TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Asam Laktat (BAL)
Bakteri asam laktat menghasilkan sejumlah besar asam laktat sebagai hasil akhir dari metabolisme gula (karbohidrat). Dua kelompok kecil mikroorganisme dikenal dari kelompok ini yaitu bakteri yang bersifat homofermentatif dan heterofermentatif. Jenis homofermentatif yang terpenting menghasilkan hanya asam laktat dari metabolisme gula, sedang jenis heterofermentatif menghasilkan karbondioksida dan sedikit asam-asam volatil lain, alkohol dan ester disamping asam laktat. Bakteri asam laktat terdiri atas famili Lactobacillaceae, yaitu Lactobacillus, dan familiStreptococcaceae, terutamaLeuconostoc, Streptococcus danPediococcus. Streptococcus, Pediococcus dan beberapa spesies Lactobacillus bersifat homofermentatif, sedangkan Leuconostoc dan spesies Lactobacillus lain bersifat heterofermentatif (Winarno, 1989).
Beberapa jenis yang penting dari kelompok bakteri asam laktat yaitu : Lactobacillus lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum. Bakteri ini berbentuk batang, Gram positif dan sering membentuk pasangan dan rantai yang terdiri atas sel-sel. Spesies Lactobacillus umumnya lebih tahan pada keadaan asam daripada jenis-jenis Pediococcus atau Streptococcus dan menjadi lebih banyak terdapat pada tahapan terakhir dari fermentasi tipe asam laktat. Lactobacillus Sp penting sekali dalam fermentasi susu dan sayuran (Buckle et al., 1987).
Pengolahan pangan dan pakan menggunakan BAL adalah teknologi yang sejak dulu digunakan untuk meningkatkan kandungan obat dan anti penyakit serta mencegah kebusukan dan perjangkitan penyakit yang disebabkan bakteri patogen (Elegado et al., 2004). Bakteri asam laktat (BAL) banyak terdapat sebagai kontaminan alami pada beberapa jenis bahan mentah dan makanan dengan pengolahan minimal. BAL telah digunakan selama berabad-abad sebagai pengawet makanan utama melalui pengasaman fermentatif dengan asam laktat. Kebiasaan penggunaan BAL sebagai bakteri kultur starter dalam fermentasi dan kultur makanan menjadikan BAL sebagai mikroorganisme yang tidak berbahaya dan secara umum dikenal aman (GRAS atau generally-recognized-as-save). BAL juga menghasilkan substansi antimikroba lain seperti bakteriosin, hydrogen peroksida dan diasetil (Garver dan Muriana, 1993).
Lactobacillus plantarum
L. plantarum merupakan Lactobacilli yang bersifat homofermentatif dan mempunyai suhu optimum pertumbuhan yang lebih rendah (37 oC) dari BAL
heterofermentatif (Winarno, 1989). Bakteri ini memiliki sifat katalase negatif, aerob atau fakultatif anaerob, mampu mencairkan gelatin, cepat mencerna protein, tidak mereduksi nitrat, toleran terhadap asam dan mampu memproduksi asam laktat. L. plantarum membentuk koloni berukuran 2-3 mm, berwarna putih tidak tembus cahaya, cembung dan dikenal sebagai bakteri pembentuk asam laktat (Kuswanto dan Sudarmadji, 1988).
L. plantarum mampu merombak senyawa kompleks menjadi senyawa yang lebih sederhana dengan hasil akhir yaitu asam laktat. Menurut Buckleet al. (1987), asam laktat dapat menghasilkan pH yang rendah pada substrat sehingga menimbulkan suasana asam.L. plantarumdapat meningkatkan keasaman sebesar 1,5 sampai 2,0% pada substrat. L. plantarum memiliki kemampuan untuk menghambat bakteri patogen dan bakteri pembusuk, dalam keadaan asam.
GalurLactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12
L. plantarum 1A5 merupakan isolat bakteri asam laktat kelima dari daging sapi yang berasal dari pasar Anyar Bogor umur sembilan jam postmortem pada suhu ruang (Arief, 2005). L. plantarum 1B1 dan 2B2 diperoleh dari daging sapi yang berasal dari pasar Cibereum. L. plantarum1B1 adalah isolat BAL pertama dari daging sapi dengan masa penyimpanan 12 jam, sedangkan 2B2 merupakan isolat BAL kedua dari daging sapi dengan masa penyimpanan 34 jam. L. plantarum 2C12 merupakan isolat keduabelas yang diperoleh dari daging sapi asal pasar Ciampea dengan masa penyimpanan 34 jam (Wijayanto, 2009).
Menurut Firmansyah (2009) L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 adalah bakteri dengan bentuk batang (basil) dengan susunan tunggal atau pendek, memiliki karakteristik katalase negatif dan merupakan bakteri Gram positif. Kelima isolat tersebut mampu bertahan pada kondisi media tumbuh mengandung NaCl 6,5%. Isolat 1B1, 2B2 dan 2C12 dapat tumbuh pada suhu 15 oC dan dapat tumbuh dengan
mudah beradaptasi.L. plantarum1B1 dan 1A5 merupakan bakteri yang paling tahan terhadap asam kuat dan garam empedu (Wijayanto, 2009). 1B1 lebih sensitif terhadap kloramfenikol daripada antibiotik amoksilin, sedangkan 1A5 lebih mampu tumbuh pada media yang mengandung amoksilin dibandingkan dengan menggunakan kloramfenikol (Firmansyah, 2009).
L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 merupakan galur yang tahan pada kondisi usus (pH 7,2) dan mampu bertahan hidup dengan baik pada pH 2. Isolat BAL 1A5 dan 1B1 memiliki toleransi yang tinggi terhadap garam empedu dan mampu bertahan terhadap kondisi yang menekan, memiliki morfologi berbentuk batang, susunan tunggal maupun rantai pendek dan berpotensi sebagai kandidat probiotik (Wijayanto, 2009). Substrat antimokroba isolat 1A5 dan 1B1 dapat menghambat Staphylococcus aureus, S.Typhimurium danE. coli(Permanasari, 2008).
Ariefet al. (2008) melaporkan bahwa suatu senyawa antimikroba diproduksi bakteri asam laktat Lactobacillus sp. 2C12 yang diisolasi dari daging sapi lokal. Senyawa antimikroba tersebut dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen E. coli, S. Typhimurium dan S. aureus. Senyawa antimikroba yang diproduksi Lactobacillus sp. 2C12 mengandung bakteriosin. Menurut Widiasih (2008) L. plantarum2C12 berbentuk bulat, susunan tunggal dan berrantai pendek.
Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif
Bakteri dibedakan atas dua kelompok berdasarkan komposisi dinding sel serta sifat pewarnaan, yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Selain perbedaan dalam sifat pewarnaan, bakteri Gram positif dan Gram negatif juga berbeda dalam sensitivitas terhadap kerusakan mekanis atau fisis, terhadap enzim, desinfektan dan antibiotik. Beberapa perbedaan sifat-sifat bakteri Gram positif dan Gram negatif dapat dilihat pada Tabel 1. Bakteri Gram positif lebih sensitif terhadap penisilin, tetapi lebih tahan terhadap perlakuan fisik atau enzim dibandingkan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif lebih sensitif terhadap antibiotik seperti streptomisin. Bakteri Gram negatif bersifat lebih konstan terhadap reaksi pewarnaan, tetapi sifat pewarnaan bakteri Gram positif sering berubah sehingga menunjukkan reaksi gram variabel (Winarno, 1989).
Tabel 1. Perbedaan Relatif Sifat Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif
Sifat Perbedaan Relatif
Bakteri Gram Positif Bakteri Gram Negatif Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah
(1-4%) Kandungan lipid tinggi(11-12%) Ketahanan terhadap
antibiotic Lebih sensitif Lebih tahan
Penghambatan oleh
pewarna basa Lebih dihambat Kurang dihambat
Kebutuhan nutrient Kebanyakan spesies relatif
kompleks Relatif sederhana
Ketahanan
terhadap perlakuan fisik Lebih tahan Kurang tahan
Sumber : Winarno (1989)
Bakteri Patogen
Bakteri patogen adalah mikroorganisme yang menyebabkan penyakit. Bakteri tertentu dapat menyebabkan penyakit pada manusia. Beberapa jenis penyakit tersebut dapat dipindahkan lewat pangan, di antaranya keracunan makanan, kolera dan tifus (Gaman dan Sherrington, 1992).
Escherichia coli
E. coliterdapat secara normal dalam alat-alat pencernaan manusia dan hewan. Bakteri ini adalah Gram negatif, bergerak, berbentuk batang, bersifat fakultatif anaerob dan termasuk golonganEnterobacteriaceae. Suatuserotype tertentu bersifat enteropathogenik dan dikenal sebagai penyebab diare pada bayi. Beberapa galur lain juga sebagai penyebab diare pada orang dewasa (Buckle et al.,1987). E. colidapat tumbuh optimum pada pH 7,0-7,5 dengan pH minimum 4 dan pH maksimum 8,5. Bakteri ini sensitif terhadap panas dan pada makanan yang mengalami pemanasan. Suhu optimum pertumbuhan adalah 37oC dengan kisaran suhu 10-40oC (Frazier dan Westhoff, 1988).
Enteropatogenik E. coli (EPEC) merupakan mikroba penting penyebab diare pada bayi, terutama pada tempat dengan sanitasi rendah. Mereka menular secara langsung atau tidak langsung melalui manusia. Beberapa serotype dilibatkan pada perjangkitan penyakit melalui makanan dan air di beberapa negara.EPEC memiliki kemampuan untuk melakukan kontak fisik dengan sel epitel usus dan menyebabkan
menghasilkan faktor perlawanan, labil dan stabil terhadap panas, dan menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan penyakit. Enteroinvasive E. coli (EIEC) diketahui menyebabkan disentri yang mirip penyakit shigellosis. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) dikenal sebagai penyebab diare berdarah (hemoragic colitis) danhemoragic uremic syndrome(HUS) pada manusia (Ray, 2003).
Salmonella typhimurium
Salmonella adalah bakteri gram negatif, berbentuk batang bergerak dan mempunyai tipe metabolisme yang bersifat fakultatif anaerob. Salmonella termasuk kelompok bakteri Enterobacteriaceae. 2000 tipe Salmonella telah dibedakan secara serologis dan diberi nama khusus, sepertiSalmonella typhidanSalmonella paratyphi penyebab demam tipus. Penyakit tipus dapat mengakibatkan tingkat kematian sekitar 10%. Bakteri-bakteri ini sangat infektif karena hanya dengan sejumlah kurang dari 100 sel, cukup untuk menimbulkan penyakit (Buckleet al., 1987).
Salmonella merupakan bakteri yang tidak membentuk spora dan dapat memfermentasi glukosa dan biasa disertai dengan pembentukan gas tetapi tidak memfermentasikan laktosa maupun sukrosa (Frazier dan Westhoff, 1988). Salmonellasp. dapat tumbuh pada kisaran suhu antara 5 oC hingga 45-47oC dengan suhu optimum 35-37 oC.Salmonellasp. tumbuh pada tingkat keasamaan antara 4,5-5,4 dengan pH optimumnya sekitar 7 dan aw minimum 0,94. Nilai pH minimum
bervariasi tergantung pada suhu inkubasi, komposisi media, awdan jumlah sel. Pada
pH kurang dari 4,0 dan lebih dari 9,0, Salmonella akan mati secara perlahan. Salmonellasering terdapat pada daging dan jerohan, terutama pada unggas. Telur itik sering kali mengandung bakteri dan telur ayam mempunyai bakteri pada kulitnya. Susu segar dari sapi pembawa Salmonella dapat mengandung organisme hidup, tetapi akan mati selama pasteurisasi (Gaman dan Sherrington, 1992).
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonasadalah bakteri patogen gram negatif berbentuk batang kecil dan dapat bergerak, umumya berflagella polar tunggal dan mempunyai tipe metabolisme yang bersifat oksidatif. Bakteri ini dapat menyebabkan berbagai jenis kerusakan bahan pangan yang sebagian besar berhubungan dengan kemampuan spesies ini dalam memproduksi enzim yang dapat memecah baik komponen lemak maupun
protein dari bahan pangan (Buckle et al., 1987). Sifat-sifat Pseudomonas yang penting mempengaruhi pertumbuhannya pada makanan menurut Fardiaz (1992) sebagai berikut :
1. umumnya mendapatkan sumber karbon dari senyawa yang bukan karbohidrat;
2. dapat menggunakan senyawa-senyawa sumber nitrogen sederhana;
3. kebanyakan spesies tumbuh baik pada suhu rendah, kecuali P. aeruginosa danP. fluorescensyang dapat tumbuh pada suhu 37oC;
4. memproduksi senyawa-senyawa yang menimbulkan bau busuk; 5. dapat mensintesis faktor-faktor pertumbuhan dan vitamin;
6. beberapa spesies bersifat proteolitik dan lipolitik, atau pektinolitik;
7. pertumbuhan pada kondisi aerobik berjalan cepat, biasanya membentuk lendir;
8. beberapa spesies memproduksi pigmen, misalnya P. fluorescens memproduksi pigmen flouresein yang bersifat fluorosens dan larut dalam air, P. nigrifaciensmemproduksi pigmen hitam, danP. aeruginosamemproduksi pigmen piosianin yang berwarna biru;
9. kebanyakan Pseudomonas, kecuali P. syringe, bersifat oksidase positif yang akan membentuk warna biru jika ditambah senyawa dimetil-p-fenilenediamin dihidrokhlorida;
10. tidak tahan terhadap panas dan keadaan kering, oleh karena itu mudah dibunuh dengan proses pemanasan dan pengeringan.
P. aeruginosa merupakan bakteri Gram negatif, berbentuk batang lurus atau lengkung, berukuran sekitar 0,6 x 2 μm, ditemukan tunggal, berpasangan, dan kadang-kadang membentuk rantai pendek, tidak mempunyai spora, tidak mempunyai selubung dan mempunyai flagel (Madigan et al., 2003). Namun bakteri ini kadang-kadang memiliki dua atau tiga flagel sehingga selalu bergerak. P. aeruginosa merupakan bakteri aerob yang dapat tumbuh dengan mudah pada banyak jenis media pembiakan, karena memiliki kebutuhan nutrisi yang sangat sederhana (Todar, 2004).
aeruginosadi lingkungan rumah sakit dapat ditemukan pada alat-alat kesehatan, alat bantu pernafasan, makanan, saluran pembuangan air dan kain pel. Infeksi P. aeruginosa terjadi pada orang yang memiliki ketahanan tubuh yang menurun, yaitu pada penderita luka bakar, orang yang sakit berat, penderita penyakit metabolik atau mereka pasien yang sebelumnya menggunakan alat-alat bantu kedokteran (Todar, 2004).
Komponen Antimikrob
Makanan mungkin mengandung komponen yang dapat menghambat pertumbuhan jasad renik. Komponen antimikroba tersebut terdapat di dalam makanan melalui beberapa cara yaitu : (1) terdapat secara alamiah di dalam bahan pangan, (2) ditambahkan dengan sengaja ke dalam makanan, (3) terbentuk selama pengolahan atau oleh jasad renik yang tumbuh selama fermentasi makanan. Komponen antimikroba yang terdapat secara alami di dalam bahan pangan, misalnya laktenin dan faktor antikoliform di dalam susu, lisozim di dalam putih telur, dan asam benzoat di dalam buah tertentu (cranberries). Beberapa komponen antimikroba mungkin ditambahkan secara sengaja dalam pengolahan, misalnya asam benzoat di dalam sari buah dan jeli, asam propionat di dalam roti dan keju, asam sorbet di dalam keju dan produk buah-buahan. Jasad renik yang tumbuh pada makanan mungkin memproduksi komponen yang menghambat jasad renik lain, misalnya asam, alkohol, peroksida dan antibiotik (Winarno, 1989).
Komponen kimia yang bersifat membunuh jasad renik disebut mempunyai sifat bakterisidal (membunuh bakteri) atau fungisidal (membunuh fungi). Beberapa komponen kimia pada konsentrasi rendah tidak dapat membunuh jasad renik, tetapi hanya menghambat pertumbuhannya, misalnya senyawa tertentu yang terdapat pada rempah-rempah. Komponen tersebut disebut mempunyai sifat bakteriostatik (menghambat pertumbuhan bakteri) atau fungistatik (menghambat pertumbuhan fungi). Komponen kimia yang bersifat membunuh lebih baik dari pada yang hanya bersifat menghambat (Winarno, 1989).
Pertahanan beberapa makanan melawan serangan mikroorganisme harusnya terdapat dalam pembentukan substansi tertentu secara alami yang menunjukkan aktivitas antimikroba. Beberapa spesies diketahui menghasilkan minyak esensial yang memiliki aktivitas antimikrob. Contohnya eugenol dalam cengkeh, allicin
dalam bawang putih, sinnamic aldehid dan eugenol dalam kayu manis, allil isotiosianat dalam mustard, eugenol dan timol dalam oregano. Susu sapi terdiri atas beberapa substansi antimikrob, termasuk laktoferin, konglutinin, dan sistem laktoperoksidase. Telur terdiri atas lisozim yang merupakan antimikrob yang efisien pada telur segar. Asam hidroksisinamik buatan (p-coumaric, ferulic, caffeic, dan asam klorogeni) ditemukan pada buah-buahan, sayur-sayuran, teh dan molases yang semuanya menunjukkan aktivitas antibakteri dan beberapa antifungi (Jay, 2000). Kekuatan penghambatan suatu senyawa antimikrob dapat dikategorikan berdasarkan panjang diameter zona hambat yang terbentuk pada uji difusi sumur. Kategori penghambatan tersebut dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Kategori Penghambatan Antimikrob Berdasarkan Diameter Zona Hambat Diameter Zona Hambat Kategori Penghambatan
0-3 mm Lemah
3-6 mm Sedang
>6 mm Kuat
Sumber : Panet al. (2009)
Bakteriosin
BAL diteliti, terutama sekali mengenai produksi bakteriosinnya yang dapat meminimalkan atau mengganti penggunaan pengawet kimia berbahaya bagi kesehatan manusia dan hewan. Bakteriosin adalah protein antimikrob yang dapat digunakan sebagai pengawet (Elegado et al., 2004). Bakteriosin adalah kelompok bioaktif peptida yang diproduksi oleh banyak galur bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteriosin juga diproduksi banyak strain dari bakteri asam laktat dan beberapa bakteri asam propionat. Bakteriosin memiliki kepentingan khusus dalam mikrobiologi pangan karena kemampuan dalam memberikan efek bakterisidal secara normal terhadap bakteri patogen Gram positif dan bakterisidal terhadap bakteri Gram negatif pada kondisi di bawah tekanan. Bakteriosin dari bakteri asam laktat bersifat bakterisidal terhadap sel sensitif dan membunuh dengan sangat cepat pada konsentrasi rendah. Bakteri Gram negatif menjadi sensitif terhadap bakteriosin jika struktur permukaan lipopolisakaridanya dilemahkan dengan cara pemberian tekanan
lisis pada sel sensitif. Secara kimia, protein bakteriosin disintesis secara ribosomal, kationik, amphipathik, memiliki struktur α-helik dan β-sheet, atau keduanya, dan dapat memiliki thioether, jembatan disulfid atau bebas dari kelompok thiol. Keberadaan struktur amphipathik α-helik menjadikan bakteriosin dapat berinteraksi dengan fase cair dan lemak ketika berikatan pada permukaan membran sensitif sel bakteri, dan mengawali fungsinya untuk merusak kestabilan dan membunuh sel (Ray, 2003).
Bakteriosin merupakan peptida yang disintesis secara ribosomal, menunjukkan aktivitas antibakteri. Bakteriosin dapat melawan bakteri yang berhubungan dekat dengan mikroorganisme penghasil. Beberapa bakteriosin dari bakteri gram positif menunjukkan aktivitas bakterisidal dan memiliki spektrum penghambatan luas sehingga mungkin bermanfaat sebagai agen antibakteri untuk berbagai aplikasi (Hataet al., 2010).
Bakteriosin tidak seperti antibiotik. Bakteriosin hanya menghambat spesies yang berhubungan dekat dan strain bakteri Gram positif. Bakteriosin terdiri dari protein kecil, dan sebagian besar semi plasma. Hal tersebut menunjukkan bahwa beberapa spesies dan semua strain bakteri asam laktat memiliki kemampuan untuk menghasilkan bakteriosin atau komponen seperti bakteriosin (Jay, 2000).
Plantarisin
Plantarisin ASM1 (PASM1) diproduksi L. plantarum A-1. PASM1 menunjukkan kestabilan untuk pemanasan dan batasan yang luas dari kondisi pH, khususnya pada pH netral dan alkali, dibandingkan dengan nisin A. PASM1 menunjukkan spektrum antibakteri, aktivitas antibakteri melawan bakteri yang berhubungan dekat dengan mikroorganisme penghasil seperti strain Lactobacillus, sama seperti bakteriosin yang lain. Penambahan PASM1 ke dalam makanan dapat menghambat pertumbuhan patogen (Hata et al., 2010). Jenis plantarisin lain seperti plantarisin MG dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram Positif seperti Staphilococcus aureus dan juga Gram Negatif seperti E. coli, Pseudomonas, dan S. typhimurium(Gonget al., 2010).
Galur L. plantarum BS dan bakteriosin semi-purifikasinya telah ditemukan memiliki potensi penghambatan melawan kontaminasi makanan dan patogen seperti Bacilli Spp., Enterococci Spp. dan Listeria Spp. Bakteriosin yang dihasilkan L.
plantarum BS dapat menghambat 26 spesies bakteri Gram positif dan tiga spesies bakteri Gram negatif. Namun bakteriosin ini tidak menunjukkan penghambatan terhadap E. coli dan S. typhimurium (Elegado et al., 2004). Jenis plantarisin lain yaitu plantarisin S (PLS) merupakan salah satu dari dua bakteriosin yang dihasilkan L. plantarumLPCO10. Penelitian mengindikasikan bahwa bakteriosin ini terdiri atas dua peptid berbeda yang memiliki sifat saling melengkapi untuk aktifitas total PLS (Jimenez-Diazet al.,1995).
Nilai MIC
Penghambatan mikroba oleh suatu senyawa antimikroba dapat dinyatakan dalam nilai Minimum Inhibitory Concentration (MIC). Nilai MIC yaitu konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba sebanyak 90% dari inokulum asal selama inkubasi 24 jam (Kubo et al., 1993). Nilai MIC senyawa antimikrob yang lebih rendah menunjukkan bakteri lebih sensitif terhadap senyawa tersebut (Naufalin, 2005).
Penentuan nilai MIC substrat antimikroba dilakukan untuk menentukan besarnya aktivitas zat terhadap bakteri indikator. Spektrum penghambatan ekstrak supernatan bebas sel L. plantarum 1A5 relatif sempit pada tahap purifikasi parsial supernatan bebas sel, yaitu mempunyai aktivitas penghambatan yang kuat terhadap bakteri Gram positif dan lemah terhadap Gram negatif. Nilai MIC terhadapS. aureus ATCC 25923 ditunjukkan dengan 70% konsentrasi supernatan bebas sel 1A5. Konsentrasi supernatan bebas sel 1A5 sebesar 70% tersebut dapat menghambat pertumbuhan bakteri indikator hingga mencapai (4,93 ± 0,9) log cfu/ml selama 24-48 jam masa inkubasi. Nilai Minimum Bactericide Concentration (MBC) supernatan bebas sel 1A5 ditunjukkan pada konsentrasi sebesar 80% yang dapat membunuh tiga log cfu/ml S. aureus ATCC 25923 hingga mencapai (3,46 ± 0,6) log cfu/ml selama 24-48 jam masa inkubasi (Syahniar, 2009).
Konsentrasi minimum supernatan bebas sel 2B2 terhadap S. aureus ATCC 25923 yaitu sebesar 70 % dengan pengurangan populasi S. aureussebanyak 1,67 log cfu/ml. MBC yaitu kemampuan substrat antimikroba mengurangi bakteri indikator sebesar 3 log cfu/ ml. MBC terjadi pada konsentrasi supernatan bebas sel 2B2
