Lampiran 1. Alur Kerja Penelitian
Isolasi bakteri keratinolitik dari limbah bulu ayam
Pengukuran Indeks Keratinolitik
Penentuan Isolat Terpilih
Penentuan waktu produksi enzim keratinase selama 8 hari
Pengukuran aktivitas dan kadar protein enzim kasar
Presipitasi enzim keratinase dengan konsentrasi amonium
sulfat secara bertingkat
Pengukuran aktivitas dan kadar protein enzim keratinase dengan konsentrasi amonium sulfat secara
bertingkat
Dialisis
Penentuan suhu dan pH optimum
Identifikasi isolat terpilih berdasarkan gen penyandi 16S rRNA
Pengukuran aktivitas dan kadar protein enzim keratinase hasil
Lampiran 2. Uji Aktivitas Enzim Keratinase
Pereaksi Blanko (ml) Sampel (ml)
Larutan penyangga Fosfat 0,5 0,5
Enzim 0,5 0,5
TCA 1 -
Substrat 0,5 0,5
Diinkubasi pada suhu 31 oC selama 15 menit
Ditambahkan 1 ml TCA pada sampel
Disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 30 menit
Rumus :
Aktivitas enzim (U/ml) = (nilai absorbansi sampel – nilai absorbansi kontrol/blanko) : 0,01
Aktivitas spesifik (U/mg) = aktivitas enzim (U/ml) total protein (mg/ml)
Hasil (%) = aktivitas enzim n aktivitas enzim 0
Tingkat kemurnian (kali) = aktivitas spesifik n aktivitas spesifik 0
Lampiran 3. Kurva Standar Bovine Serum Albumin (BSA)
Konsentrasi BSA (mg/ml)
Absorbansi (595 nm)
Lampiran 4. Uji Kadar Protein
Pereaksi Blanko (ml) Sampel (ml)
Akuades 0,5 0
Enzim 0 0,5
Reagen Bradford 0,75 0,75
Dilakukan pengadukan dengan vorteks
Diukur absorbansinya pada λ 595 nm
Lampiran 5. Komposisi Reagen Bradford dan Pembuatan Reagen Bradford
A. Larutan Stok Bradford
Comassie Blue G-250 70 mg
Etanol 95% 20 ml
Asam Fosfat 85% 40 ml
Dihomogenkan dengan magnetic stirer
Disaring dengan kertas saring
B. Pembuatan Reagen Bradford
Akuades 425 ml
Etanol 95% 20 ml
Asam Fosfat 85% 40 ml
Larutan Stok 30 ml
Dihomogenkan dengan magnetic stirer
Lampiran 6. Nilai Absorbansi Kadar Protein
1. Kadar Protein Pada Enzim Kasar
No Kode Isolat Absorbansi Kadar Protein (mg/ml)
1 A4 2,30255 55,408
2 B6 2,76920 66,790
3 B4 2,17000 52,175
2. Kadar Protein Pada Penambahan Amonium Sulfat Bertingkat
Konsentrasi Amonium
Sulfat
A4 B6 B4
Absorbansi Kadar
Protein Absorbansi
Kadar
Protein Absorbansi
Kadar
3. Kadar Protein Setelah Dialisis
No Kode Isolat Absorbansi Kadar Protein (mg/ml)
1 A4 0,917 21,642
2 B6 0,873 20,542
Lampiran 7. Identifikasi Isolat Bakteri Keratinolitik
a. Hasil Elektroforesis
b. Hasil Sekuensing Isolat Berdasarkan Gen Penyandi 16S rRNA
Isolat Nomor AC Mendekati gen dari Dengan kecocokan
Dari total
Homologi (%) A4 KJ806377.1 Leclercia adecarboxylata
strain M-X17B
1072 1100 97
B4 KF494187.1 Azotobacter chroococcum
strain ABA-1
513 602 85
B6 KJ719248.1 Stenotrophomonas maltophilia strain BIW
408 425 96
