PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI ENZIM DPEase Dari Escherichia coli REKOMBINAN (BL21 (DE3) pET Gen dpe)
TESIS
DEBY EDYLIANI NIM. 167030010
PROGRAM PASCASARJANA BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATRA UTARA
MEDAN 2020
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI ENZIM DPEase Dari Escherichia coli REKOMBINAN (BL21 (DE3) pET Gen dpe)
TESIS
Diajukan untuk melengkapi tugas dan memenuhi syarat mencapai gelar Magister Sains
DEBY EDYLIANI NIM. 167030010
PROGRAM PASCASARJANA BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATRA UTARA
MEDAN 2020
PERNYATAAN ORISINALITAS
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI ENZIM DPEase Dari Escherichia coli REKOMBINAN (BL21 (DE3) pET Gen dpe)
TESIS
Saya menyatakan bahwa tesis ini adalah hasil karya sendiri, kecuali beberapa kutipan dan ringkasan yang masing-masing disebutkan sumbernya.
Medan, Januari 2020
Deby EdyLiani
NIM. 167030010
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Sebagai sivitas akademika Universitas Sumatera Utara, saya yang bertanda tangan dibawah ini:
Nama : Deby EdyLiani
NIM : 167030010
Program Studi : Biologi Jenis Karya Ilmiah : Tesis
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, menyetujui untuk memberikan kepada Universitas Sumatera Utara. Hak Bebas Royalti Non-Ekslusif (Non-Exclusive Royalty Free Right) atas tesis saya yang berjudul:
Purifikasi Dan Karakterisasi Enzim Dpease Dari Escherichia Coli Rekombinan (Bl21 (De3) Pet Gen Dpe)
Beserta perangkat yang ada (jika diperlukan), dengan Hak Bebas Royalti Non-eksklusif ini, Universitas Sumatera Utara berhak menyimpan, mengalih media, memformat, mengelola dalam bentuk data-base, merawat dan mempublikasikan tesis saya tanpa meminta izin dari saya selama mencantumkan nama saya sebagai penulis dan sebagai pemegang dan atau sebagai penulis dan sebagai pemiliki hak cipta.
Demikian pernyataan ini dibuat dengan sebenarnya.
Medan, Januari 2020
Deby EdyLiani
ii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI
Telah diuji dan dinyatakan lulus pada Tanggal : 13 Desember 2019
PANITIA PENGUJI TESIS
Ketua : Dr. Yurnaliza, M.Si Anggota : 1. Budi Saksono, Ph.D
2. Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc 3. Dr. It Jamilah, M.Sc
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI ENZIM DPEase Dari Escherichia coli REKOMBINAN (BL21 (DE3) pET Gen dpe)
ABSTRAK
Latar Belakang dan Tujuan: D-Psicoce memperoleh hasil konversi dengan bantuan enzim DPEase (D-Psicose 3-Epimerase). Enzim DPEase dari Agrobacterium tumefaciens lebih efisien dan memiliki aktivitas tinggi dalam D-fruktosa. Gen dpe telah berhasil dikloning ke Escherichia coli BL21 (DE3) pET-21b dpe tetapi enzim belum dimurnikan dan belum diketahui karakterisasinya. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memurnikan dan mengkarakterisasi enzim DPEase oleh E.coli rekombinan. Bahan dan Metode: Enzim DPEase dimurnikan dengan kromatografi afinitas, dan kemudian dikarakterisasi mengikuti pH, suhu, ion logam dan analisis protein berat molekul menggunakan SDS-PAGE. Hasil: Melalui pemurnian, aktivitas DPEase yang dimurnikan meningkat 1,01 kali dari crude enzim dengan hasil kemurnian 84,2%. DPEase memiliki suhu maksimum 40°C dan pH 8,5. Kehadiran Mg² +, Mo² +, Cu² +, Ca² + dan Zn² + menghambat aktivitas enzim sementara Co² +, Mn² +, Fe² +, Ni² + meningkatkan aktivitas enzim DPEase. Estimasi berat molekul melalui SDS-PAGE mengungkapkan bahwa DPEase memiliki berat 32 kDa. Kesimpulan: Enzim DPEase yang dimurnikan menunjukkan pita yang jelas yang menunjukkan pemurnian yang sukses menggunakan afinitas kromatografi dan penggunaan ion logam Fe²+ sebagai kofaktor dalam enzim DPEase memiliki potensi dalam industri makanan.
Kata kunci: DPEase (D-Psicose 3-Epimerase), Escherichia coli Rekombinan, Pemurnian, Karakterisasi, Kramatografi Afinitas
iv
Purification and Characterization Of DPEase ENZYME From Escherichia coli RECOMBINANT (BL21 (DE3) pET Gen dpe)
ABSTRACT
Background and Objective: D-Psicoce obtained the results of conversion with the help of the enzyme DPEase (D-Psicose 3-Epimerase). The DPEase enzyme from Agrobacterium tumefaciens is more efficient and has a high activity in D-fructose. The dpe gene has been successfully cloned to Escherichia coli BL21 (DE3) pET-21b dpe but the enzyme. The intent of this study was to purify and assign of DPEase enzyme by recombinant E.coli . Materials and Methods: The enzyme was clarify by affinity chromatography, and then characterized following pH, temperature, co-factor parameters and analysis of molecular weight proteins by SDS-PAGE. Results: Through purification, the purified DPEase activity was increased 1,01 times than crude and with 84,2% of yield. The DPEase had an the maximum temperature is 40°C and pH is 8.5. The presence of Mg²+, Mo²+, Cu²+, Ca²+ and Zn²+ inhibited the activity of the enzyme while of Co²+, Mn²+, Fe²+, Ni²+ enhanced. Estimation of molecular weight through SDS-PAGE revealed that DPEase wass 32 kDa. Conclusion: Purified DPease enzymes show clear bands that demonstrate successful purification using affinity chromatography dan the use of Fe²+ metal ions as cofactors in the DPEase enzyme has potential in the food industry.
Keywords: DPEase (D-Psicose 3-Epimerase), Recombinant Escherichia coli, Purification, Characterization, Affinity Chromatography
PRAKARTA
Puji dan syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul Purifikasi Dan Karakterisasi Enzim Dpease Dari Escherichia Coli Rekombinan (Bl21 (De3) pET Gen Dpe) yang merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains (M.Si) pada program Pascasarjana Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Sumatera Utara (USU) Medan.
Terima Kasih penulis sampaikan kepada Ayahanda Edy Sutrisno yang telah banyak memberikan bantuan baik dalam bentuk moril maupun materil bagi penulisdalam menjalani pendidikan penelitian dan penyelesaian tesis ini. Semoga Allah SWT memberikan kesehatan, umur berkah dan kelapangan rezeki. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ibunda tercinta Suryani dan adik tersayang Dilva DwiLiani atas keridoannya yang tiada henti mendoakan dan memberikan semangat serta kasih sayang yang tak ternilai dengan apapun.
Penulis menyadari bahwa keberhasilan dalam penulisan tesis ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak yang terlibat baik secara langsung maupun tidak langsung yang telah memberikan bimbingan, arahan, saran, dukungan secara moril hingga tesis ini dapat diselesaikan dengan baik. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Ibu Dr. Yurnaliza, M.Si dan Bapak Budi Saksono, Ph.D selaku dosen pembimbing atas bimbingan, arahan, motivasi, nasehat, semangat, waktu, perhatian dan pemikirannya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini dengan baik.
2. Bapak Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc dan Ibu Dr. It Jamilah, M.Sc selaku dosen penguji atas saran dan masukkannya kepada penulis dalam penyelesaian tesis ini.
3. Bapak Prof. Dr. Kerista Sebayang, MS. selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara yang telah menyediakan fasilitas dan kesempatan penulis menjadi mahasiswa dan menyelesaikan Program Studi Magister Biologi pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara.
4. Bapak Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed, dan Ibu Dr. It Jamilah, M.Sc selaku Ketua dan Sekretariat Program Studi Magister Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, yang telah memberikan arahan dan bantuan bagi penulis untuk menyelesaikan Program Studi Magister Biologi pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.
vi
5. Seluruh bagian dari pusat Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia yang tidak dapat diesebut satu persatu, yang telah memberikan fasilitas selama penelitian juga kepada Rizki Indradewi dan Zulfa selaku Asisten Lab yang telah banyak membantu dalam penelitian.
6. Bapak Rizal dan Ewin selaku administrasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara terima kasih banyak atas segala bantuannya selama menyelesaikan penulisan tesis ini.
7. Teman-teman terbaik, Wana, APP, Aan, Mery, Irma, Widya, Mela, Fitri, Adel, Febri, Wita, Tika, Yusfi, Fizra, Habibul, Rahmi, Riko, Wisnu, Kiki, Takim terima kasih banyak atas segala bantuan dan dukungannya selama penelitian dan dalam menyelesaikan penulisan tesis ini.
Serta untuk semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah banyak membantu dalam penelitian dan penulisan tesis ini. Kiranya Allah SWT memberikan balasan yang berlipat ganda atas kebaikan dan bantuan yang telah diberikan kepada penulis.
Akhirya dengan penuh ketulusan dan kerendahan hati penulis menyadari bahwa tesis ini masih terdapat kekurangan dan jauh dari kesempurnaan. Maka dari ini, penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun demi kesempurnaan tesis ini. Atas partisipasi dan dukungan penulis mengucapkan terima kasih. Harapan penulis semoga tesis ini dapat memberikan manfaat dan semoga Alllah SWT memberkahi kita semua. Amin.
Medan, Januari 2020
Deby EdyLiani
DAFTAR ISI
PENGESAHAN TESIS i
ABSTRAK ii
ABSTRACT iii
DAFTAR ISI iv
DAFTAR TABEL v
DAFTAR GAMBAR vi
BAB 1 PENDAHULUAN 1
1.1. Latar Belakang 1
1.2. Rumusan Masalah 2
1.3. Tujuan Penelitian 2
1.4. Manfaat Penelitian 2
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 3
2.1. D-psicose dan manfaatnya 3
2.2. Enzim DPEase 3
2.3. Cara Kerja Enzim 4
2.4. Faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim 5
2.5. Purifikasi Enzim 7
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN 12
3.1. Tempat dan Waktu Penelitian 12
3.2. Alat dan Bahan 12
3.3. Prosedur Penelitian 12
3.3.1. Produksi Enzim DPEase 12
3.3.2. Purifikasi Enzim DPEase 13
3.3.3. Elektroforesis Enzim DPEase 13
3.3.4. Uji Aktivitas Enzim 13
3.3.5. Karakterisasi Enzim 14
viii
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 15
4.1. Produksi dan Purifikasi Enzim DPEase 15
4.2. Karakterisasi Suhu 17
4.3. Karakterisasi pH 18
4.4. Pengaruh Ion Logam Terhadap Aktivitas Enzim 19
4.5. Perbandingan Karakterisasi Enzim DPEase 20
BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN 22
5.1. Kesimpulan 22
5.2. Saran 22
DAFTAR PUSTAKA 23
LAMPIRAN
DAFTAR TABEL
Nomor Judul Halaman
Tabel
Tabel 1. Profil dari crude enzim dan enzim murni DPEase 15
Tabel 2. Pengaruh ion logam terhadap aktivitas DPEase. 19
Tabel 3. Perbandingan data karakter enzim DPEase dari beberapa 20 penelitian
x
DAFTAR GAMBAR
Nomor Judul Halaman
Gambar
Gambar 1. Struktur D-fruktosa dan D-psicose 4
Gambar 2. Penentuan massa molekul DPEase murni dari E. coli BL21 16 DE3pET mengandung gen dpe yang dimurnikan
dengan kromatografi afinitas. Standart kolom BSA;
Supernatan bakteri kolom S; kolom M penanda berat molekul;
kolom 1 Washing, kolom 2 eluent Enzim DPEase
Gambar 3. Pengaruh suhu terhadap aktivitas DPEase. Reaksi dilakukan 17 dalam pH 8.5 selama 10 menit.
Gambar 4. Pengaruh pH pada aktivitas DPEase. Aktivitas DPEase 18 diukur pada suhu 40°C selama 10 menit
1 BAB I
PENDAHULUAN
1.1.Latar Belakang
D-Psicose (Epimer C-3 dari D-fruktosa) merupakan monomer gula yang keberadaannya terbatas di alam dan memiliki tingkat kemanisan 30% lebih rendah dibanding sukrosa. D-psicose tidak hanya dihasilkan oleh ppmikroorganisme, tapi juga telah dilaporkan terdapat dalam gandum (Miller, 1969). Selain sebagai pemanis makanan, D-psicose ternyata juga berperan meningkatkan sensitivitas dan toleransi insulin terhadap glukosa (Hossain, 2011), mengurangi kadar lipid di hati (Matsuo, 2001), melindungi pankreas (Hossain, 2012), secara signifikan menekan peningkatan kadar glukosa darah (Hayashi, 2010). Berdasarkan beberapa manfaat-manfaat ini, besar kemungkinan bahwa D-psicose berperan dalam mencegah penyakit diabetes dan komplikasinya. D-psicose sudah dikatakan aman oleh FDA pada Agustus 2011 (GRN no. 400) sebagai bahan tambahan makanan dan suplemen dengan kalori yang rendah (FDA, 2011)
D-Psicoce diperoleh hasil konversi fruktosa dengan bantuan enzim DPEase (D- Psicose 3-Epimerase). Beberapa penelitian melaporkan bahwa enzim DPEase ini dapat dihasilkan oleh beberapa mikroorganisme seperti Clostridium cellulolyticum H10 (Mu, 2011), C.bolteae ATCC BAA-613 (Jia, 2014), C.scindens ATCC 35704 (Zhang, 2013), Ruminococcus sp. 5139 BFAA (Zhu, 2012) dan Agrobacterium tumefaciens (Kim, 2006).
Diantara beberapa mikroorganisme tersebut, enzim DPEase dari A.tumefaciens lebih efisien dan memiliki aktivitas yang tinggi dalam mengkonversi D-fruktosa (Kim, 2006).
Enzim DPEase yang dihasilkan oleh bakteri secara alami dalam menghasilkan D- psicose memiliki aktivitas yang rendah sehingga perlu dilakukan upaya untuk meningkatkan aktivitasnya terutama untuk aplikasi skala industri. Rekayasa genetik merupakan salah satu cara yang dapat dilakukan dengan mengisolasi gen dpe yang bertanggung jawab dan mengkloningnya ke Escherichia coli BL21 (DE3) pET-21b telah dilakukan pada penelitian sebelumnya (Indradewi, 2017) namun enzim DPEase belum dimurnikan dan diketahui karakternya agar diharapakan dapat dipakai untuk diaplikasikan dalam skala industri.
1.2.Perumusan Masalah
Enzim DPEase diketahui dapat mengkonversi fruktosa menjadi D-psicose. Untuk itu ingin pada penelitian ini ingin diketahui bagaimana tingkat kemurnian enzim DPEase yang dimurnikan dengan kromatografi affinitas dan karakternya\
2
1.3.Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan : 1. Mendapatkan enzim DPEase murni dari E. coli rekombinan (E.coli BL21 (DE3) pET-dpe); 2. Mengetahui karakter enzim DPEase dari E. coli rekombinan (E.coli BL21 (DE3) pET-dpe).
1.4.Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah sebagai informasi bagi industri yang ingin menggunakan enzim DPEase untuk produksi D-psicose.
3 BAB II
TINAJUAN PUSTAKA 2.1. D-Psicose dan manfaatnya
D-Psicose (D-ribo-2-hexulose atau D-allulose), epimer C-3 dari D-fruktosa adalah gula monosakarida dengan energi rendah yang hadir dalam jumlah kecil dalam produk makanan alami (Oshima et al. 2006). D-Psicose pertama kali diidentifikasi dalam gandum lebih dari 70 tahun yang lalu (Miller, 1969). Jenis gula ini dapat dijumpai juga dalam produk makanan dengan jumlah kecil dan kompleks karbohidrat yang disiapkan secara komersial.
Rasa manis dari D-psicose adalah 70% dari manisnya sukrosa. Manfaat kesehatan dari D- psicose adalah gula yang rendah kalori yang sangat mudah diserap dan di metabolisme dalam usus kecil, membuatnya sangat membantu pasien yang menderita diabetes (Baek, 2010). D- psicose memiliki potensi pengembangan di bidang farmasi sebagai gula alternatif karena memiliki fungsi dalam melindungi pankreas (Hossain, 2012), juga dapat meningkatkan resistensi insulin (Hossain et al. 2011). D-psicose juga meningkatan antioksidan (Sun, 2008) dan kontrol hipoglikemik (Zunino, 2009). Manfaat lainnya yaitu secara signifikan menekan peningkatan kadar glukosa darah (Hayashi, 2010), pelindung saraf (Takata, 2015), untuk mengurangi kadar lipid darah (Afach, 2008) dan di hati (Matsuo, 2001) selain dibidang kesehatan enzim DPEase juga terbukti aman untuk diizinkan untuk dikonsumsi FDA pada agustus 2011. DPEase digunakan sebagai bahan pemanis dan suplemen dengan kalori yang rendah (FDA, 2011).
2.2. Enzim DPEase
D-psicose 3-epimerase (DPE) adalah salah satu enzim epimerase yang berfungsi mengkonversi D-fruktosa menjadi D-psicose (Kim, 2006). Berdasarkan struktur tiga dimensi enzim DPE, residu yang terlibat dalam pengikatan substrat adalah I66, W112, E156, H186, dan R215, dan pengikatan logam adalah E150, D183, H209, E244, dan E150. Enzim DPEase ini termasuk dalam kelompok enzim metaloprotein karena memerlukan ion logam untuk meningkatkan aktivitasnya enzim (Jia, 2013) terutama pada ion logam Co2+ , Mn2+(Chen et al, 2017). Karakteristik ini yang membedakan DPEase dari epimerase lainnya.
Enzim DPEase pada awalnya diklaim sebagai D-tagatose 3-epimerase (DTEase), namun karena spesifitas produk yang dihasilkan adalah D-psicose, sehingga enzim ini kemudian diklasifikasikan sebagai enzim DPEase (Kim et al. 2006b). Mekanisme perubahan D-fruktosa menjadi D-psicose oleh enzim DPEase diawali dari satu Glu (E244) berkordinasi dengan logam Mn2+ untuk menghilangkan proton pada C3 D-fruktosa yang kemudian
4 menghasilkan intermediat cis-enediolate, selanjutnya Glu lainnya (E150) melakukan penambahan proton pada C3 D-fruktosa yang berlawanan dengan C3 D-fruktosa yang sebelumnya (Chan et al. 2012).
Gambar 1. Struktur D-fruktosa dan D-psicose (Zijie, 2013).
Beberapa penelitian yang telah dilakukan untuk memperoleh DPEase dari C.cellulolyticum H10 (Mu, 2011), Ruminococcus sp. (Zhu, 2012) DPEase dari C.scindens ATCC 357 (Zhang, 2013a), C.bolteae (Jia, 2014), C.sp. (Mu, 2013) dan Desmospora sp.
(Zhang, 2013b).
2.3. Cara Kerja Enzim
Enzim bekerja sangat spesifik, sehingga enzim dikatakan mempunyai sifat sangat khas karena hanya bekerja pada substrat tertentu dan bentuk reaksi tertentu (Fesssenden, 1992). Jika suatu substrat melekat enzim yang tepat, maka akan menempel pada enzim.
Tempat menempelnya substrat pada enzim disebut sisi aktif. Kemudian terjadi reaksi dan terbentuk produk. Ada 2 teori mengenai kerja enzim (Page, 1997)yaitu:
a. Teori gembok anak kunci (key-lock) Sisi aktif enzim mempunyai bentuk tertentu yang hanya sesuai untuk satu jenis substrat saja. Substrat sesuai dengan sisi aktif seperti gembok kunci dengan anak kuncinya. Hal itu menyebabkan enzim bekerja secara spesifik. Jika enzim mengalami denaturasi (rusak) karena panas, bentuk sisi aktif berubah sehingga substrat tidak sesuai lagi. Perubahan pH juga mempunyai pengaruh yang sama.
b. Teori cocok terinduksi (induced fit) Sisi aktif enzim lebih fleksibel dalam menyesuaikan struktur substrat. Ikatan antara enzim dan substrat dapat berubah menyesuaikan dengan substrat.
2.4. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Kerja Enzim
Enzim sebagai biokatalisator yaitu senyawa yang dapat mempercepat reaksi tanpa ikut bereaksi (Suhartono, 1992). Enzim sangat penting dalam kehidupan,. Selain dimanfaatkan
5 sebagai biokatalisataor, enzim banyak berperan dalam industri komersial dalam bidang pangan maupun medis dan farmakologi (Walsh, 1994). Untuk mendapatkan suatu produk yang maksimal, maka dalam setiap kali reaksi biologis digunakan enzim untuk mempermudah proses maupun menghemat biaya produksi suatu proses (Bergmeyer, 1987).
Untuk memproduksi enzim dalam jumlah besar dan mempunyai aktivitas yang tinggi, perlu diperhatikan faktor-faktor penting yang mempengaruhi kerja enzim (Reed, 1975). Faktor- faktor tersebut meliputi suhu, pH, konsentrasi enzim, substrat, kofaktor, dan inhibitor.
Enzim bekerja pada kisaran suhu tertentu. Suhu rendah mendekati titik beku tidak merusak enzim, namun enzim tidak dapat bekerja (Lay and Sugyo, 1992). Dengan kenaikan suhu lingkungan, enzim mulai bekerja dan mencapai suhu maksimal pada suhu tertentu. Bila suhu terus ditingkatkan, jumlah enzim yang aktif akan berkurang karena mengalami denaturasi (Poedjiadi, 1994). Kecepatan reaksi enzimatik mencapai puncaknya pada suhu optimum (Rodwell, 1988). Sebagai contoh enzim pepsin membutuhkan suhu optimum kisaran 37ºC sampai 42ºC (suhu ideal dalam tubuh manusia), enzim lipase memiliki suhu optimum yaitu pada suhu 40℃.
pH juga mempengaruhi aktivitas enzim. Perubahan kondisi asam dan basa di sekitar molekul enzim mempengaruhi bentuk tiga dimensi enzim dan dapat menyebabkan denaturasi (Winarno, 1986). Setiap enzim memiliki pH optimum. Misalnya, pepsin (enzim yang bekerja di dalam lambung) mempunyai pH optimum sekitar 2 sedangkan amilase (enzim yang bekerja di mulut dan usus halus) memiliki pH optimum sekitar 7.5.
Stabilitas enzim dapat diartikan sebagai kestabilan aktivitas enzim selama penyimpanan dan penggunaan enzim tersebut (Mozhaev, 1984) serta kestabilan terhadap senyawa yang bersifat merusak seperti pelarut tertentu (asam atau basa), oleh pengaruh suhu dan kondisi-kondisi non fisiologis lainnya (Kazan et al, 1996). Stabilitas enzim dipengaruhi oleh banyak faktor seperti suhu, pH, pelarut, kofaktor dan kehadiran surfaktan (Eijsink et al., 2005). Enzim menunjukkan aktivitas maksimum pada kisaran suhu dan pH optimum enzim dengan stabilitas yang tinggi (Yang, 1996).
Semakin besar konsentrasi enzim semakin cepat pula reaksi yang berlangsung (Page, 1997). Dengan kata lain konsentrasi enzim berbanding lurus dengan kecepatan reaksi. Sisi aktif suatu enzim dapat digunakan berulang kali oleh banyak substrat. Substrat yang berikatan dengan sisi aktif enzim akan membentuk produk. Pelepasan produk menyebabkan sisi aktif enzim bebas untuk berikatan dengan substrat lainnya. Oleh karenanya hanya dibutuhkan sejumlah kecil enzim untuk mengkatalis sejumlah besar substrat (Lehninger, 1982).
6 Bila sejumlah enzim dalam keadaan tetap, kecepatan reaksi akan meningkat dengan adanya peningkatan konsentrasi substrat. Namun, pada saat sisi aktif semua enzim bekerja, penambahan substrat tidak dapat meningkatkan kecepatan reaksi enzim lebih lanjut. Kondisi ini disebut konsentrasi substrat pada titik jenuh atau disebut kecepatan maksimum (Vmax) (Shahib, 2005).
Kofaktor adalah senyawa yang membantu untuk meningkatkan aktivitas enzim (Martoharsono, 1984). Sebagian besar enzim membutuhkan kofaktor untuk meningkatkan aktivitasnya, dan beberapa enzim tidak membutuhkan kofaktor. Tanpa kofaktor, aktivitas enzim akan hilang. Sebagai contoh Magnesium sangat penting untuk heksokinase, polimerase DNA dan enzim glukosa-6-fosfat. Zinc merupakan ion logam penting bagi dehidrogenase alkohol, karbonat anhidrase dan fungsi DNA polimerase dan Kobalt merupakan ion logam penting bagi enzim DPEase dalam menghasilkan D-psicose.
Inhibitor merupakan senyawa yang menghambat ikatan enzim dengan substratnya (Wirahadikusumah, 1997). Ada dua macam inhibitor enzim, yaitu inhibitor kompetitif dan non-kompetitif. Inhibitor kompetitif adalah molekul penghambat yang cara kerjanya bersaing dengan substrat untuk mendapatkan sisi aktif enzim. Inhibitor non-kompetitif adalah molekul penghambat enzim yang bekerja dengan cara melekatkan diri pada luar sisi aktif, sehingga bentuk enzim berubah, dan sisi aktif tidak dapat berfungsi. (Winarno, 1986)
2.5. Purifikasi Enzim
Tujuan yang ingin dicapai dalam pemurnian enzim adalah mengisolasi enzim spesifikasi dan ekstra sel mentah yang mengandung banyak komponen lain (Scopes, 1993).
Permasalahannya adalah memisahkan enzim yang kita kehendaki dari ratusan protein yang mempunyai stuktur kimia dan fisika yang serupa (Reese, 1976). Memperoleh enzim dengan kemurnian yang tinggi, tidaklah mudah butuh biaya serta proses yang lama untuk memperoleh enzim dengan tingkat kemurnian yang tinggi. Metode–metode pemurnian enzim antara lain dialisis, elektorforesis dan kromatografi.
1. Dialisis
Dialisis adalah suatu teknik pemisahan dengan cara menggunakan membran yang memisahkan dua fasa cairan (Scopes, 1993). Membran tersebut bersifat semipermeabel terhadap partikel solut. Partikel solut berpindah melalui membran ke larutan dengan konsentrasi rendah. Dialisis digunakan untuk memisahkan garam-garam dari suspensi dalam biokimia dengan tujuan mencegah koagulasi (Lehninger, 1982). Dialisis adalah metode pemisahan molekul besar (seperti pati atau protein) dari molekul kecil (seperti glukosa atau asam amino) dengan difusi selektif melalui membran semipermeabel. Dialisis bergantung
7 pada suhu dan viskositas larutan. Meskipun suhu tinggi dapat meningkatkan laju difusi, namun sebagian besar protein dan enzim stabil pada suhu 4-8 °C sehingga dialisis harus dilakukan di dalam ruang dingin (Pohl, 1990).
2. Elektroforesis
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik (Scopes, 1993). Hasil dari berbagai manipulasi DNA dan analisis DNA dapat dimonitor melalui proses elektroforesis yang merupakan suatu teknik pemisahan senyawa yang bermuatan dengan meletakkannya pada suatu medan listrik. Elektroforesis memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (Khopkar, 1990).
Teknik ini dipelopori pada tahun 1937 oleh ahli kimia Swedia Arne Tiselius untuk pemisahan protein dan sekarang perkembangannya telah meluas. Ektroforesis merupakan teknik yang umum digunakan untuk analisis DNA dan protein. Melalui teknik ini dapat ditentukan : berat molekul suatu bahan, banyaknya jenis protein pada suatu sampel, adanya pemalsuan bahan atau kerusakan/kontaminasi bahan, adanya antibodi terhadap virus atau bakteri patogen tertentu, titik isoelektrik protein (Smith,1984)
3. Kromatografi
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran secara fisika didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut di antara dua fase, fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas) (Khopkar, 1990). Dari pengertian tersebut dapat diketahui bahwa terdapat dua komponen penting dalam kromatografi, yang fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas) (Scopes, 1993).
Pemisahan dengan metode kromatografi dapat terjadi apabila suatu molekul maupun senyawa memiliki sifat yang berbeda, di antaranya adalah: memiliki kelarutan yang berbeda terhadap suatu pelarut, memiliki sifat kelarutan atau sifat untuk berikatan yang berbeda satu sama lain dengan fase diamnya, memiliki sifat mudah menguap pada temperatur yang berbeda (Boyer 1993). Jenis-jenis kromatografi dapat diklasifikasikan antara lain:
kramatografi adsorpsi, partial, kramatografi penukaran ion, kramatografi eksklusi dan kramatografi afinitas.
a. Kromatografi Adsorpsi
Pada jenis kromatografi adsorpsi, prinsip pemisahan berdasarkan proses adsorpsi analit dalam permukaan padatan fase diam. Padatan fase diam dapat berupa silika gel atau
8 alumina yang memiliki luas permukaan relatif besar. Kromatografi adsorpsi merupakan salah satu metode kromatografi yang cukup lama. Pemisahan didasarkan pada perbedaan sifat afinitas adsorpsi dari komponen sampel pada permukaan padatan aktif. Kromatografi adsorpsi menggunakan fase gerak cairan maupun padatan yang mampu teradsorpsi pada permukaan fase diamnya (Bernfeld, 1955).
Metode kromatografi adsorpsi memiliki beberapa kelemahan dia antaranya yang pertama adalah keterbatasan jumlah adsorben yang dapat digunakan untuk melakukan pemisahan (Reese, 1976). Kedua adalah koefisien distribusi terhadap adsorpsi yang seringkali tergantung pada konsentrasi total komponen yang akan dipisahkan, sehingga mengakibatkan pemisahan kurang sempurna.
b. Kromatografi Partisi
Kromatografi partisi adalah kromatografi dimana proses pemisahannya berdasakan kemampuan adsorpsi pada lapisan tipis cairan yang dilapiskan pada partikel padatan fase diamnya (Murray, 2009). Prinsip utama pemisahan berdasarkan perbedaan kelarutan antara komponen sampel pada fase diamnya (gas chromatography), atau berdasarkan perbedaan kelarutan komponen dalam fase gerak dengan fase diamnya (liquid chromatography).
Keuntungan metode kromatografi partisi ini adalah distribusinya tidak bergantung pada konsentrasi, sehingga pemisahan dapat terjadi lebih baik (Limanto, 2011).
c. Kromatografi Penukar Ion
Pada kromatografi penukar ion, ion terpisahkan berdasarkan gaya elektrostatiknya membentuk grup fungsional yang bermuatan pada fase diam. Kromatografi penukar ion menggunakan resin sebagai padatan fase diam yang berguna untuk mengikat anion atau kation. Larutan ion bermuatan pada fase gerak akan berikatan denga resin yang memiliki muatan berlawanan melalui gaya elektrostatik (Reese, 1976).
Kromatografi pertukaran ion adalah jenis kromatografi yang melibatkan reaksi kimia dalam pemisahannya (Bernfeld, 1955). Dengan demikian, kesetimbangan yang terjadi di permukaan berbeda dengan kesetimbangan kromatografi lainnya. Komponen ionik akan tertahan secara selektif karena berkaitan dengan penukar ion yang ada pada fase diam.
Kromatografi ini mempunyai keterbatasan karena berkaitan dengan perhitungan kimia (Khopkar, 1990).
Kromatografi ini sangat bermanfaat untuk memisahkan molekul – molekul bermuatan terutama ion – ion baik anion maupun kation (Murray, 2009). Metode ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ilmuwan bernama Thompson pada tahun 1850. Beberapa kelemahan dalam kramatografi penukaran ion : larutan ionik seringkali bersifat korosif dan
9 mengakibatkan kolom tidak bertahan lama, beberapa larutan ionik mengabsorbsi pada panjang gelombang UV tetapi membatasi detektor UV, bahan berdasar silika terbatas pada pH di bawah 7,5., fase gerak tidak boleh dibiarkan semalaman tetapi diganti dengan air, untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual, metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama (Limanto, 2011).
d. Kromatografi Eksklusi
Kromatografi eksklusi merupakan tipe kromatografi yang tidak banyak dipengaruhi oleh interaksi antara fase diam dengan zat terlarutnya. Proses pemisahan berdasarkan volume hidrodinamik dari molekul atau partikel. Dalam teknik ini, gel nonionik dengan ukuran pori yang sama digunakan untuk memisahkan campuran berdasarkan perbedaan ukuran molekulnya (BM) (Limanto, 2011).
Molekul-molekul yang kecil akan memasuki pori-pori dari gel sedangkan molekul besar akan melewati sela-sela gel lebih cepat bila dibandingkan dengan molekul yang melewati pori-porinya. Jadi urutan elusi mula-mula adalah molekul yang lebih besar, molekul sedang, dan terakhir molekul yang paling kecil. Apabila fasa diamnya adalah gel yang hidrofil maka teknik ini disebut gel filtration chromatography dan bila digunakan gel yang hidrofob (polystyrene-divinylbenzene) disebut gel permeation chromatography (Khopkar, 1990).
Kekurangan kramatografi ini adalah adanya sejumlah frekuensi terbatas dapat diakomodasikan karena skala waktu kromatogram pendek, tidak dapat digunakan untuk sampel dengan ukuran yang seragam, seperti isomer, diperlukan sedikitnya perbedaan dari berat molekul.
e. Kromatografi Afinitas
Pemurnian enzim atau protein menggunakan teknik kromatografi afinitas pada saat ini sangat populer dan menjadi pilihan utama Kromatografi afinitas cocok untuk memurnikan protein rekombinan Kromatografi afinitas bekerja berdasarkan pada interaksi spesifik antara satu jenis molekul zat terlarut dengan jenis molekul lain yang terimmobilisasi dalam fase diam (Bernfeld, 1955). Sebagai contoh, molekul yang terimmobilisasi dapat menjadi antibodi untuk beberapa protein yang spesifik. Saat zat terlarut yang mengandung campuran protein melewati molekul ini, hanya protein tertentu saja yang akan bereaksi dengan antibodi yang terimmobilisasi pada fase diam(Limanto, 2011).
Ciri yang menonjol pada kromatografi afinitas adalah peningkatan hasil yang signifikan, teknik cepat, dan tidak adanya kontaminasi, kemampuannya untuk secara selektif mengeluarkan satu protein tertentu, atau yang paling sering, sejumlah kecil protein tertentu,
10 dari campuran protein yang kompleks. Permunian yang dicapai melalui teknik kromatografi afinitas ini sangat mengesankan dan sering melebihi hasil yang mungkin di peroleh dengan kramatografi jenis lain. (Murray, 2009)
11 BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Waktu & Tempat Penelitian
Penelitian ini akan dilakukan pada bulan Oktober 2017 sampai Maret 2018 di Laboratorium Carbohidrat Bioengineering Research Group (CBRG) Bioteknologi LIPI Cibinong, Kabupaten Bogor, Jawa Barat.
3.2. Alat dan Bahan
Strain bakteri E.coli BL21 (DE3) pET-dpe (E.coli rekombinan) mengandung gen dpe dari Agrobacterium tumefaciens yang diperoleh dari penelitian sebelumnya (Indradewi et al 2017). Bakteri E.coli rekombinan dikultur pada media Luria-Bertani (LB) yang mengandung Amphicillin (20 mg / mL) pada suhu 37°C dishaker 160 rpm selama 24 jam.
3.3. Prosedur Kerja
3.3.1. Produksi Enzim DPEase
Enzim DPEase diproduksi dari E.coli rekombinan menggunakan media LB cair yang mengandung 10g/L trypone, 5 g/L yeast extract, dan 10 g/L NaCl, amphicilin 20 mg/ml. Ke dalam 1 liter media LB, ditambahkan overnight kultur dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 37 ºC dengan di shaking. Setelah OD600 nm mencapai nilai 0.5-1, inducer, IPTG (final konsentrasi 1 mM) ditambahkan ke dalam kultur, dan diinkubasi pada suhu 18 ºC selam 16 jam. Induced kultur kemudian disentrifugasi untuk mendapatkan biomassa. Biomassa kemudian disuspensi pada 10 mM buffer tris pH 8.0, sonikasi dan disentrifugasi untuk mendapatkan supernatant. Supernatan digunakan sebagai enzim kasar
3.3.2. Purifikasi Enzim DPEase
Purifikasi enzim DPEase dilakukan dengan metode kromatografi afinitas menggunakan His Tag resin. Crude enzim disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4ºC. Supernatan dibuang dan disaring melalui menggunakan membran filter steril ukuran 0,22 μm. Enzim steril siap untuk dimasukkan ke dalam kolom setelah ditambahkan dengan 10 mM larutan Co2+. Kolom His Tag resin dibilas dengan aquades dan dimasukkan 10 ml buffer A masukkan 2 mL larutan enzim DPEase ke kolom, dan kemudian kolom dibilas lagi dengan 20 mL buffer A, diikuti dengan 20 mL buffer B.
Enzim yang dimurnikan dikumpulkan setiap 1,5 ml. Pekerjaan ini dilakukan di bawah suhu 20ºC. Enzim yang dimurnikan diperiksa aktivitas dan kemurniannya. Protein profil DPEase murni diamati menggunakan SDS-PAGE.
12 3.3.3. Elektroforesis SDS PAGE
Berat molekul enzim DPEase dianalisis menggunakan SDS PAGE. Preperasi sampel dimulai dengan menambahkan 10ul loading dye kedalam setiap 10ul crude enzim dan enzim murni DPEase serta ke dalam larutan standart BSA dengan konsentrasi 2 mg/ml, 1 mg/ml, dan 0,5 mg/ml kemudian di vortex lalu dipanaskan selama 5 menit. kemudian semua sampel dirunning kedalam gel elektroforesis selama 60 menit.
3.3.4. Uji Aktivitas Enzim
Aktivitas enzim DPEase ditentukan berdasarkan jumlah D-psicose yang dihasilkan dari konversi D-frukosa. Campuran reaksi mengandung 50 μl enzim murni dan 500 µl larutan fruktosa (100 g / ml) dalam 50 μl Tris-HCL 1 M pH 8,0 dan 400 μl air suling selama 10 menit pada 40 °C.. Reaksi dihentikan dengan memanaskan pada suhu 100°C selama 10 menit. Sisa fruktosa campuran enzim yang terdapat pada cairan reaksi enzim dihilangkan dengan menambahkan kultur S.cereviceae ke dalam campuran dengan perbandingan 1: 1 v/v dan dinkubasi suhu 37°C, lalu di shaker 160 rpm selama 16 jam. Khamir S.cereviceae dihilangkan dari cairan reaksi enzim dengan cara disentrifuge pada kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Jumlah D-psicose yang dikeluarkan dari hasil reaksi dianalisis dengan metode Cysteine-carbazole (Kierstan, 1978). Penyerapan warna ungu dari D-psicose diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 570 nm. Konsentrasi D-psicose konsentrasi dalam sampel medium dikalibrasi kurva standar konsentrasi serial standar D- psicose dari dalam beberapa kondisi. Satu unit aktivitas DPEase ditentukan sebagai jumlah μmol D-psicose yang dibebaskan pada kondisi penentuan. Kandungan protein yang ditentukan menggunakan metode Lowry (Lowry et al. 1951), dan serum albumin sapi digunakan sebagai standart.
3.3.5. Karakterisasi Enzim
Enzim DPEase dikarakterisasi berdasarakan variasi suhu, pH, waktu inkubasi dan ion logam.
Untuk mengetahui suhu optimum pada enzim DPEase dilakukan dengan menginkubasi enzim pada suhu 30, 35, 40, 45, dan 50 °C. Selama pengujian, 0,5 ml D- fruktosa (50 g/L) sebagai larutan substrat dan 0,1 ml buffer TrisHCL pH 8 diinkubasi dengan larutan enzim 0,1 mL pada variasi suhu selama 10 menit.
Untuk mengetahui pH optimum pada enzim DPEase dilakukan pada nilai pH di kisaran 6.0 hingga 10.0. Buffer sodium fosfat (1M) digunakan pH 6.0-7.0 sementara pH 8.0- 9.0 digunakan buffer Tris-HCl (1M), buffer Glycine (1M) digunakan untuk nilai pH 10.0.
Untuk menguji efek pH, pH bervariasi dari 6.0-10.0 pada suhu 40°C selama 10 menit.
13 Untuk mengetahui kofaktor dan inhibitor pada enzim DPEase dilakukan dengan sembilan ion logam yaitu Mn2+, Mg2+, Mo2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Fe2+, Zn2+, Ni2+. Sebelum mengkarakterisasi, untuk menghilangkan efek ion logam pada DPEase, enzim harus didialisis EDTA. Dialisis enzim dilakukan pada suhu 16°C selama 24 jam menggunakan buffer Heppes (pH 8.0). Buffer Heppes diganti setiap 30, 60 dan 120 menit. Setelah 24 jam dialisis, enzim siap untuk dikarakterisasi.
Karakterisasi kofaktor dilakukan dengan menambahkan ion logam ke reaksi enzim.
Pengujian enzim dilakukan seperti di atas, dan ion logam ditambahkan untuk larutan logam 0,1 mL (Mn2+, Mg2+, Mo2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Fe2+, Zn2+, Ni2+), diikuti dengan inkubasi dengan 0,1 mL larutan enzim pada suhu 40°C selama 1 jam. Kofaktor akan meningkatkan aktivitas enzim sementara inhibitor berkurang.
14 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil penelitian mengenai pemurnian enzim D-psicose 3-Epimerase dengan menggunakan metode kramatografi afinitas dan karakterisasi suhu, pH, dan ion logam setelah pengujian maka dapat diketahui karakter sebagai berikut:
4.1. Produksi dan Purifikasi Enzim DPEase
Enzim D-psicose 3-Epimerase yang diproduksi dari media Luria Bertani Cair dengan penambahan kultur E.coli BL21 pET dpe rekombinan telah berhasil diproduksi yaitu sebesar 32 kDa, ukuran protein tersebut diperoleh dengan menggunakan SDS-PAGE.
Tabel 1. Profil dari crude enzim dan enzim murni DPEase Volume
(mL)
Total protein (mg)
Total aktivitas (U)
Aktifitas spesifik (U/mg)
Tingkat kemurnian
Hasil (%)
Crude enzim 2 9.55 48 5.02 1 100
Affinity
chromatography 1.5 8.05 41 5.09 1.01 84.2
Enzim DPEase adalah enzim intraseluler dan untuk mendapatkan crude enzim terlebih dahulu harus dilakukan pemecahan sel dengan cara sonikasi. Crude DPEase memiliki aktivitas 5,02 U / mg dan total protein 9,55 mg dari 2 mL volume crude enzim. Penggunaan kromatografi afinitas meningkatkan kemurnian enzim 1,01 kali daripada enzim kasar dengan aktivitas spesifik 5,09 U/mg dan hasil kemurniannya mencapai 84,2% (Tabel 1). Hasil pemurnian menunjukkan bahwa protein DPEase dipisahkan dengan baik dari protein yang terkontaminasi, meskipun kandungan proteinnya dianggap rendah dalam penelitian ini.
Kemurnian enzim murni dikonfirmasi melalui SDS-PAGE seperti yang ditunjukkan pada Gambar.1. Selain itu, SDS-PAGE digunakan untuk menentukan berat molekul protein.
Crude DPEase dari supernatan mengandung banyak protein yang larut termasuk DPEase (Gbr.2, jalur 5). Di Jalur 6 adalah fraksi protein tidak terikat yang, tidak berinteraksi dengan resin Tag-Nya. Fraksi washing (jalur 7) adalah protein berinteraksi dengan resin dan akan keluar. Sementara di jalur 8 adalah elusi, protein yang bukan target akan keluar dari kolom (Gbr.1). Keberadaan protein DPEase ditunjukkan sebagai pita tunggal pada 32 kDa berat molekul dalam fraksi elusi. Dengan demikian, enzim DPEase murni diperoleh dengan sukses hanya dengan kromatografi langkah tunggal menggunakan kromatografi afinitas His-Tag.
15 DPEase berhasil dimurnikan dalam keadaan aktif, dengan menggunakan satu langkah kromatografi afinitas. Kolom 6xhis tag dan dikonfirmasi melalui elektroforesis SDS-PAGE dan uji aktivitas enzim. DPEase murni dalam penelitian ini memiliki aktivitas spesifik 5,09 U/mg. Aktivitas DPEase yang dilaporkan oleh penelitian lain yang diisolasi dari A.tumefaciens (Kim, 2006), dilaporkan lebih tinggi dari penelitian ini. Dari rekombinan yang sama, penelitian ini lebih rendah dari DPEase lain yang sebelumnya dilaporkan oleh Kim (2006) 8,89 U/mg. Hal ini dikarenakan pada penelitannya enzim kasar dimurnikan dengan menggunakan kromatografi tiga langkah yaitu HisTrap HP, HiPrep, dan Sephacryl S-300 HR chromatography sedangkan pada penelitian ini enzim kasar dimurnikan dengan menggunakan kromatografi tiga langkah yaitu HisTrap HP.
Gambar 2. Massa molekuler DPEase murni dari E.coli BL21 (DE3) pET-21b mengandung gen dpe dengan kromatografi afinitas. Lane (1-3) Bovine Serum Albumin (BSA) pada konsentrasi 2 ug / mL, 1 ug / mL 0,5 ug / mL; Marka berat molekul Lane 4; Jalur 5-8: crude enzim, protein tak terikat, protein washing, protein elusi.
4.2. Karakterisasi Suhu
Enzim bersifat termolabil, artinya aktivitas enzim dipengaruhi oleh suhu. Semua enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme bekerja pada rentang suhu tertentu. Untuk itu karakterisasi suhu bertujuan untuk menentukan suhu optimum enzim DPEase (Gambar 3).
Aktivitas enzim akan terus meningkat sampai batas suhu tertentu. Batas suhu tersebut dinamakan suhu optimum (Rodwell, 1988).
16
Gambar. 3 Pengaruh suhu terhadap aktivitas DPEase. Reaksi dilakukan dalam pH 8.5 selama 10 menit.
Pengaruh suhu pada DPEase ditunjukkan pada Gambar 3. Aktivitas DPEase meningkat secara signifikan dan mencapai aktivitas optimal ketika suhu 40°C. Peningkatan suhu lebih dari 40°C akan menurunkan aktivitas enzim secara signifikan. Aktivitas DPEase berada di suhu sedang. DPEase dikategorikan dalam kelompok enzim mesofilik. Enzim yang termasuk dalam kelompok ini memiliki aktivitas maksimum pada suhu sedang.
Enzim murni memiliki suhu optimum lebih rendah dibandingkan crude enzim. Crude DPEase memiliki suhu optimal pada 45°C. Crude enzim lebih stabil pada suhu tinggi daripada enzim murni. Ini mungkin disebabkan oleh efek dari co-factor. Co-faktor akan meningkatkan stabilitas enzim terhadap suhu. Enzim murni kehilangan stabilitasnya karena, selama tahap pemurnian, semua co-faktor telah dihapus dari enzim (Graslund, 2008)
Beberapa penelitian yang telah dilakukan pada enzim DPEase dengan menggunakan mikroorganisme yang berbeda seperti bakteri dari C.bolteae optimum pada suhu 55ºC (Jia, 2013), enzim DPEase dari C.cellulolyticum H10 optimum pada suhu 55ºC (Mu, 2011) dan enzim DPEase dari Treponema primitia ZAS-1 optimum pada suhu 70ºC (Zhang, 2015).
Dengan adanya peningkatan suhu maka kecepatan enzim untuk bisa berikatan dengan substrat pada sisi aktif enzim akan semakin cepat dan menghasilkan produk yang semakin tinggi. Namun jika suhu terlalu tinggi akan menyebabkan denaturasi atau rusaknya (Poedjiadi, 1994) bentuk tiga dimensi enzim yang menyebabkan enzim tidak berikatan lagi dengan substrat (Ahern and Klibanov, 1987).
0 20 40 60 80 100
30 35 40 45 50
Suhu (⁰C)
Aktivitas relatif (%)
17
4.3. Karakterisasi pH
Aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh nilai pH atau derajat keasaman. Ini karena muatan komponen asam amino enzim berubah bersama dengan perubahan nilai pH.
Kebanyakan enzim tetap stabil dan bekerja baik pada kisaran pH 6-8. Enzim akan kehilangan aktivitasnya karena pH yang terlalu asam dan basa kuat. Untuk itu karakterisasi pH bertujuan untuk menentukan pH optimum enzim DPEase (Gambar 4).
Gambar.4 Pengaruh pH pada aktivitas DPEase. Aktivitas DPEase diukur pada suhu 40°C selama 10 menit
Berdasarkan kurva tersebut, aktivitas enzim DPEase meningkat seiring dengan peningkatan pH (Gambar 4). Enzim DPEase memiliki kisaran pH optimum yang sempit.
Enzim mencapai aktivitas maksimum pada pH 8,5. Aktivitas DPEase rendah pada pH 6,0, meningkat dengan meningkatnya pH dan optimum pada pH 8,5. Peningkatan di atas pH 8,5 menghasilkan penurunan aktivitas yang signifikan. Ketika nilai pH menjadi terlalu tinggi atau terlalu rendah, maka struktur dasar enzim dapat mengalami perubahan dimana sisi aktif enzim tidak dapat mengikat substrat dengan benar sehingga aktivitas enzim menjadi sangat terpengaruhi. Bahkan enzim dapat benar-benar berhenti berfungsi (Winarno, 1986).
Enzim DPEase telah dilakukan optimasinya oleh peneliti pada beberapa bakteri seperti bakteri A.tumafaciens memiliki pH optimal yaitu 8.0 (Kim, 2006), enzim DPEase dari C.bolteae memiliki pH optimal yaitu 7.0 (Jia, 2013), enzim DPEase dari C.cellulolyticum H10 memiliki pH optimal yaitu 8.0 (Mu, 2011) dan enzim DPEase dari Treponema primitia ZAS-1 memiliki pH optimal yaitu 8.0 (Zhang, 2015).
18 4.4. Pengaruh Ion Logam Terhadap Aktivitas Enzim
Enzim DPEase ini termasuk dalam kelompok enzim metaloprotein karena memerlukan ion logam untuk meningkatkan aktivitasnya enzim (Jia, 2013). Fungsi ion logam ialah untuk memantapkan ikatan antara substrat pada enzim atau mentransfer elekrtron yang timbul selama proses katalisa. Untuk melihat peningkatan aktivitas enzim DPEase pada ion logam dapat dilihat pada (Tabel 2).
Tabel 2. Pengaruh ion logam terhadap aktivitas DPEase.
Metal ions Aktivitas relatif (%)
None 100
Mn2+ 154
Mg2+ 90
Mo2+ 79
Cu2+ 70
Co2+ 184
Ca2+ 82
Fe2+ 122
Zn2+ 83
Ni2+ 109
Untuk nilai relatif aktivitas diatas nilai kontrol maka ion logam tersebut disebut dengan kofaktor dan untuk nilai relatif aktivitas dibawah kontrol maka ion logam tersebut disebut inhibitor.
Aktivitas DPEase meningkat dengan adanya faktor-faktor bersama, Co² +, Mn² +, Fe² +, Ni² + dan dihambat di hadapan Mg² +, Mo² +, Cu² +, Ca² +, Ca² +, Zn² +. Yang menarik adalah semua sumber genetik dari A.tumafaciens. DPease kami memiliki kemiripan dengan DPEase yang dilaporkan oleh Tseng et al (2018) yang membutuhkan ion kobalt, tetapi berbeda dengan DPEase yang dilaporkan oleh Kim (2006) yang membutuhkan lebih banyak ion Mn2+. Jika dilihat dari karakter suhu optimal DPEase pada penelitian ini hanya sekitar 40°C, nilai ini relatif lebih rendah daripada dua DPEase 55°C (Tseng et al, 2018) dan 50°C untuk (Kim, 2006).
Di antara faktor-faktor pendamping, penambahan Fe²+ direkomendasikan dalam industri makanan, mengingat manfaatnya bagi tubuh manusia dan aman untuk dikonsumsi tubuh. Secara keseluruhan, dari isolasi enzim DPEase dari Agrobacterium sp, DPEase kami memiliki karakter yang berbeda telah dilaporkan. Suhu optimal yang rendah berguna untuk meminimalkan kecepatan reaksi miliard pada pH basa dan benar-benar berguna untuk meminimalkan ketergantungan pada ion logam Cu²+ dan Mn²+ yang berbahaya dalam kesehatan tubuh. Penggunaan Fe²+ sebagai faktor pendamping dan sangat penting, karena
19 Fe²+ diperlukan untuk tubuh kita. Saat ini, kami sedang mengembangkan makanan fungsional berdasarkan penggunaan enzim DPEase.
4.6. Perbandingan Karakter Enzim DPEase
Sumber genetik DPEase dari E.coli BL21 (DE3) pET-21b dpe dalam penelitian ini diperoleh dari strain lokal A.tumefaciens.
Tabel 3. Perbandingan data karakter enzim DPEase dari beberapa penelitian
Strain Suhu pH Metal ion Referensi
A.tumefaciens ATCC 33970 Dpease
50 oC 8.0 Mn²+ (Kim, 2006)
A.tumefaciens CGMCC 1.1488
50 oC 7.5 Co²+ Mn²+ (Chen et al, 2017) A.tumefaciens ATCC 33970
DPEase
60 oC 8.5 - (Chang et al,
2015) A. tumefaciens . ATCC
31749
55 oC 7.5- 8.0
Co²+ (Tseng et al, 2018) A. tumefaciens lokal 40 oC 8.5 Co²+ Mn²+ Penelitian ini
DPEase murni dari penelitian ini memiliki aktivitas optimal pada pH 8.5 dan suhu 40°C. Karakter yang diperoleh dari penelitian ini mirip dengan karakter DPEase yang diisolasi dari Shinorizobium sp. (Oh, 2007). Namun hasil yang berbeda dilaporkan oleh Kim (2006), (Chen et al, 2017), (Chang et al, 2015), (Tseng et al, 2018). DPEase murni aktivitas optimal pada pH 8.0 dan suhu 50°C. Perbedaan komposisi asam amino yang membangun DPEase dapat menghasilkan hasil yang berbeda dari aktivitas enzim yang sama.
20 BAB IV
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
1. Enzim DPEase yang dimurnikan menggunakan kolom 6xhis tag dengan satu kali purifikasi langsung dalam keadaan aktif. Dikonfirmasi melalui elektroforesis SDS-PAGE dan uji aktivitas enzim. Menurut hasil elektroforesis, enzim DPEase pada penelitian ini muncul dalam pita tunggal dengan massa molekul 32 kDa yang menunjukkan keberhasilan pemurnian menghasilkan aktivitas spesifik 5,09 U/mg.
2. DPEase murni menunjukkan aktivitas optimal pada pH 8,5 dan suhu 45°C. Aktivitas DPEase ditingkatkan dengan ketersediaan kofaktor, Co² +, Mn² +, Fe² +, Ni² + dan dihambat di hadapan Mg² +, Mo² +, Cu² +, Ca² +, Ca² +, Zn² +.
5.2. Saran
Untuk industrialisasi enzim DPEase dibutuhkan upaya perbaikan. Penambahan kofaktor Fe2+ bisa digunakan untuk menjawab persoalan itu. Fe2+ sangat direkomendasikan untuk aplikasinya di industri makanan..
21 DAFTAR PUSTAKA
Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., & Pedersen, J. (2006). Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification, 48 (1), 1–13. doi:10.1016/ j.pep. 2005.12.002.
Baek SH, Park SJ, Lee HG. (2010) D-psicose, a sweet monosaccharide, ameliorate hyperglycemia, and dyslipidemia in C57BL/6J db/db mice. J Food Sci. 2010 Mar;
75(2):H49-53. doi: 10.1111/j.1750-3841.2009.01434.x.
Bergmeyer, H.U. (1987). Method of Enzymatic Analysis. VCH.Vo1.IV:45-49.
Bernfeld, P., (1955), Amylases α and β, Dalam Colowick, S.P. and N.O. Kaplan (Eds), Methods in Enzymology and Related of Biochemistry. Academic Press, New York.
Blattner, F.R, Plunkett, G, Bloch, C.A. (1997). The complete genome sequence of Eschericia coli K-12. Science 277, 1453-1474.
B.-C. Lim, Hye Jung Kim, Deok Kun Oh.(2009) . A stable immobilizied D-psicose 3- epimerase for the production of D-psicose in the present of borate. Process Biochemistry 44 (2009) 822–82. doi:10.1016/j.procbio.2009.03.017
Bollag, D.M. and Edelstein. S. J. (1991). Protein Methods. Willey-liss. Newyork
Boyer, R.F. (1993). Modern Experimental Biochemistry. The Benjamin Chummings PCI California.
Bradford, MM. (1976). A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantitaties of protein in utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal.Biochem.72:248-254.
Builder, E. (1993). Hydrophobic Interaction Chramatograhy : Principle and Methods.
Amersham Biosciens, San Fransisco.
Chen X, Wanga W , Xua J, Yuana Z, , Yuana T, Zhanga Y , Lianga C, Hea M , Guoa Y.
(2017). Production of D-psicose from D-glucose by co-expression of D-psicose 3- epimerase and xylose isomerase. Enzyme and Microbial Technology 105 (2017) 18–23..
Choi , J. G., Ju, Y.H., Yeom, S.J., & Oh, D.K. (2011). Improvement in the thermostabiliy of D-Psicose 3-Epimerase from Agrobacterium tumafaciens by random and site-directed mutagenesis. Alied and Environmental Microbiology, 77,7316e7320.
