UJI AKTIVITAS ANTIMIKROBA DARI EKSTRAK DAN FRAKSI AKTIF BUAH CABAI KATOKKON
(Capsicum annuum L. var. chinensis) SECARA KLT- BIOAUTOGRAFI
IIN FITRIANA PAKATA N111 09 272
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2013
UJI AKTIVITAS ANTIMIKROBA DARI EKSTRAK DAN FRAKSI AKTIF BUAH CABAI KATOKKON
(Capsicum annuum L. var. chinensis) SECARA KLT- BIOAUTOGRAFI
SKRIPSI
untuk melengkapi tugas-tugas dan memenuhi syarat-syarat untuk mencapai gelar sarjana
IIN FITRIANA PAKATA N111 09 272
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR 2013
PERSETUJUAN
UJI AKTIVITAS ANTIMIKROBA DARI EKSTRAK DAN FRAKSI AKTIF BUAH CABAI KATOKKON (Capsicum annuum L. var. chinensis)
SECARA KLT-BIOAUTOGRAFI
IINFITRIANA PAKATA N111 09 272
Disetujui oleh:
Pembimbing Utama
Dr. Herlina Rante, M.Si, Apt NIP.19771125 200212 2 003
Pembimbing Pertama Pembimbing Kedua
Abd. Rahim, S.Si, M.Si., Apt Dra. Christiana Lethe, M.Si., Apt NIP.19771111 200812 1 001 NIP.19481002 198203 2 001
Pada tanggal, 28 Mei 2013
PENGESAHAN
UJI AKTIVITAS ANTIMIKROBA DARI EKSTRAK DAN FRAKSI AKTIF BUAH CABAI KATOKKON (Capsicum annuum L. var. chinensis)
SECARA KLT-BIOAUTOGRAFI
Oleh :
IIN FITRIANA PAKATA N111 09 272
Dipertahankan Dihadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin
Pada tanggal : 28 Mei 2013 Panitia Penguji Skripsi :
1. Prof.Dr. H. M. Natsir Djide, MS., Apt.. ( Ketua ) : ...
2. Dr. Hj. Latifah Rahman, DESS., Apt. ( Sekretaris ) : ...
3. Dr. Herlina Rante, S.Si., M.Si., Apt. ( Ex officio ) : ...
4. Abdul Rahim, S.Si., M.Si., Apt. ( Ex officio ) : ...
5. Dra. Christiana Lethe, M.Si., Apt. ( Ex officio) : ...
6. Drs. H. Syaharuddin Kasim, M.Si., Apt. ( Anggota) : ...
Mengetahui :
Dekan Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin
Prof. Dr. Elly Wahyudin, DEA, Apt.
NIP. 19560114 198601 2 001
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi ini adalah karya saya sendiri, tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu Perguruan Tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka
.
Apabila dikemudian hari terbukti bahwa pernyataan saya ini tidak benar, maka skripsi dan gelar yang diperoleh, batal demi hukum.
Makassar, 28 Mei 2013
Penyusun
Iin Fitriana Pakata
UCAPAN TERIMA KASIH
Puji syukur penulis ucapkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena atas nikmat, berkat dan kuasa-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir ini sebagai persyaratan untuk menyelesaikan studi di Fakultas Farmasi, Universitas Hasanuddin.
Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini banyak rintangan dan hambatan yang dihadapi, namun dengan doa dan bantuan dari berbagai pihak, skripsi ini dapat terselesaikan. Oleh karena itu, perkenankanlah penulis mengungkapkan rasa terima kasih dan penghargaan yang tulus kepada ayahanda Set Sonda dan ibunda tersayang Neny Pakata, tante terkasih Sudiana Andayo (alm), kakek dan nenek tercinta yang telah banyak memberikan pengorbanan baik moril maupun materil yang tidak akan mampu penulis balas sampai akhir hayat, di dalam doa yang senantiasa dipanjatkan sebagai pemacu penulis dalam menghadapi tantangan maupun rintangan selama ananda menjalani dunia perkuliahan. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada adik tercinta: Jayanti P, Arif Restu P, Raihan P, dan Khaerunnisa P, dan untuk seluruh sanak famili yang selalu memberikan curahan kasih sayang yang sebesar-besarnya dan tak henti-henti memberikan semangat dan dukungan.
Tiada kata yang dapat penulis ucapkan selain terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Herlina Rante, S.Si., M.Si., Apt. selaku pembimbing utama, Abdul Rahim, S.Si., M.Si., Apt. selaku pembimbing
pertama dan Dra. Christiana Lethe, M.Si., Apt. selaku pembimbing kedua yang telah meluangkan waktu selama ini untuk memberi petunjuk, membagi ilmu dan menyumbangkan ide-ide dalam membimbing penulis selama melakukan penelitian hingga terselesainya skripsi ini.
Pada kesempataan kali ini pula, penulis menyampaikan terima kasih kepada:
1. Ibu Prof. Dr. Elly Wahyudin, DEA, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin sekaligus penasehat akademik yang telah memberikan bimbingan dan masukan yang bermakna bagi penulis.
2. Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si, Apt. selaku Wakil Dekan I, Prof. Dr. Rer- nat. Hj. Marianti A. Manggau, Apt. selaku Wakil Dekan II, dan Drs.Abd.
Muzakkir Rewa, M.Si., Apt. selaku Wakil Dekan III.
3. Prof.Dr. H. M. Natsir Djide, MS., Apt., Dr. Hj. Latifah Rahman, DESS., Apt., Drs. H. Syaharuddin Kasim, M.Si., Apt., selaku penguji penulis 4. Seluruh dosen dan staf Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin atas
bantuannya dalam penyelesaiaan skripsi ini
5. Teman-teman Ginkgo 09, khususnya Sitti Inayyah Arista, Sallmia, Suhariani La Suda, Asmira Azisa Nur, Merliana Mansyur, Cahyani Purnasari, dan Hijrah Al Kautsar.
6. Teman seperjuangan dalam penelitian cabai katokkon, Soendaria Intan dan Suhermawan.
7. Kak Haslia S.Si, selaku Laboran Laboratorium Mikrobiologi Farmasi Universitas Hasanuddin
8. Semua pihak yang tidak sempat disebutkan namanya atas bantuan dan kerjasamanya kepada penulis selama penelitian dan menjalani penelitian.
Penulis menyadari skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Maka dari itu saran dan kritik membangun sangat penulis harapkan guna tambahan wawasan agar dalam pengerjaan penelitian selanjutnya dapat lebih baik.
Akhirnya semoga karya kecil ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan terutama di bidang farmasi, amin.
Makassar, 28 Mei 2013
Iin Fitriana Pakata
ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian tentang uji aktivitas antimikroba dari ekstrak dan fraksi aktif buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var.
chinensis) secara KLT-bioautografi. Cabai katokkon dimaserasi menggunakan etanol 70% lalu dipartisi dengan metode ekstraksi cair padat secara berturut-turut dengan n-heksan, kloroform, dan etilasetat.
Sehingga diperoleh ekstrak etanol, n-heksan, kloroform, dan ekstrak etilasetat. Uji aktivitas antimikroba keempat ekstrak menggunakan metode difusi agar pada medium Nutrient Agar untuk Escherichia coli dan Staphylococcus aureus, serta Potato Dextrose Agar untuk Malassezia furfur. Hasil uji aktivitas antimikroba keempat ekstrak hanya menunjukkan aktivitas antimikroba terhadap Malassezia furfur. Ekstrak n-heksan memiliki aktivitas terbesar terhadap Malassezia furfur dengan diameter zona hambat 23,3 mm (100 mg/mL). Hasil uji KLT-Bioautografi dari ektrak n-heksan terhadap Malassezia furfur tidak memperlihatkan adanya noda yang aktif. Hasil identifikasi dengan KLT menunjukkan ekstrak n-heksan diduga mengandung senyawa aktif golongan alkaloid, steroid, fenolik, dan flavanoid.
ABSTRACT
A research of the antimicrobial activity test on fruits extract and active fractions of katokkon pepper (Capsicum annuum L. var. chinensis) by KLT-bioautografi method has been done. The katokkon peppers macerated using ethanol 70% and then partitioned with solid liquid extraction method successively with n-hexane, chloroform and ethyl acetate. It is obtained extract of ethanol, n-hexane, chloroform and ethyl acetate. The antimicrobial activity test fourth extracts using agar diffusion method on medium Nutrient Agar for Escherichia coli and Staphylococcus aureus, as well as Potato Dextrose Agar for Malassezia furfur. The result of antimicrobial activity test of fourth extracts showed only antimicrobial activity against Malassezia furfur. The n-hexane extract has the greatest activity against Malassezia furfur with inhibition zone diameter of 23.3 mm (100 mg / mL). The TLC-Bioautografi test results on the n-hexane extracts against Malassezia furfur does not show any active spots. Results of identification by TLC shows the n-hexane extract thought to contain coumpounds of class alkaloid, steroid, phenolic, and flavonoid.
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN SAMPUL ... i
HALAMAN PENUNJUK ... ii
HALAMAN PERSETUJUAN ... iii
HALAMAN PENGESAHAN ... iv
HALAMAN PERNYATAAN ... v
UCAPAN TERIMA KASIH ... vi
ABSTRAK ... ix
ABSTRACT ... x
DAFTAR ISI ... xi
DAFTAR TABEL ... xiv
DAFTAR GAMBAR ... xv
DAFTAR LAMPIRAN ... xvi
BAB I PENDAHULUAN ... 1
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 3
II.1 Uraian Tanaman ... 3
II.1.1 Klasifikasi Tanaman ... 3
II.1.2 Nama Daerah ... 3
II.1.3 Morfologi Tanaman ... 3
II.1.4 Kandungan Kimia ... 4
II.2 Metode Penyarian ... 4
II.3 Metode KLT-Bioautografi ... 6
II.3.1 Kromatografi Lapis Tipis ... 6
II.3.2 Bioautografi ... 7
II.4 Uraian Umum Antimikroba ... 10
II.5 Uraian Umum Uji Mikrobiologi ... 13
II.6 Uraian Mikroba Uji ... 14
II.6.1 Eschericia coli ... 14
II.6.2 Staphylococcus aureus ... 15
II.6.3 Malassezia furfur ... 16
BAB III PELAKSANAAN PENELITIAN ... 17
III.1 Alat dan Bahan yang Digunakan ... 17
III.2 Metode Kerja ... 17
III.2.1 Pengambilan Sampel ... 17
III.2.2 Ekstraksi Sampel ... 17
III.2.3 Sterilisasi Alat ... 18
III.2.4 Pembuatan Medium NA ... 19
III.2.5 Pembuatan PDA ... 19
III.2.6 Penyiapan Mikroba Uji ... 19
III.2.7 Penyiapan Ekstrak ... 20
III.2.8 Uji Aktivitas Antimikroba ... 20
III.2.9 Uji KLT-Bioautografi ... 21
III.2.10 Identifikasi Komponen Kimia ... 21
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 23
IV.1 Hasil Penelitian ... 23
IV.1.1 Ekstraksi ... 23
IV.1.2 Uji Aktivitas Antimikroba ... 24
IV.1.3 Uji KLT-Bioautografi ... 25
IV.1.4 Identifikasi Komponen Kimia ... 26
IV.2 Pembahasan ... 26
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 32
V.1 Kesimpulan ... 32
V.2 Saran ... 32
DAFTAR PUSTAKA ... 33
Lampiran ... 36
DAFTAR TABEL
TABEL Halaman 1. Hasil uji aktivitas antimikroba ekstrak buah cabai katokkon
(Capsicum annuum L. var. chinensis) ... 25 2. Hasil uji identifikasi komponen kimia ekstrak n- heksan buah cabai
katokkon (capsicum annuum L. var. chinensis) ... 26
DAFTAR GAMBAR
GAMBAR Halaman 1. Kromatogram lapis tipis ekstrak buah cabai katokkon (Capsicum
annuum L. var. chinensis) ... 23 2. Hasil uji aktivitas antimikroba ekstrak buah cabai katokkon (Capsicum
annuum L. var. chinensis) terhadap jamur Malassezia furfur ... 24 3. Hasil KLT-Bioautografi ekstrak n-heksan buah cabai katokkon
(Capsicum annuum L. var. chinensis) terhadap jamur Malassezia furfur ... 25 4. Histogram pengukuran diameter zona hambat ekstrak buah cabai
katokkon (Capsicum annuum L. var. Chinensis) terhadap jamur Malassezia furfur ... 29 5. Foto tanaman cabai katokkon (Capsicum annuum L. var.
chinensis) ... 39 6. Foto sampel buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var.
chinensis) ... 39
7. Ekstrak buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis) 39 8. Kromatogram lapis tipis ekstrak n-heksan buah cabai katokkon
(Capsicum annuum L. var. chinensis) ... 40
DAFTAR LAMPIRAN
LAMPIRAN Halaman
1. Skema kerja ... 36
2. Bukti determinasi sampel buah cabai katokkon ... 38
3. Gambar hasil penelitian ... 39
4. Komposisi reagen ... 41
BAB I PENDAHULUAN
Antimikroba adalah bahan atau obat yang digunakan untuk memberantas mikroba yang merugikan manusia, seperti golongan antibiotika, antiseptika, disinfektansia, dan preservatif. Penggunaan antimikroba khususnya antibiotik sering menimbulkan kegagalan terapi.
Salah satu penyebabnya yaitu resistensi antimikroba. Resistensi ini disebabkan oleh ketahanan mikroorganisme terhadap antimikroba karena kemampuan bakteri untuk beradaptasi dengan cepat dengan lingkungan karena adanya molekul antimikroba (mutasi) (1,2,3)
Resistensi antimikroba merupakan masalah global yang menimbulkan masalah klinis yang besar dalam pengobatan penyakit infeksi. Banyak pasien menderita kerugian karena infeksi yang disebabkan oleh mikroba yang tidak lagi rentan terhadap obat-obatan yang biasa digunakan untuk mengobatinya. Meningkatnya resistensi antimikroba dapat meningkatkan kegagalan pengobatan. Untuk mengatasi hal ini dilakukan penelitian terhadap bahan alam untuk memperoleh antimikroba yang baru dan alami. Beberapa ektrak tanaman telah diteliti memiliki kemampuan sebagai antimikroba (4,5,6).
Salah satu tanaman yang berkhasiat sebagai antimikroba adalah cabai. Meskipun mengandung tingkat capsaicin yang berbeda, ekstrak etanol dari beberapa jenis cabai menunjukkan potensi aktivitas
antimikroba terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif, serta fungi (7,8).
Nilai MIC dari ekstrak mentah C.annum yaitu 10-17,5 mg/mL terhadap E. coli, S. aureus, S .epidermidis, B. subtilis, P. aeruginosa, A.
niger, C. albicans. Uji bioautografi menunjukkan bahwa capsaicin adalah komponen utama sebagai antimikroba serta adanya sinergis capsaicin dengan komponen zat lain yang terdapat dalam ekstrak cabai (7,8).
Cabai katokkon adalah salah satu jenis cabai yang tumbuh di daerah Sulawesi Selatan khususnya di Tana Toraja. Cabai ini oleh masyarakat Tana Toraja dianggap memiliki tingkat kepedasan yang tinggi dibandingkan dengan jenis cabai lainnya. Cabai katokkon merupakan salah satu varietas dari Capsicum annum yaitu Capsicum annuum L. var.
chinensis yang belum dilaporkan manfaatnya sebagai antimikroba.
Berdasarkan uraian di atas, cabai Katokkon diduga memiliki kandungan capsaicin yang memiliki aktivitas antimikroba seperti jenis cabai lainnya. Maksud penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas antimikroba dari cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis).
Tujuan untuk mengetahui aktivitas cabai katokkon (Capsicum annuum L.
var. chinensis) sebagai antimikroba. Oleh karena itu, telah dilakukan uji aktivitas antimikroba dari ekstrak dan fraksi aktif buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis) secara KLT-Bioautografi.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1 Uraian Tanaman
II.1.1 Klasifikasi Tanaman (Lampiran 2)
Kerajaan : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Anak Divisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledoneae
Bangsa : Solanales/ Tubiflorae
Suku : Solanaceae
Marga : Capsicum
Jenis : Capsicum annuum L. var. chinensis
II.1.2 Nama Daerah
Toraja : Lada katokkon II.1.3 Morfologi Tanaman
Tumbuhan berupa terna atau setengah perdu, dengan tinggi 45- 100 cm, biasanya berumur hanya semusim. Bunga tunggal dan muncul di bagian ujung ranting, posisinya menggantung; mahkota bunga berwarna putih, berbentuk seperti bintang. Kelopak seperti lonceng. Buah tunggal pada setiap ruas, bervariasi dalam ukuran, bentuk, warna dan tingkat kepedasan; bentuk buah seperti garis, menyerupai kerucut, seperti tabung memanjang, seperti lonceng atau berbentuk bulat; warna buah setelah
masak bervariasi dari merah, jingga, kuning atau keunguan; posisi buah menggantung. Biji berwarna kuning pucat (9).
II.1.4 Kandungan Kimia Tanaman
Buah Capsicum mengandung pigmen pewarna, dasar kepedasan, resin, protein, selulosa, pentosan, unsur mineral, dan minyak atsiri sangat sedikit. Kandungan utama dalam buah Capsicum adalah capsaicin dan dihydrocapsaicin. Campuran capsaicin dan dihydrocapsaicin berperan dalam kepedasan disebut capsaicinoid. Capsaicinoids adalah kelompok alami alkaloid yang bertanggung jawab atas kepedasan dari buah Capsicum (10, 11).
II.2 Metode Penyarian
Ekstraksi (sebagai istilah yang digunakan farmasi) adalah pemisahan zat aktif dari jaringan tanaman atau hewan menggunakan pelarut selektif melalui prosedur standar. Produk yang diperoleh dari tanaman adalah campuran metabolit yang relatif kompleks, dalam keadaan cair atau setengah padat atau setelah pelarut dihilangkan, dalam bentuk bubuk kering, dan dimaksudkan untuk penggunaan oral atau eksternal. Ini termasuk kelas persiapan dikenal sebagai decoctions, infus, cairan ekstrak, tingtur, pilular (semisolid) ekstrak atau ekstrak bubuk (12).
Metode ekstraksi yang digunakan farmasi melibatkan pemisahan zat aktif jaringan tanaman dari komponen inaktif / inert dengan menggunakan pelarut selektif. Selama ekstraksi, pelarut berdifusi ke
dalam bahan tanaman padat dan melarutkan senyawa dengan polaritas yang sama (12).
Parameter dasar yang mempengaruhi kualitas ekstrak adalah (12):
1. Bagian tanaman yang digunakan sebagai bahan awal 2. Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi
3. Prosedur ekstraksi
Pengaruh fitokimia tanaman yang diekstraksi tergantung pada (12) :
1. Sifat dari bahan tanaman 2. Asal tanaman
3. Tingkat pengolahan 4. Kadar air
5. Ukuran partikel
Variasi dalam metode ekstraksi yang berbeda yang akan mempengaruhi kuantitas dan komposisi metabolit sekunder dari ekstrak, tergantung pada (12):
1. Jenis ekstraksi 2. Waktu ekstraksi 3. Suhu
4. Sifat pelarut
5. Konsentrasi pelarut 6. Polaritas
Dalam maserasi (untuk ekstrak cair), seluruh atau bubuk kasar tanaman obat disimpan dalam dalam wadah tutup yang berisi pelarut
untuk periode tertentu dengan agitasi sering sampai bahan larut dengan pelarut. Metode ini paling cocok untuk digunakan dalam kasus obat termolabil (12).
Maserasi merupakan penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam carian penyari.
Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat akan terdesak ke luar. Peristiwa tersebut berulang- ulang sehingga terjadi kesetimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel (13,14).
II.3 Metode KLT-Bioautografi II.3.1 Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi adalah suatu metode analisis yang terdiri dari fase gerak dan fase diam. Fase gerak akan melewati fase diam sehingga campuran zat dapat dipisahkan menjadi komponen-komponennya.
Meskipun dasar kromatografi adalah suatu proses pemisahan namun juga digunakan untuk analisis kuantitatif. Jenis-jenis kromatografi yang bermanfaat untuk analisis kualitatif dan analisis kuantitatif adalah kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis (KLT), kromatorafi kolom, kromatografi gas, dan kromatografi cair kinerja tinggi (15,16).
Prinsip KLT adalah pemisahan komponen kimia berdasarkan prinsip adsorpsi dan partisi. Pada pemisahannya fase gerak akan membawa komponen campuran sepanjang fase diam pada pelat sehingga terbentuk kromatogram (15).
Harga Rf dapat dihitung dengan menggunakan perbandingan sebagaimana dalam persamaan (16):
Nilai Rf = 𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢 𝑠𝑒𝑛𝑦𝑎𝑤𝑎 𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘
II.3.2 Bioautografi
Bioautografi adalah teknik laboratorium untuk mendeteksi zat yang mempengaruhi tingkat pertumbuhan organisme uji dalam campuran yang kompleks dan matriks. Metode ini didasarkan pada aktivitas biologis dari analit, yang dapat berupa antibakteri, antijamur, antitumor, antiprotozoa (17).
Bidang utama bioautografi adalah (17):
1. Mencari zat antibiotik baru dan baru antijamur, antitumor, dan antiprotozoae senyawa dengan mempelajari aktivitas biologis zat yang berasal dari tanaman, mikroorganisme atau kombinasi zat kimia
2. Penyelidikan antibiotik dan senyawa biologis-aktif lainnya dalam air limbah, air minum, cairan tubuh, makanan
3. Kontrol kualitas obat-obatan antibiotik
4. Mencari senyawa antimikroba yang efektif melawan bakteri patogen tanaman dan jamur
5. Deteksi dan penentuan senyawa beracun (misalnya, aflatoksin) atau fototoksik (misalnya, furocoumarins).
Metode bioautografi biasanya dibagi menjadi tiga kategori:
1. Difusi agar atau bioautografi kontak.
Dalam bioautografi kontak, antimikroba berdifusi dari plat TLC atau kertas ke agar inokulasi. Kromatogram ditempatkan menghadap ke bawah agar inokulasi dan dibiarkan selama beberapa menit atau jam untuk memungkinkan difusi. Kemudian kromatogram dipindahkan dan lapisan agar diinkubasi. Zona hambat diamati pada permukaan agar di tempat di mana noda antimikroba yang menempel pada agar. Metode ini menyerupai alat tes disk. Kelemahan dari bioautografi kontak adalah kesulitan dalam memperoleh kontak sempurna antara agar dan plat dan kepatuhan dari adsorben ke permukaan agar. Kekurangan ini dihindari dengan menerapkan penggunaan kromatografi lembaran serat kaca asam silikat, chromar.15 Namun, dasar dari metode ini sama dan antimikroba harus ditransfer dari lembar ke agar menyebabkan kerugian dan dilusi (17).
2. Perendaman atau bioautografi agar-overlay.
Dalam bioautografi perendaman, kromatogram ditutupi dengan media, agar yang cair. Setelah pemadatan, inkubasi dan noda penghambatan (biasanya dengan pencelupan tetrazolium) atau pertumbuhan koloni pertumbuhan adalah akan tampak. Kadang-kadang, sebelum inkubasi, plat yang tersisa selama beberapa jam pada suhu rendah untuk memungkinkan diffusi. Agar-overlay adalah penggabungan
antara bioautografi kontak dan bioautografi langsung. Antimikroba ditransfer dari pelat TLC ke lapisan agar seperti dalam uji kontak tetapi selama inkubasi dan visualisasi lapisan agar tetap dalam plat seperti dalam bioautografi langsung. Kerugian utama dari metode ini adalah sensitivitas yang lebih rendah disebabkan oleh cairan antibakteri dalam lapisan agar dibandingkan dengan bioautografi langsung. Agar- overlay disarankan terutama ketika bioautografi langsung adalah tidak memungikinkan untuk dilakukan (17).
3. Bioautografi langsung.
Dalam bioautografi langsung, pengembangan palt dicelupkan dalam suspensi mikroorganisme yang tumbuh dalam kaldu cocok atau suspensi ini disemprotkan ke plate. Plat ini diinkubasi dan mikroorganisme tumbuh secara langsung di atasnya. Oleh karena itu, pemisahan, penyiapan, inkubasi dan visualisasi yang dilakukan langsung di plat. Untuk lokasi dan visualisasi antibakteri garam tetrazolium biasanya digunakan, yang dikonversi oleh dehydrogenases oleh mikroorganisme hidup untuk intens berwarna, formazan. Bakteri yang dibunuh oleh antimikroba pada pelat TLC mengakibatkan warna tidak diproduksi di tempat noda antibakteri dan disebut zona penghambatan yang pucat yang terbentuk pada latar belakang berwarna (17).
II.4 Uraian Umum Antimikroba
Antimikroba adalah bahan atau obat yang digunakan untuk memberantas mikroba yang merugikan manusia, seperti golongan
antibiotika, antiseptika, disinfektansia, dan preservatif. Penggunaan antimikroba khususnya antibiotik sering menimbulkan kegagalan terapi.
Salah satu penyebabnya yaitu retensi antimikroba. Retensi ini disebabkan oleh ketahanan mikroorganisme terhadap antimikroba karena kemampuan bakteri untuk beradaptasi dengan cepat dengan lingkungan karena adanya molekul antimikroba sehingga terjadi mutasi (3).
Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antimikroba yang bersifat menghambat pertumbuhan mikroba yang disebut sebagai aktivitas bakteriostatik, dan ada yang bersifat membunuh mikroba, dikenal sebagai aktivitas bakterisid. Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan mikroba atau membunuhnya, masing-masing di kenal sebagai kadar hambat minimal (KHM) atau kadar bunuh minimal (KBM).
Antimikroba tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari bakteriostatik menjadi bakterisid apabila kadar antimikrobanya ditingkatkan melebihi KHM (1).
Berdasarkan mekanisme kerjanya, antimikroba dibagi dalam lima kelompok (1) :
1. Antimikroba yang menghambat metabolisme sel mikroba
Mikroba membutuhkan asam folat untuk kelangsungan hidupnya, dimana bakteri patogen harus mensintesis sendiri asam folat dari asam para amino benzoat (PABA). Apabila suatu zat antimikroba menang bersaing dengan asam para amino benzoat (PABA) untuk diikutsertakan dalam pembentukan asam folat maka terbentuk analog
asam folat yang nonfungsional. Akibatnya kehidupan mikroba akan terganggu. Contoh obat yaitu sulfonamida, trimetoprim, asam p- aminosalisilat (PAS) dan sulfon.
2. Penghambatan terhadap sintesis dinding sel
Dinding sel mikroba secara kimia adalah peptidoglikan yaitu suatu kompleks polimer mukopeptida (glikopeptida). Struktur dinding sel dapat dirusak dengan cara menghambat reaksi pembentukannya atau mengubahnya setelah dinding sel tersebut selesai dibentuk.
Antimikroba ini dapat menghambat sintesis atau menghambat aktivitas enzim seperti enzim transpeptidase yang dapat menimbulkan kerusakan dinding sel yang berakibat sel mengalami lisis.
Contoh basitrasin, sefalosporin, sikloserin, penisilin, vankomisin.
3. Penghambatan terhadap fungsi membran sel
Membran sitoplasma mempertahankan bahan-bahan tertentu di dalam sel dan mengatur aliran keluar masuknya bahan-bahan lain.
Membran sel memelihara integritas komponen-komponen seluler.
Kerusakan pada membran ini akan mengakibatkan menghambatnya pertumbuhan sel atau matinya sel, akibatnya mikroba akan mati.
Jika fungsi integritas membran sitoplasma dirusak, makromolekul dan ion keluar dari sel, kemudian sel akan rusak. Dalam hal ini antimikroba dapat berinteraksi dengan sterol sitoplasma pada jamur, dan merusak membran sel bakteri Gram negatif.
Contoh amfoterisin , kolistin, imidasol, polien, polimiksin.
4. Penghambatan terhadap sintesis protein
Hidupnya suatu sel tergantung pada terpeliharanya molekul- molekul dalam keadaan alamiah. Suatu kondisi atau substansi mengubah keadaan ini yaitu mendenaturasikan protein dengan merusak sel tanpa dapat diperbaiki kembali. Suhu tinggi dan konsentrasi beberapa zat kimia dapat mengakibatkan koagulasi irreversibel komponen-komponen seluler yang vital ini.
Antimikroba mempengaruhi fungsi ribosom pada mikroorganisme yang menyebabkan sintesis protein terhambat. Dimana dapat berikatan dengan ribosom 30S yang dapat menyebabkan akumulasi sintesis protein awal yang kompleks, sehingga salah dalam menterjemahkan tanda m-RNA dan menghasilkan polipeptida yang abnormal. Selain itu juga dapat berikatan dengan ribosom 50S yang dapat menghambat ikatan asam amino baru pada rantai peptida yang memanjang. Contoh aminoglikosida, kloramfenikol, tetrasiklin, eritromisin dan linkomisin.
5. Penghambatan terhadap sintesis asam nukleat
DNA dan RNA memegang peranan penting dalam proses kehidupan normal sel. Hal ini berarti bahwa gangguan apapun yang terjadi pada pembentukan atau pada fungsi zat-zat tersebut dapat mengakibatkan kerusakan total pada sel. Dalam hal ini mempengaruhi metabolisme asam nukleat, seperti berikatan dengan enzim DNA- dependen, RNA-polymerase bakteri, memblokir helix DNA. Contoh
quinolon, pyrimethamin, rifampicin, sulfonamid, trimethoprim, trimetrexat.
II.5 Uraian Umum Uji Mikrobiologi 1. Metode Difusi
Metode Difusi termasuk teknik agar-overlay seperti disk, strip, sumur (lubang) dan silinder. Uji difusi disk adalah salah satu metode yang paling umum digunakan uji kerentanan antimikroba. Di Amerika Serikat ini adalah metode resmi untuk deteksi kualitatif penghambatan zat kimia dalam susu. Filter kecil kertas disk (sekitar 1 cm diameter) diresapi dengan sejumlah zat standar antibakteri ditempatkan ke plate agar yang telah diinokulasi sebelumnya untuk metode ini. Piring dibalik dan diinkubasi. Kadang-kadang, sebelum inkubasi, piring dengan disk yang tersisa pada suhu mendekati 00C selama beberapa jam untuk memungkinkan difusi. Waktu inkubasi bervariasi dari sekitar 48 jam.
Diameter zona penghambatan pertumbuhan bakteri adalah ukuran kerentanan. Metode Difusi biasanya digunakan untuk zat murni (17).
2. Metode Dilusi
Metode dilusi terutama digunakan untuk menentukan konsentrasi hambat minimum (MIC) dari zat murni dan ekstrak. Sampel harus homogen terdispersi dalam air. Hal ini biasanya dicampur dalam berbagai pengenceran dengan media diinokulasi. Setelah inkubasi, sifat penghambatan sampel dapat diperkirakan dengan perbandingan turbidimetri atau visual dengan biakan kontrol. Dalam uji tabung berbagai
konsentrasi analit dicampur dalam serangkaian tabung dengan suspensi bakteri. Jumlah terkecil menyebabkan penghambatan pertumbuhan bakteri, media tetap jernih, memberikan nilai MIC. Dalam pengenceran agar dengan berbagai konsentrasi zat antibakteri yang dicampur dengan ntien agar. plat agar diinokulasi dan diinkubasi. Konsentrasi terendah dari antibiotik menunjukkan tidak ada pertumbuhan dibaca sebagai nilai MIC.
Uji microdilution kaldu dilakukan dalam piring microtitre. Setelah inkubasi pertumbuhan bakteri ditunjukkan dengan adanya putih "pellet" di bagian dasar sumur (17).
II.6 Uraian Mikroba Uji II.6.1 Eschericia coli II.6.1.1 Klasifikasi
Divisi : Procaryota
Kelas : Gammaproteobacteria
Bangsa : Enterobacteriaes
Suku : Enterobacteriaceae
Marga : Escherichia
Jenis : Escherichia coli
II.6.1.2 Sifat dan Morfologi
Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang lurus, 1,1-1,5 µm x 2,0-6,0 µm, motil dengan flagelum peritrikus atau non motil.
Tumbuh dengan mudah pada medium nutrien sederhana. Laktose difermentasi oleh sebagian besar galur dengan produksi asam dan gas (19,20).
II.6.2 Staphylococcus aureus II.6.2.1 Klasifikasi
Kerajaan : Protophyta
Kelas : Bacilli
Bangsa : Bacillales
Suku : Staphylococcaceae
Marga : Staphylococcus
Jenis : Staphylococcus aureus II.6.2.2 Sifat dan Morfologi
Staphylococcus aureus adalah bakteri Gram positif , sel-sel berbentuk bola, berdiameter 0,5-1,5 µm, terdapat tunggal dan berpasangan, dan secara khas membelah diri lebih dari satu bidang sehingga membentuk gerombol yang tidak teratur. Dinding sel mengandung dua komponen utama ; peptidoglikan dan asam teikoat.
Metabolisme secara respiratif dan fermentatif. Tumbuh lebih cepat dan lebih banyak dalam keadaan aerob. Suhu optimum 35-40oC. Terutama berasosiasi dengan kulit, dan selaput lendir hewan berdarah panas.
Kisaran inangnya luas, dan banyak galur merupakan patogen potensial (19,20).
II.6.3 Malassezia furfur II.6.3.1 Klasifikasi
Kerajaan : Fungi
Divisi : Basidiomycota Kelas : Hymenomycetes Bangsa : Tremellales Suku : Filobasidiaceae Marga : Malassezia Jenis : Malassezia furfur II.6.3.2 Sifat dan Morfologi
Malassezia furfur merupakan flora normal dan terdapat pada mukosa dan kulit. Jamur ini berupa kelompok sel-sel bulat, bertunas, berdinding tebal, dan hifanya berbatang pendek dan bengkok. Malassezia furfur menghasilkan konidia sangat kecil ( mikrokonidia ) pada hifanya, tetapi di samping itu juga menghasilkan makrokonidia besar, multiseptat, berbentuk gelendong yang jauh lebih besar daripada mikrokonidianya (21, 22).
BAB III
PELAKSANAAN PENELITIAN
III.1 Alat dan Bahan yang Digunakan
Alat-alat yang digunakan adalah autoklaf (All American), cawan petri, cawan porselein, chamber, gelas ukur, gelas piala (Pyrex®), inkubator (Memmert), Laminar Air Flow (Envirco), lemari pendingin (Panasonic), mikropipet (Socorex®), oven (Ecocell), rotary evaporator, centrifuge (Hettich Zentrifugator type universal 320K), timbangan analitik (Chyo).
Bahan-bahan yang digunakan adalah air suling, buah Cabai Katokkon, etanol 70%, etilasetat, kloroform, lempeng KLT silica gel GF- 254, n-heksan, medium Nutriet Agar (Pronadisa), medium Potato Dextrosa Agar (Difco), mikroba uji (Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, dan Malassezia furfur), dan reagen uji identifikasi senyawa.
III.2 Metode Kerja
III.2.1 Pengambilan Sampel
Sampel buah cabai katokkon diambil di Kecamatan Mengkendek, Kabupaten Tana Toraja.
III.2.2 Ekstraksi Sampel
Buah Cabai Katokkon yang berwarna merah dicuci bersih dengan air mengalir, dipisahkan dari bijinya dan dipotong kecil-kecil, kemudian
dikeringkan dalam oven pada suhu 600C. Buah yang telah kering diekstraksi dengan etanol 70% menggunakan metode maserasi selama 24 jam sambil sesekali diaduk. Ekstrak cair diuapkan pelarutnya pada rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental (7).
Ekstrak etanol kental kemudian difraksinasi dengan metode ECP (Ekstraksi Cair-Padat) dengan pelarut n-heksan, kloroform dan etilasetat secara sinambung dengan sifat kepolaran pelarut yang berbeda-beda.
Ekstrak kental etanol dimasukkan kedalam tabung centrifuge, ditambahkan n-heksan, kemudian dipartisi dengan centrifuge. Fraksi larut n-heksan dipisahkan, kemudian fraksi tidak larut n-heksan ditambahkan n- heksan, lalu dipartisi lagi dengan centrifuge. Diulangi beberapa kali sampai larutan berwarna bening. Fraksi tidak larut n-heksan dilanjutkan menggunakan kloroform dengan proses yang sama dengan n-heksan.
Fraksi tidak larut kloroform dilanjutkan menggunakan etilasetat dengan proses yang sama dengan n-heksan. Sehingga diperoleh ekstrak n- heksan, ekstrak kloroform, dan ekstrak etilasetat. Ekstrak etanol dan ketiga ekstrak yang diperoleh dilanjutkan dengan uji aktivitas antimikroba dan uji KLT. Ekstrak disimpan pada suhu 40C hingga dilakukan uji (23).
III.2.3 Sterilisasi alat
Alat-alat yang terbuat dari gelas direndam dan dicuci hingga bersih dengan menggunakan detergen. Cawan petri dan alat-alat gelas lainnya dibungkus dengan kertas perkamen dan disterilkan dalam oven pada suhu 180°C selama 2 jam. Adapun alat-alat gelas yang berskala dan tidak tahan
terhadap pemanasan dan yang terbuat dari plastik disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 2 atm selama 15 menit. Ose disterilkan dengan cara dipijarkan pada nyala api bunsen (24).
III.2.4 Pembuatan Medium Nutrient Agar (NA)
Media Nutrient Agar ditimbang sebanyak 23 gram dan dilarutkan dalam 1000 ml air suling lalu didihkan sampai larut sempurna. Selanjutnya media yang sudah jadi disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 2 atm selama 15 menit (25).
III.2.5 Pembuatan Medium Potato Dextrosa Agar (PDA)
Media Potato Dextrosa Agar ditimbang sebanyak 39 gram dan dilarutkan dalam 1000 ml air suling lalu didihkan sampai melarut sempurna. Selanjutnya media yang sudah jadi disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 2 atm selama 15 menit (25).
III.2.6 Penyiapan Mikroba Uji
Mikroba uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus, serta jamur Malassezia furfur. Stok bakteri dan jamur berasal dari stok kultur koleksi Laboratorium Mikrobiologi Farmasi Universitas Hasanuddin. Kultur diremajakan dalam medium NA miring untuk bakteri dan PDA miring untuk jamur serta diinkubasi untuk bakteri pada suhu 37˚C selama 1 x 24 jam dan untuk jamur pada suhu kamar selama 2 x 24 jam. Kultur yang telah diinkubasi kemudian didispersikan dengan air steril yang selanjutnya dapat digunakan sebagai mikroba uji.
III.2.7Penyiapan Ekstrak
Ekstrak etanol, ekstrak n-heksan, ekstrak kloroform, dan ekstrak etilasetat dibuat dalam 5 konsentrasi yaitu 100 mg/mL, 50 mg/mL, 25 mg/mL, 12,5 mg/mL, dan 6,25 mg/mL. Masing-masing ekstrak ditimbang 100 mg lalu dilarutkan dalam 1 mL pelarutnya (100 mg/mL). Kemudian diambil 0,5 mL dari konsentrasi 100 mg/mL lalu dicukupkan volumenya 1 mL (50 mg/mL). Kemudian diambil 0,5 mL dari konsentrasi 50 mg/mL lalu dicukupkan volumenya 1 mL (25 mg/mL). Kemudian diambil 0,5 mL dari konsentrasi 25 mg/mL lalu dicukupkan volumenya 1 mL (12,5 mg/mL).
Kemudian diambil 0,5 mL dari konsentrasi 12,5 mg/mL lalu dicukupkan volumenya 1 mL (6,25 mg/mL).
III.2.8 Uji Aktivitas Antimikroba
Pengujian aktivitas antimikroba ekstrak etanol, ekstrak n-heksan, ekstrak kloroform, dan ekstrak etilasetat menggunakan metode difusi agar. Cawan petri yang telah berisi media dan telah diinokulasikan bakteri dibiarkan memadat. Pengujian dilakukan dengan mengambil 20 µL ekstrak lalu diteteskan pada kertas cakram berdiameter 6 mm. Setelah pelarut menguap, kertas cakram diletakkan pada permukaan media.
Cawan petri diinkubasi pada suhu 370C selama 1 x 24 jam untuk bakteri, dan untuk jamur diinkubasi pada suhu kamar selama 2 x 24 jam. Diamati dan diukur zona hambat yang terbentuk (26,27).
III.2.9 Uji KLT-Bioautografi
Pengujian KLT-Bioautografi ekstrak buah Cabai Katokkon yang paling aktif sebagai antimikroba menggunakan lempeng KLT silica gel GF- 254 yang telah diaktifkan. Maserat ditotolkan pada lempeng dan dielusi.
Noda pada kromatogram lempeng I divisualisasikan dengan reagen uji identifikasi. Lempeng II diletakkan pada permukaan media NA dan PDA yang telah diinokulasikan dengan mikroba uji. Kemudian didiamkan dalam lemari es selama 1 jam. Cawan petri diinkubasi pada suhu 370C selama 1 x 24 jam untuk bakteri, dan untuk jamur diinkubasi pada suhu kamar selama 2 x 24 jam. Setelah itu diamati adanya adanya zona hambat pertumbuhan mikroba pada media. Kemudian dibandingkan hasil kromatogram lempeng I dengan zona hambat yang dibentuk oleh lempeng II pada media (7,26,27).
III.2.10 Identifikasi Komponen Kimia 1. Lieberman-Burchard
Pereaksi Lieberman-Burchard disemprotkan pada kromatogram lalu dipanaskan. Setelah dipanaskan menunjukkan senyawa terpen jika noda yang tampak berwarna merah, dan jika noda berwarna hijau-biru atau ungu menunjukkan senyawa steroid.
2. Dragendorff
Pereaksi Dragendorff disemprotkan pada kromatogram menunjukkan senyawa alkaloid jika noda yang tampak berwarna jingga.
3. Feri klorida
Pereaksi FeCl3 disemprotkan pada kromatogram menunjukkan senyawa tannin jika noda yang tampak berwarna biru-hitam atau hijau- biru, dan jika noda berwarna hijau-hitam menunjukkan senyawa fenolik.
4. Aluminium klorida
Pereaksi AlCl3 disemprotkan pada kromatogram menunjukkan senyawa flavanoid jika noda yang tampak berwarna kuning pucat.
5. Asam sitroborat
Pereaksi Asam sitroborat disemprotkan pada kromatogram menunjukkan senyawa flavanoid jika noda yang tampak kuning pendar pada UV 366 nm.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1 Hasil Penelitian IV.1.1 Ekstraksi
Hasil ekstraksi buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var.
chinensis) 140 g diperoleh ekstrak kental etanol sebesar 51,72 g (Rendamen 36,94 %). Hasil partisi diperoleh ekstrak n-heksan, ekstrak chloroform, dan ekstrak etilasetat. Keempat ekstrak tersebut diidentifikasi secara KLT. Pengujian KLT menggunakan eluen heksan : etil asetat (3:1) (Gambar 1).
Gambar 1. Kromatogram lapis tipis ekstrak buah cabai katokkon (Capsicum annuum L.
var. chinensis).
Keterangan :
Fase diam : Silika gel GF-254 Fase gerak : Heksan : etilasetat (3:1) 1. Ekstrak kental etanol
2. Ekstrak n-heksan 3. Ekstrak chloroform 4. Ekstrak etilasetat
a. visual
b. penampak UV 254 nm c. penampak UV 366 nm d. setelah disemprot H2SO4
IV.1.2 Uji Aktivitas Antimikroba
Hasil positif uji aktivitas antimikroba ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar kertas cakram yang mengandung ekstrak.
Ekstrak kental etanol Ekstrak n-heksan
Ekstrak chloroform Ekstrak etilasetat
Gambar 2. Hasil uji aktivitas antimikroba ekstrak buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis) terhadap jamur Malassezia furfur.
Keterangan :
1. 100 mg/mL ekstrak 2. 50 mg/mL ekstrak 3. 25 mg/mL ekstrak 4. 12,5 mg/mL ekstrak 5. 6,25 mg/mL ekstrak 6. Kontrol pelarut a. Zona bening b. Kertas cakram
a b
36
Tabel 1. Hasil uji aktivitas antimikroba ekstrak buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis)
Kadar (mg/mL)
Diameter Zona Hambat (mm)
Escherichia coli Staphylococcus aureus Malassezia furfur
Ekstrak Ekstrak Ekstrak
Etanol Hex CH3Cl Etil Etanol Hex CH3Cl Etil Etanol Hex CH3Cl Etil
100 - - - 13,8 23,3 18,8 14,8
50 - - - - 19,5 14,3 15,3
25 - - - - 15,2 13,4 14,8
12.5 - - - - 14,2 - 16,3
6,25 - - - - 19,2 - -
Kontrol
Pelarut - - - - - - -
IV.1.3 Uji KLT-Bioautografi
Hasil uji KLT-Bioautografi dari ektrak n-heksan terhadap Malassezia furfur tidak memperlihatkan adanya noda yang aktif.
Gambar 3. Hasil KLT-Bioautografi ekstrak n-heksan buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis) terhadap jamur Malassezia furfur
Keterangan :
Fase diam : silica gel GF-254 Fase gerak : heksan : etilasetat (3:1) a. Lempeng yang dielusi
b. Perbandingan lempeng yang dielusi dan tidak dielusi
a. b.
.
IV.1.4 Identifikasi Komponen Kimia
Berdasarkan warna yang ditunjukkan pada setiap pereaksi maka ekstrak n-heksan diduga mengandung senyawa golongan alkaloid, steroid, fenolik, dan flavanoid.
Tabel 2. Hasil uji identifikasi komponen kimia ekstrak n-heksan buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis)
Pereaksi Ekstrak n-heksan Golongan senyawa
Dragendorff Jingga Alkaloid
Lieberman-Burchard Hijau-biru Steroid
FeCl3 Hijau-hitam Fenolik
AlCl3 Kuning pucat Flavanoid
Asam sitroborat Kuning pendar Flavanoid
IV.2 Pembahasan
Pada penelitian ini dilakukan ekstraksi buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis) dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 70%. Ekstraksi adalah pemisahan zat aktif dari jaringan tanaman atau hewan menggunakan pelarut selektif melalui prosedur standar. Produk yang diperoleh dari tanaman adalah campuran metabolit yang relatif kompleks dalam keadaan cair atau setengah padat (12). Metode maserasi digunakan karena sampel yang digunakan adalah buah yang tidak tahan pemanasan, serta pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana. Proses maserasi dilakukan selama 1x24 jam, lalu ekstrak etanol dirotavapor untuk menguapkan pelarutnya. Dalam penelitian ini diperoleh ekstrak etanol sebesar 51,72 g (Rendamen 36,94%).
Ekstrak kental dipartisi dengan metode Ekstraksi Cair Padat.
Metode ini digunakan untuk memisahkan komponen yang terdapat dalam ekstrak etanol berdasarkan tingkat kepolaran. Ekstraksi dimulai dari pelarut yang memiliki tingkat kepolaran rendah ke pelarut yang memiliki tingkat kepolaran yang lebih tinggi yaitu secara berturut-turut n-heksan, kloroform, dan etilasetat. Hal ini dimaksudkan agar setiap senyawa yang terdapat pada ekstrak etanol yang tingkat kepolarannya rendah terlebih dahulu larut dalam n-heksan. Setelah itu, dilanjutkan dengan kloroform yang memiliki tingkat kepolaran di bawah n-heksan, kemudian dilanjutkan dengan etilasetat yang lebih tinggi kepolarannya. Sehingga dapat diperoleh perbedaan kandungan senyawa pada setiap ekstrak.
Ekstrak hasil partisi diidentifikasi secara KLT. Pengujian KLT menggunakan eluen heksan : etilasetat (3:1) dilakukan untuk memberikan gambaran bahwa pada setiap ekstrak hasil partisi memiliki kandungan senyawa yang berbeda. Namun, KLT hasil partisi menunjukkan terdapat senyawa yang sama pada ekstrak n-heksan dan ekstrak kloroform. Hasil ini menunjukkan bahwa senyawa tersebut mampu melarut pada pelarut n- heksan dan kloroform (Gambar 1).
Uji aktivitas antimikroba dilakukan pada masing-masing ekstrak yaitu ekstrak etanol, n-heksan, kloroform, dan etilasetat. Uji ini dilakukan dengan metode difusi agar menggunakan medium Nutrien Agar (bakteri) dan Potato Dextrose Agar (jamur). Mikroba uji yang digunakan adalah Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Malassezia furfur.
Pengujian aktivitas antimikroba terhadap ekstrak etanol, n-heksan, kloroform, dan etilasetat tidak mampu menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus, ini ditandai dengan tidak terbentuknya zona bening di sekitar kertas cakram yang mengandung ekstrak.
Hasil uji aktivitas antimikroba terhadap jamur Malassezia furfur (Gambar 2) menunjukkan hasil positif pada ekstrak etanol, n-heksan, kloroform, dan etilasetat. Hal ini ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar kertas cakram yang mengandung ekstrak. Diameter zona hambat yang terbentuk pada ekstrak etanol adalah 13,8 mm (100 mg/mL).
Diameter zona hambat yang terbentuk pada ekstrak n-heksan adalah 23,3 mm (100 mg/mL); 19,5 mm (50 mg/mL); 15,2 mm (25 mg/mL); 14,2 mm (12,5 mg/mL); dan 19,2 mm (6,25 mg/mL). Diameter zona hambat yang terbentuk pada ekstrak kloroform adalah 18,8 mm (100 mg/mL); 14,3 mm (50 mg/mL); dan 13,4 mm (25 mg/mL). Diameter zona hambat yang terbentuk pada ekstrak etilasetat adalah 14,8 mm (100 mg/mL); 15,3 mm (50 mg/mL); 14,8 mm (25 mg/mL); dan 16,3 mm (12,5 mg/mL), sehingga dapat diasumsikan bahwa ekstrak dari buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis) bersifat antifungi.
Uji aktivitas antimikroba keempat ekstrak hanya menunjukkan aktivitas antimikroba terhadap Malassezia furfur (Tabel 1). Faktor yang mempengaruhi zona hambat adalah kemampuan difusi zat aktif, ketebalan
medium, reaksi antara bahan aktif dan medium, viskositas medium, dan temperatur inkubasi.
Beberapa penelitian sebelumnya menyimpulkan ekstrak etanol dari beberapa jenis cabai menunjukkan potensi aktivitas antimikroba terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif, serta fungi (7). Berbeda dengan hasil penelitian yang ditemukan yaitu cabai katokkon hanya memiliki aktivitas antimikroba terhadap jamur Malassezia furfur . Hal ini dapat menunjukkan bahwa perbedaan habitat tanaman dan metode ekstraksi mungkin akan mempengaruhi aktivitas antimikroba (4).
Gambar 4. Histogram diameter zona hambat ekstrak buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis ) terhadap jamur Malassezia furfur.
Berdasarkan hasil pengukuran diameter zona hambat (Gambar 4) menujukkan ektstrak yang paling aktif adalah ekstrak n-heksan terhadap Malassezia furfur dengan diameter zona yang terbentuk adalah 23,3 mm (100 mg/mL). Sehingga ektrak n-heksan dinggap memiliki aktivitas antifungi.
0 5 10 15 20 25
ekstrak etanol
ekstrak n- heksan
ekstrak chloroform
ekstrak etilasetat
Diameter Zona Hambat (mm)
100 mg/mL 50 mg/mL 25 mg/mL 12,5 mg/mL 6,25 mg/mL kontrol pelarut
Uji KLT-Bioautografi dilakukan untuk mendeteksi zat yang mempengaruhi tingkat pertumbuhan organisme uji dalam ekstrak yang kompleks serta untuk mendeteksi golongan senyawa yang memiliki aktivitas antimikroba. Pengujian dilakukan menggunakan metode kontak dengan eluen heksan : etilasetat (3:1) pada ekstrak n-heksan, terhadap jamur Malassezia furfur. Pada lempeng KLT yang telah dielusi (Gambar 3a) terjadi pemisahan senyawa yang terdapat dalam ekstrak. Sehingga diharapkan dapat diketahui noda yang aktif terhadap jamur Malassezia furfur. Namun, hasil yang diperoleh tidak terdapat zona hambat pada daerah disekitar noda pada kromatogram. Oleh karena itu, diduga senyawa yang terdapat dalam ekstrak bersifat sinergis artinya senyawa tersebut aktif terhadap jamur Malassezia furfur jika tidak terpisah.
Kemudian pengujian KLT-Bioautografi dilakukan dengan membandingkan lempeng KLT yang telah dielusi dan tidak dielusi (Gambar 3b). Namun, keduanya lempeng tidak menunjukkan adanya zona hambat.
Jika dibandingkan dengan dengan uji difusi agar sebelumnya yang menujukkan adanya zona hambat, maka hal ini juga terjadi pada lempeng yang tidak dielusi. Namun, pada lempeng yang tidak dielusi pun tidak menunjukkan adanya zona hambat. Hal ini kemungkinan terjadi karena kekurangan dari metode kontak yaitu penyerapan oleh permukaan agar dan kesulitan untuk mendapatkan kontak yang optimal antara agar dan kromatogram sehingga matriks lempeng melekat dan tertinggal pada agar ketika lempeng kromatogram diangkat kembali(28). Beberapa senyawa
dapat berikatan dengan matriks lempeng kromatogram terutama matriks berbasis silica sehingga beberapa senyawa tidak pernah berdifusi ke dalam agar (29).
Identifiksi komponen kimia dilakukan untuk mengetahui golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak n-heksan menggunakan lempeng KLT yang telah dielusi lalu disemprotkan dengan pereaksi identifikasi. Pereaksi Dragendorff menunjukkan senyawa alkaloid jika noda yang tampak berwarna jingga. Pereaksi Lieberman-Burchard setelah dipanaskan menunjukkan senyawa terpen jika noda yang tampak berwarna merah, dan jika noda berwarna hijau-biru atau ungu menunjukkan senyawa steroid. Pereaksi FeCl3 menunjukkan senyawa tannin jika noda yang tampak berwarna biru-hitam atau hijau-biru, dan jika noda berwarna hijau-hitam menunjukkan senyawa fenolik. Pereaksi AlCl3
menunjukkan senyawa flavanoid jika noda yang tampak berwarna kuning pucat. Pereaksi Asam sitroborat menunjukkan senyawa flavanoid jika noda yang tampak kuning pendar pada UV 366 nm (Tabel 2).
Berdasarkan warna yang ditunjukkan pada setiap pereaksi maka ekstrak n-heksan diduga mengandung senyawa golongan alkaloid, steroid, fenolik, dan flavanoid. Beberapa penelitian sebelumnya telah menujukkan kandungan senyawa yang terdapat pada buah Capsicum annuum diantaranya alkaloid, steroid, fenolik, dan flavanoid (11,12,30).
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
V. 1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil pembahasan maka dapat disimpulkan bahwa : 1. Hasil uji aktivitas antimikroba ekstrak etanol, n-heksan, chloroform dan
etilasetat dari buah Cabai Katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis) aktif terhadap Malassezia furfur tetapi tidak aktif terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.
2. Ekstrak n-heksan memiliki aktivitas antifungi terbesar terhadap Malassezia furfur dengan diameter zona hambat 23,3 mm (100 mg/mL).
3. Hasil uji KLT-Bioautografi dari ektrak n-heksan terhadap Malassezia furfur tidak memperlihatkan adanya noda yang aktif.
4. Hasil identifikasi senyawa kimia dengan KLT menunjukkan ekstrak n-heksan diduga mengandung senyawa golongan alkaloid, steroid, fenolik, dan flavanoid.
V. 2 Saran
1. Perlu dilakukan penentuan nilai MIC pada ekstrak n-heksan.
2. Perlu dilakukan isolasi dan karakterisasi senyawa antimikroba dari buah Cabai Katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis)
DAFTAR PUSTAKA
1. Setiabudy, R., Antimikroba. Di dalam : Ganiswara, G.S., editor.
Farmakologi dan Terapi edisi 5. FK-UI. Jakarta. 2007. Hal. 585.
2. Franco, B.E., Martínez, M.A., Rodríguez, M.A.S., dan Wertheimer, A.I.
The Determinants Of The Antibiotic Resistance Process. Infection And Drug Resistance 2009:2. Mexico. 2009. Hal 1–11.
3. Djide, M.N., dan Sartini. Dasar-Dasar Mikrobiologi Farmasi. Lephas.
Makassar. 2008. Hal 339,367.
4. Keskin, D., dan Toroglu, S. Studies on Antimicrobial Activities of Solvent Extracts of Different Spice. Journal of Environmental Biology.
Triveni Enterprises. India. 2011. Hal. 251-256.
5. World Health Organization. The Evolving Threat Of Antimicrobial Resistance Options For Action. France. GPS Publishing,. 2012. Hal 3-5.
6. Ababutain, I.M. Antimicrobial Activity Of Ethanolic Extracts From Some Medicinal Plant. Australian Journal Of Basic And Applied Sciences 5(11). Maret 2011. Hal. 678-683.
7. Soetarno, S., Sukrasno, E., Yulinah, dan Sylvia. Antimicrobial Activities of The Ethanol Extracts of Capsicum Fruits with Different Levels of Pungency. JMS Vol. 2 No. 2. Oktober 1997. Hal 57-63.
8. Erturk, O. Antibacterial And Antifungal Activity Of Ethanolic Extracts From Eleven Spices Plants. Biologia. Bratislava 61/3. 2006. Hal 275- 278.
9. Djarwaningsih, T. Review: Capsicum spp. (Cabai): Asal, Persebaran dan Nilai Ekonomi. BIODIVERSITAS Oktober 2005. Vol 6. Hal 292-296.
10. Manirakiza, P., Covaci, A., dan Schpens, P. Pungency Principles in Capsicum - Analytical Determinations and Toxicology. Di dalam : De AK, editor. Capsicum : The Genus of Capsicum. Taylor K- Francis Ltd.
2003. Hal. 71
11. Pruthi, J.S. Chemistry and Quality Control of Capsicums and Capsicum Products. Di dalam : De AK, editor. Capsicum : The Genus of Capsicum. Taylor K- Francis Ltd. 2003. Hal. 26-28
12. Tiwari, P., Kumar, B., Kaur M., Kaur, G., dan Kaur, H. Phytochemical Screening And Extraction: A Review. Internationale Pharmaceutica Sciencia Januari-Maret 2011. Vol 1. Issue 1. Hal 98-106.
13. Handa, S.S., Khanuja, S.P.S., Longo, G., dan Rakesh, D.D. Extraction Technologies for Medicinal and Aromatic Plants. ICS-UNIDO. Trieste.
2008. Hal 7, 22, 70.
14. Haryono, J. Sediaan Galenik. Jakarta : Depkes RI. 1986.Hal 6-19.
15. Deinstrop, E.H. Applied Thin-Layer Chromatography. Weinheim : WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 2007. Hal 1-3
16. Yazid, E. Kimia Fisika untuk Paramedis. Yogyakarta : Penerbit Andi.
2005. Hal 193,209
17. Choma, I. The Use of Thin-Layer Chromatography with Direct Bioautography for Antimicrobial Analysis. [serial on the internet] 1 September 2005. 2012 [dikutip 5 November 2012]; LCGC Europe Vol.
18, Issue 9. [7 screen] Available from:
http://www.chromatographyonline.com/lcgc/Features/The-Use-of-Thin- Layer-Chromatography-with-Direct-
B/ArticleStandard/Article/detail/177453
18. Tenover, F.C. Mechanisms of Antimicrobial Resistance in Bacteria. The American Journal of Medicine Vol 119 (6A). Elsevier Inc. 2006. Hal.
S3–S10.
19. Pelczar, Jr. M. J. Dasar-dasar Mikrobiologi. R.S. Hadioetomo. UI- Press. Jakarta. 1988.
20. Holt, J. G. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. [9th Ed.]. The Williams & Wilkins Company. Baltimore. Maryland 21202 United States of America. 1994.
21. Buick, S.F. Development of an In Vitro Diagnostic Technique for Malassezia furfur. Tesis. University of Canterbury. Hal 11-15
22. Inamandar, A.C., Paliit, A. The Genus Malassezia and Human disease.
Indian J Dermatol Venereol Leprol [serial on the internet] 2003 [dikutip 8 April 2013] ;69:265-70.
Available from: http://www.ijdvl.com/text.asp?2003/69/4/265/4990
23. Najib, A. Isolasi Dan Identifikasi Komponen Kimia Ekstrak Dietil Eter Daun Senggani (Melastoma malabathricum L.). Majalah Farmasi dan Farmakologi Vol 12. No. 1. Maret. 2008. Hal. 11-16.
24. Parrot, E.L. Pharmaceutical Technology Fundamental Pharmaceutics.
USA. Burgess Publishing Company. 1970. Hal 286
25. Phyllis, E., editor. Dicfo Manual. 11th ed. Difco Laboratories, Division of Becton Dickinson and company. Sparks, Maryland. USA. Hal 349,402.
26. Pandey, B., Ghimire, P., dan Agrawal, V.P. Studies on the antibacterial activity of theactinomycetes isolated from the Kumbu region of Nepal.
[Serial on internet]. 2004. [dikutip 5 November 2012] Available from:
http://www.aehms.org/pdf/panday%20f.pdf
27. Rante, H., Wahyono, Murti, Y.B., dan Alam, G. Purifikasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri dari Actinomycetes Asosiasi Spons Terhadap Bakteri Patogen Resisten. Majalah Farmasi Indonesia, 21(3).
2010. Hal. 158-165
28. Kusumaningtyas, E., Astuti, E., Darmono. Sensitivitas Metode Bioautografi Kontak dan Agar Overlay dalam Penentuan Senyawa Antikapang. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia September 2008. Vol.
6. No.2. Hal. 75-79
29. Verbitsky, S.M., McChesney, J.D., Gourdin, G.T., Ikenouve, L.M.
Methods and Compositions for Detecting Active Components using Bioluminescent Bacteria and Thin Layer Chromatography. United States Patent Application Publication 9 Agustus 2007. [21 screen]
30. Rahim, R.A., dan Mat, I. Phytochemical Contents of Capsicum Frutescens (Chili Padi), Capsicum Annum (Chili Pepper) and Capsicum Annum (Bell Peper)Aqueous Extracts. International Conference on Biological and Life Sciences. 2012. Vol. 4. Hal. 164-167
LAMPIRAN
Lampiran 1. Skema Kerja
Penyiapan Sampel, Ekstraksi, dan Partisi
Ekstrak larut n-heksan Ekstrak tidak larut n-heksan
+ kloroform
Ekstrak larut kloroform Ekstrak tidak larut kloroform
+ etil asetat
Ekstrak larut etilasetat Ekstrak tidak larut etilasetat
Pengujian KLT + n-Heksan
Buah Cabai Katokkon
- Dicuci dengan air mengalir - Dipotong kecil-kecil - Dipisahkan dari bijinya
- Dikeringkan dalam oven suhu 600C
Buah Cabai Katokkon kering
Dimaserasi dengan etanol selama 24 jam
Ekstrak etanol
Ekstrak etanol kental
dirotary evaporator
Dipartisi Ekstraksi Cair-Padat
Uji Aktivitas Antimikroba, KLT-Bioautografi, Identifikasi Senyawa
Ekstrak n-heksan Ekstrak chloroform Ekstrak etilasetat
- Dibuat pengenceran dengan masing- masing pelarut
Ekstak yang akan diuji
- Diteteskan 20 µl pada kertas cakram
Kertas cakram yang mengandung ekstrak yang akan
diuji
- Diletakkan pada permukaan media
Cawan petri berisi medium dan dispersi mikroba uji NA (bakteri) / PDA (jamur)
- Diinkubasi 24 jam 370C (bakteri) - Diinkubasi 72 jam suhu kamar (jamur)
Cawan petrti yang telah diinkubasi
- Diamati zona hambat Ekstrak paling aktif
- Diuji KLT-Bioautografi - Didentifikasi senyawa
Hasil, Pembahasan, Kesimpulan
Ekstrak etanol
Lampiran 2. Bukti Determinasi Sampel Buah Cabai Katokkon
Lampiran 3. Gambar Hasil Penelitian
Gambar 5. Foto tanaman cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis)
a. b
Gambar 6. Foto sampel buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis) Keterangan :
a. Buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis)
b. Simplisia buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis)
Gambar 7. Ekstrak etanol dan hasil partisi (ekstrak n-heksan, ekstrak kloroform, dan ekstrak etilasetat
Keterangan :
a. Ekstrak etanol buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis) b. Hasil partisi ekstrak buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis)
Gambar 8. Kromatogram lapis tipis ekstrak n-heksan buah cabai katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis)
Keterangan :
Fase diam : Silika gel GF-254 Fase gerak : Heksan : etilasetat (3:1) 1. Visual
2. UV 366 nm 3. UV 254 nm 4. Pereaksi H2SO4 5. Pereaksi Dragendorf 6. Pereaksi AlCl3
7. Pereaksi Lieberman-Burchard 8. Pereaksi FeCl3
9. Pereaksi Asam Sitroborat
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
