RT-PCR Konvensional dan Real Time
Percobaan membandingkan RT-PCR konvensional dan real time dilakukan untuk mengetahui perbedaan sensitivitas kedua uji dalam mendeteksi VAI H5. Virus yang digunakan sebagai kontrol positif (A/chicken/Indonesia/SmiWN 18/2009; GenBank accession number: JF302895) diencerkan secara serial 1:1 kemudian diekstraksi dan dilakukan RT-PCR H5 secara konvensional maupun
real time. Dengan RT-PCR konvensional, virus dapat terdeteksi hingga
pengenceran 2-14 sedangkan menggunakan teknik real time, virus dapat terdeteksi hingga pengenceran 2-22 (Gambar 5). Perbedaan pengenceran hingga 28 ini menunjukkan bahwa RRT-PCR dapat mendeteksi sampel dengan konsentrasi hingga 250 kali lebih rendah dibandingkan RT-PCR konvensional. Lee dan Suarez (2004) menemukan bahwa RRT-PCR H5 memiliki limit deteksi 103-104 salinan gen atau 10 EID50 dan kuantitas RNA yang ditentukan dengan metode
RRT-PCR berkorelasi erat dengan EID50 yang ditentukan dengan metode isolasi
virus pada embrio ayam.
a b
Gambar 5. Perbandingan hasil PCR konvensional dan real time (a) elektroforesis gel RT-PCR konvensional, H5 terdeteksi hingga pengenceran 2-14 dan (b) grafik amplifikasi RRT-PCR hingga pengenceran 2-22.
Pada pengenceran virus 2-6 diperoleh nilai Ct 19,97 sehingga pengenceran
ini digunakan untuk mengencerkan stok virus yang kemudian diekstraksi dan RNA hasil isolasi dibagi kedalam tabung-tabung berisi 8 µl untuk digunakan sebagai kontrol positif PCR. Pembagian kontrol kedalam tabung-tabung dengan
volume satu atau dua kali run dilakukan untuk menghindari frezee-thaw. Untuk kontrol positif isolasi RNA, stok virus diencerkan 2-15 dan dibagi kedalam tabung-tabung berisi 100 µl sehingga dapat digunakan pada dua kali isolasi RNA.
Gambar 6. Grafik amplifikasi real time RT-PCR (a) matriks sampel bulan kedua dan (b) subtipe H5 berbagai bulan pengambilan sampel. Grafik eksponensial yang melewati threshold (garis hijau) menunjukkan hasil positif sedangkan background noise di bawahnya merupakan hasil negatif.
Gambar 6 menunjukkan hasil RRT-PCR MA sampel bulan kedua dan H5 berbagai bulan pengambilan sampel dengan kontrol positif dan negatif isolasi RNA dan PCR Teknik RT-PCR konvensional mendeteksi RNA setelah reaksi PCR selesai dan dilanjutkan dengan elektroforesis gel yang memerlukan waktu serta melibatkan bahan kimia berbahaya seperti etidium bromida dan sejenisnya. Sedangkan bahan kimia yang digunakan dalam RRT-PCR lebih aman dan memungkinkan deteksi dilakukan pada tahap awal reaksi sehingga dalam hal ini teknik real time lebih menguntungkan dibandingkan konvensional. Secara konvensional hasil yang diperoleh bersifat kualitatif sedangkan secara real time hasil yang diperoleh merupakan konsentrasi relatif RNA target dalam bentuk nilai Ct dari perpotongan antara kurva amplifikasi dengan garis threshold.
Influenza A
Tingkat kesepakatan antara pengujian RRT-PCR matriks (MA RRT-PCR) untuk mendeteksi keberadaan virus influenza A dan isolasi virus pada embrio ayam tidak 100% sehingga PCR MA positif/isolasi virus negatif dan RRT-PCR MA negatif/isolasi virus positif pada sampel usap dapat terjadi (Spackman et
al. 2002; Cattoli et al. 2004). Sensitivitas diagnostik relatif RRT-PCR terhadap
isolasi virus adalah 85,1% dengan spesifisitas 98,9% (Elvinger et al. 2007) sehingga hasil RRT-PCR diinterpretasikan pada tingkat kandang/peternakan daripada tingkat individu.
Dari 3.240 sampel yang diharapkan, berhasil dikoleksi 2.786 sampel karena faktor kematian atau itik yang tidak ditemukan saat pengambilan sampel. Virus influenza A dapat ditemukan di ketiga tipe peternakan, dan telah ada sejak awal pengambilan sampel di peternakan tipe 1 dan 2. Pada peternakan tipe 1, VAI terdeteksi hampir setiap bulan pengambilan sampel kecuali Januari (Tabel 2). Keberadaan VAI di peternakan tipe 2 terdeteksi saat screening di bulan September, Desember, Januari, dan Maret. Sedangkan pada peternakan tipe 3, VAI hanya ditemukan di akhir pengambilan sampel bulan Maret pada sampel usap kloaka dan orofaringeal itik sentinel maupun non sentinel.
Dari total 614 pool sampel usap kloaka dan orofaringeal yang diambil selama tujuh bulan, didapati 98 (16%) pool positif VAI. Perbandingan usap
kloaka positif hampir seimbang dengan usap orofaringeal yaitu masing-masing 52 (53,1%) dan 46 (46,9%) dengan nilai Ct yang bervariasi (Tabel 2). Virus AI
terdeteksi secara berulang sejak saat screening pada bulan September di tiga peternakan dari tipe 1 dan 2. Umumnya pengulangan terjadi pada dua waktu pengambilan sampel kemudian virus menghilang dan terdeteksi kembali pada bulan berikutnya atau virus hilang timbul pada tingkat pool dari waktu ke waktu pengambilan sampel. Di tingkat peternakan, VAI dapat ditemukan hampir setiap bulan pada peternakan tipe 1, kecuali bulan Januari pada P1 dan Januari-Februari pada P2. Pada peternakan tipe 2 VAI lebih jarang ditemukan dan hanya berulang pada P3 yaitu September, Desember, dan Januari. Sedangkan pada P4 VAI hanya ditemukan di bulan Maret setelah itik dalam peternakan diganti dengan itik yang dibeli dari peternak lain. Hal ini menunjukkan peran introduksi itik baru dalam penularan VAI pada peternakan itik angon.
Tabel 2. Virus AI di tiga tipe peternakan itik angon Kabupaten Indramayu.
Peternakan Waktu pengambilan sampel Ct MA Subtipe H5
Tipe 1 September 2009 36-38 -Oktober 2009 30-35 + November 2009 25-33 -Desember 2009 26-38 -Januari 2009 - -Februari 2009 36 -Maret 2009 33-38 + Tipe 2 September 2009 29-38 -Oktober 2009 - -November 2009 - -Desember 2009 37 -Januari 2009 29-37 + Februari 2009 - -Maret 2009 28-37 + Tipe 3 September 2009 - -Oktober 2009 - -November 2009 - -Desember 2009 - -Januari 2009 - -Februari 2009 - -Maret 2009 28-37
-Pengulangan kemunculan VAI dalam peternakan menunjukkan bahwa VAI bersirkulasi di satu peternakan untuk waktu yang lama dan mungkin melibatkan lebih dari satu strain virus meskipun shedding virus terjadi dalam rentang waktu tertentu pada tingkat pool. Penelitian eksperimental pada itik berumur 2-16
minggu yang diinfeksi virus A/Mallard/MN/ 355779/00 (H5N2) mengeluarkan virus yang terdeteksi dengan RRT-PCR hingga hari ke 16 pascainfeksi kemudian virus tidak terdeteksi pada hari ke 21 (Costa et al. 2010). Percobaan lain menunjukkan bahwa itik yang direinokulasi setelah 28 hari pascainfeksi awal dengan virus yang sama (LPAI H7N2) tidak mengeluarkan virus melalui kloaka maupun trakhea (Kida et al. 1980). Namun infeksi yang pernah terjadi tidak dapat melindungi itik terhadap infeksi berikutnya oleh subtipe virus lain. Sebagai contoh, itik yang diinfeksi subtipe H4N6 terlindungi dari infeksi ulang dengan virus yang sama tetapi mengeluarkan virion selama 8 hari setelah ditantang dengan isolat H11N3 (Austin dan Hinshaw 1984).
Tabel 3. Persentase sampel usap kloaka/orofaringeal positif di 6 peternakan itik Tipe P VAI Sep-N Sep Okt Nov Des Jan Feb Mar Mar-N
1 1 MA 0/0 0/33 33/50 17/17 33/17 0/0 0/0 20/0 17/0 H5 0/0 0/0 10/33 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 2 MA 17/0 17/0 33/17 0/0 67/17 0/0 17/0 33/100 33/50 H5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/4 0/0 2 3 MA 50/50 50/17 0/0 0/0 33/0 67/67 0/0 0/0 0/0 H5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 94/71 0/0 0/0 0/0 4 MA 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 67/33 50/100 H5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 8/0 0/43 3 5 MA 0/0 0/0 0/0 17/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 H5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 6 MA 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 100/100 100/100 H5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 Virus AI lebih banyak ditemukan pada peternakan tipe 1, diikuti tipe 2, dan terendah pada peternakan tipe 3 selama periode pengambilan sampel. Pada P1 dan P2 (tipe 1) terlihat pola pengulangan kemunculan VAI yang mirip satu sama lain. Pada P3 dan P4 (tipe 2) pengulangan kemunculan VAI hanya terjadi pada P3 yang memelihara itik hasil penetasan sendiri dengan wilayah angon sempit yaitu disekitar kandang. Sedangkan pada P4 yang wilayah angonnya lebih luas dan berinteraksi dengan P2 (tipe 1), VAI terdeteksi pada sampel usap sentinel pada bulan akhir pengambilan sampel di lokasi yang sama dan setelah keduanya mengganti itik. Hal ini menunjukkan bahwa kesamaan wilayah angon mungkin mempengaruhi kemunculan VAI pada peternakan, sama seperti kontak intensif antar itik dalam satu peternakan dan introduksi itik baru. Pada P5 dan P6 (tipe 3), hanya salah satu peternakan yang terdeteksi VAI positif yaitu di akhir pengambilan sampel sehingga tidak terlihat adanya pengulangan. Perbedaan
1 2 3 4 5 6 penemuan VAI sanga yang sel mengeluar mudah un lebih mud P6 di akhi Subtipe H Viru (Gambar diperiksa terhadap s positif H5 bahwa itik saluran pe Gambar 7 Subt peternakan seperti kem di tingkat satu petern 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% Sep-09 N Sep-09 Ok t-09 T n VAI dalam at dipengaru lalu dikan rkan virus i ntuk dikenda dah akibat k ir pengambi H5 us AI subt 7). Dari t 453 sampe subtipe H5 5 masing-m k angon yan ernafasan di ŰK . Distribusi tipe H5 te n tipe 1 (P1 munculan v peternakan nakan namu Ok t-09
Nov-09 Des-09 Jan-10 Feb-10
Tipe 1 m satu tipe uhi oleh ke ndangkan m influenza A alikan. Nam kontak inten ilan sampel tipe H5 ha total 98 sa el individu dengan pe masing 18 ng diteliti m ibandingkan KloakaŰOr i temporal V erdeteksi p Oktober, P virus influen n. Hal ini m un tidak be Mar-10 Mar-10 N 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% peternakan adaan lingk memiliki A karena ke
mun bila ter nsif antar it pada bulan anya ditemu ampel pool u dan didap rbandingan (36,7%) da mengeluarka n pencernaa rofaring H VAI di tiga pada samp P2 Maret) d nza A, subti menunjukka rtahan lama Sep-09 N Sep-09 Ok t-09 Nov-09 Tipe 2 n ini menun kungan mas kecenderun ebersihan da rjadi infeksi tik dalam k n Maret (Tab ukan pada l yang pos pati 49 (10 n sampel us an 31 (63,3 an VAI subt an. H5 Kloaka tipe peterna pel usap k an tipe 2 (P pe H5 tidak an bahwa su a karena ke
Des-09 Jan-10 Feb-10 Mar-10
Mar 10 N 2 njukkan bah sing-masing ngan lebih an keamana i maka penu kandang sep bel 3). peternakan sitif terhada 0,9%) samp sap kloaka d 3%). Hal in tipe H5 lebi H5 Orof akan itik an kloaka dan P3 Januari, P k ditemukan ubtipe H5 emudian me Mar -10 N 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% Sep-09 N S 09 hwa kemun g peternakan h sedikit/j an biologis ularan juga perti terjadi n tipe 1 d ap influenz pel yang p dan orofari ni menunju ih sering m faring ngon n orfaringe P4 Maret). T n secara beru dapat munc enghilang se S ep-09 Ok t-09
Nov-09 Des-09 Jan
-10 Tipe 3 nculan n. Itik arang lebih akan pada dan 2 za A, positif ingeal ukkan elalui al di Tidak ulang cul di eiring Jan 10 Feb-10 Mar-10 Mar-10 N
kematian itik yang terinfeksi atau pembersihan virus (clearance). Temuan ini didukung oleh hasil penelitian yang menginfeksi virus H5N1 HPAI maupun LPAI pada itik dan menghasilkan shedding virus terdeteksi hingga hari ke 11-17 pascainfeksi kemudian virus menghilang (Hulse-Post et al. 2005).
Jumlah VAI subtipe H5 yang ditemukan bervariasi selama pengambilan sampel. Dilihat dari tipe peternakan, VAI H5 lebih banyak ditemukan pada tipe 2, diikuti tipe 1, dan tidak ditemukan pada tipe 3 (Tabel 4). Pada P1 dan P2 (tipe 1) subtipe H5 lebih banyak ditemukan pada sampel usap orofaringeal. Subtipe H5 ditemukan di P1 setelah sebelumnya 10 ekor sentinel mati. Temuan ini membuka kemungkinan bahwa virus yang ada di peternakan tipe 1 merupakan HPAI pada itik yang dicirikan oleh virus lebih tinggi/sering ditemukan pada usap orofaringeal dibandingkan usap kloaka (Sturm-Ramirez et al. 2004; Keawcharoen et al. 2008). Hal ini juga didukung oleh hasil penelitian yang menginfeksi itik dengan isolat HPAI H5N1 setelah 2002 dan menemukan bahwa shedding virus melalui trakhea secara signifikan lebih tinggi dibandingkan kloaka (Sturm-Ramirez et al. 2005) terlepas dari rute infeksi. Penemuan VAI H5 yang kemungkinan merupakan HPAI pada peternakan tipe 1 yang sepenuhnya memelihara itik dengan cara diangon ini dikhawatirkan akan berdampak pada penyebaran virus ke lingkungan maupun unggas lain dalam wilayah yang luas. Hal senada juga dilaporkan oleh Gilbert (2006) yang menemukan keterkaitan erat antara tingginya H5N1 di Thailand dengan besarnya jumlah itik angon yang didukung oleh luasnya pertanian basah serta tingginya populasi unggas darat, dan manusia.
Tabel 4. Virus AI subtipe H5 di peternakan itik angon, Indramayu
Tipe P Keadaan peternakan
Asal itik Bulan Rute Jml Ct
1
1 10 ekor sentinel mati Penetasan sendiri Oktober kloaka orofaringeal 1 5 33 29-35 2 itik baru, 4 ekor
sentinel mati Peternakan lain Maret orofaringeal 1 36 2 3 kematian meningkat, 2 ekor sentinel mati
Penetasan sendiri Januari kloaka orofaringeal 16 12 21-36 19-36 4
itik baru, 3 ekor sentinel mati Peternakan lain Maret Maret-NS kloaka orofaringeal 1 13 35 16-36
Pada di bulan J dengan rat tinggi dib 5,32) dan tersebut m positif leb fekal-oral yang dipe infeksi VA epitel salu a b Gambar 8 a P3 (tipe 2 anuari men ta-rata kons bandingkan 27,83 (STD merupakan v bih tinggi dib
(Webster e eroleh pada AI sebelum uran pencern . Distribusi angon ke didatangi bulan pe menunjuk 2) VAI H5 l gikuti kema sentrasi viru orofaring, D 5,64). Hal virus LPAI bandingkan et al. 1992 a peternakan tahun 2002 naan (Webs i wilayah eenam pete peternakan ngambilan kkan bulan d lebih banya atian 2 itik us yang diek terlihat dar l ini membu pada itik y n orofaringe 2). Temuan n tipe 1 in 2 yang umu ster et al. 19 angon itik ernakan dan n angon pad sampel (1 ditemukan s ak ditemuka sentinel (ter kskresikan ri nilai Ct m uka kemung yang dicirika eal dan biasa yang berto ni bisa saja mnya tidak 978). k Kabupaten n (b) lokas da bulan ter 1-6 = Okto subtipe H5. an pada sam rendah dian melalui klo masing-mas gkinan bahw an oleh jum anya ditular olak belaka terjadi kar k patogen pa n Indramay si peternak rtentu. Angk ober-Maret) mpel usap k ntara petern oaka sedikit sing 27,68 wa VAI H5 mlah usap k rkan melalu ang dengan rena situs u ada itik adal
yu. (a) wi kan tipe 3 ka menunju ). Angka m kloaka akan) lebih (STD di P3 kloaka ui rute hasil utama lah di ilayah yang ukkan merah
Meskipun sesama tipe 2 yang memelihara itik dengan cara dikandangkan dan diangon, P3 memiliki luas wilayah angon yang lebih sempit dibandingkan P4 (Gambar 8). Hal ini menjadi alasan mengapa infeksi VAI H5 lebih tinggi pada P3 dibandingkan P4, mengingat wilayah yang sempit meningkatkan intensitas kontak antar itik dalam kandang. Temuan ini didukung oleh hasil penelitian yang melaporkan bahwa kepadatan populasi dapat meningkatkan prevalensi (Okazaki
et al. 2000; Munster et al. 2007; Wallensten et al. 2007).
Pada P4 yang wilayah angonnya lebih luas dibandingkan P3 (sesama tipe 2) dan berpotongan dengan P2 (tipe 1) di bulan yang sama dengan penemuan VAI H5 yaitu Maret, subtipe H5 lebih banyak ditemukan pada sampel usap orofaringeal itik non-sentinel yang baru dibeli dari peternak lain (sama seperti P2) (Gambar 8). Hal ini menimbulkan kecurigaan bahwa itik sentinel terpapar pada virus yang dibawa oleh itik baru dari tempat pembibitan meskipun perpotongan wilayah angon juga dapat berperan dalam meningkatkan kontak itik antar peternakan. Namun demikian, penularan yang terjadi tidak berlangsung intensif karena kerenggangan populasi (Hinshaw et al. 1985) sehingga prevalensi VAI H5 pada P4 lebih rendah dibandingkan P3. Keberadaan VAI H5 pada itik angon dalam penelitian ini menunjukkan indikasi bahwa populasi itik angon berperan penting sebagai reservoir dan pembawa VAI H5 yang efektif serta berpotensi mempertahankan keberadaan dan menyebarkan virus ke lingkungan maupun unggas lain yang rentan.
