat dilakukan dengan pengecatan sederhana, mengetahui sifat gram, ada tidaknya spora, dan sifat motilitas.
1). Pengecatan Sederhana
Pengecatan sederhana bertujuan untuk mempermudah mengamati bentuk sel dan penataan mikrobia dengan menggunakan 1 macam zat warna (methylen blue) untuk mengikat kontras antara mikrobia dengan sekelilingnya. Pengecatan sederhana dilakukan sebagai berikut: dibuat pulasan yeast terlebih dahulu lalu difiksasi dan digenangi dengan cat methylen blue selama ½-2 menit. Kemudian cat dibuang dan preparat dicuci dengan air mengalir. Setelah dikeringkan dalam udara kamar, preparat diperiksa di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat. Diamati bentuk selnya untuk mempermudah identifikasi. Hasil pengamatan bentuk sel strain S. cerevisiae dari PG-PS Madukismo dibandingkan dengan bentuk sel kultur standarnya (S.cerevisiae ATCC 3015). 2). Pengecatan Gram
Pengecatan Gram bertujuan untuk mengetahui sifat gram kultur S. cerevisiae dengan cara sebagai berikut: dibuat pulasan yeast terlebih dahulu lalu difiksasi dan ditetesi dengan cat crystal violet, kemudian diamkan 30-60 detik. Sisa cat dibuang dan dicuci dengan air mengalir. Larutan iodine diteteskan dan diamkan selama 1-2 menit. Preparat dicuci kembali dengan air mengalir, kemudian didekolorisasi dengan alkohol ±20 detik. Dicuci kembali lalu ditambahkan larutan safranin selama 10-20 detik. Selanjutnya dicuci dan dikering anginkan lalu diperiksa di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat, menggunakan minyak immersi. Diamati perubahan yang terjadi untuk mengetahui perbedaan sifat Gram positif dan Gram negatif. Jika sel berwarna ungu berarti isolat yang diisolasi termasuk Gram positif sedangkan jika sel
berwarna merah berarti isolat tersebut termasuk Gram negatif. Hasil pengamatan sifat gram kultur strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dibandingkan dengan kultur standarnya (S. cerevisiae ATCC 3015).
3). Pengecatan Spora
Pengecatan spora bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya spora pada kultur S.cerevisiae dengan cara sebagai berikut: dibuat pulasan yeast terlebih dahulu lalu difiksasi di atas Bunsen, kemudian ditetesi dengan cat malachite green dan dipanasi kira-kira 1 menit. Dicuci dengan dengan air mengalir dan ditambahkan cat safranin selama 30-40 detik. Kemudian dicuci kembali dan diamati dengan perbesaran kuat. Spora berwarna hijau dan sel vegetatif berwarna merah. Hasil pengamatan ada tidaknya spora pada kultur strain S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dibandingkan dengan kultur standarnya (S.cerevisiae ATCC 3015).
4). Uji Motilitas
Uji motilitas bertujuan untuk mengetahui sifat motilitas kultur S.cerevisiae dengan cara sebagai berikut: satu ose kultur S.cerevisiae dari media padat diletakkan pada gelas penutup (kultur ditambahkan dengan air). Objek gelas yang telah diberi 4 gumpalan vaselin dibalikkan pada gelas penutup dengan hati-hati sedemikian rupa sehingga ujung-ujung vaselin pada objek gelas berlekatan dengan gelas penutup. Kemudian objek gelas dibalikkan dan diamati sifat motilitas dengan perbesaran lemah dan dengan menutup sebagian diafragma. Hasil pengamatan sifat motilitas pada kultur strain
S.cerevisiae dari PG-PS Madukismo dibandingkan dengan kultur standarnya (S.cerevisiae ATCC 3015).
c. Uji Biokimiawi:
Setelah diperoleh koloni yang terpisah dapat dilakukan berbagai uji biokimiawi didasarkan pada identitas S. cerevisiae yang memiliki kemampuan memfermentasikan karbohidrat dan produk fermentasi yang dihasilkan merupakan ciri yang sangat berguna dalam identifikasi. Uji biokimiawi yang dilakukan meliputi:
1). Uji O-F (Oksidasi-Fermentasi)
Uji ini dilakukan untuk mengidentifikasi kemampuan S.cerevisiae memetabolisme karbohidrat secara oksidasi atau fermentasi. Pada uji ini, isolat kultur S. cerevisiae diinokulasikan pada media O-F yang mengandung glukosa secara tusukan kemudian ditutup dengan parafin lunak. S. cerevisiae juga diinokulasikan pada media O-F tanpa ditutup dengan parafin lunak. Dua tabung sebagai kontrol yaitu tanpa inokulasi isolat kultur S. cerevisiae. Kemudian diinkubasi selama 48 jam. Setelah 48 jam hasil diamati dengan melihat perubahan warna media O-F. Diamati kemampuan S. cerevisiae dalam memetabolisme karbohidrat secara fermentasi atau oksidasi. Jika pada tabung yang ditutup parafin terbentuk perubahan warna dari hijau menjadi berwarna warna kuning sedangkan pada tabung yang tidak ditutup paraffin tetap berwarna hijau berarti S.cerevisiae mampu memetabolisme karbohidrat secara fermentasi yang terjadi pada organisme anaerobik. Akan tetapi jika pada tabung yang ditutup paraffin tetap berwarna hijau sedangkan pada
tabung yang tidak ditutup dengan paraffin terbentuk perubahan warna dari hijau menjadi kuning berarti S.cerevisiae mampu memetabolisme karbohidrat secara oksidasi yang terjadi pada organisme yang aerobik. Apabila terjadi perubahan warna dari hijau menjadi kuning baik pada medium O-F yang ditutup paraffin maupun pada medium O-F tanpa paraffin berarti S.cerevisiae mampu memetabolisme karbohidrat secara oksidasi ataupun fermentatif sehingga dapat digolongkan dalam organisme yang bersifat fakultatif anaerobik. Hasil pengamatan kemampuan S.cerevisiae dalam memetabolisme karbohidrat secara oksidasi atau fermentasi dibandingkan dengan kontrol (medium tanpa inokulasi isolat S. cerevisiae) dan kultur standarnya (S.cerevisiae ATCC 3015).
2). Uji Fermentasi Gula-gula dan Pembentukan Gas
Uji ini bertujuan untuk mengidentifikasi kemampuan S. cerevisiae dalam memfermentasi glukosa, laktosa, atau sukrosa. Pada uji ini, S. cerevisiae diinokulasikan pada medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) miring dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan dan pada permukaan medium diinokulasi secara goresan menggunakan jarum ose. Inkubasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 30°C. Diamati perubahan warna yang terjadi dibandingkan kontrol (medium tanpa inokulasi isolat S. cerevisiae). Apabila slant (bagian atas) dan butt (bagian bawah) berwarna kuning maka terjadi fermentasi glukosa, sukrosa, dan laktosa. Apabila slant berwarna kuning dan butt berwarna merah maka tidak terjadi fermentasi glukosa, sukrosa, dan laktosa. Sedangkan apabila slant berwarna merah dan
butt berwarna kuning maka yang difermentasikan hanya glukosa. Hasil pengamatan kemampuan S.cerevisiae dalam memfermentasi glukosa, laktosa, atau sukrosa dibandingkan dengan kontrol (medium tanpa inokulasi isolat S. cerevisiae) dan kultur standarnya (S.cerevisiae ATCC 3015).
Uji ini juga bertujuan untuk mengidentifikasi kemampuan S.cerevisiae membentuk gas dalam proses fermentasi. Pada uji ini, S.cerevisiae diinokulasikan juga pada medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) miring dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan. Inkubasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 30°C. Diamati adanya kenaikkan medium kepermukaan menunjukan adanya pembentukan gas. Hasil pengamatan kemampuan S.cerevisiae dalam menghasilkan gas dibandingkan dengan kontrol (medium tanpa inokulasi isolat S.cerevisiae) dan kultur standarnya (S.cerevisiae ATCC 3015).
3). Uji Asimilasi Nitrat
Uji ini bertujuan untuk mengidentifikasi kemampuan S.cerevisiae tidak mengasimilasikan nitrat menjadi nitrogen bebas. Pengujian ini dilakukan dengan menginokulasikan kultur S.cerevisiae pada medium nitrat-cair yang kemudian ditambahkan 1 ml asam sulfanilat dan 1 ml alpha naphtylamine. Inkubasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 30°C. Apabila digojog akan terbentuk warna merah menunjukkan adanya nitrat. Hal ini berarti nitrat tidak diasimilasi menjadi nitrogen bebas. Hasil pengamatan kemampuan S.cerevisiae yang tidak mengasimilasi nitrat dibandingkan
dengan kontrol (medium tanpa inokulasi isolat S.cerevisiae) dan kultur standarnya (S.cerevisiae ATCC 3015).