CENDAWAN ENDOFIT TEKNIK ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN POTENSI PEMANFAATAN CENDAWAN ENDOFIT DALAM BUDIDAYA TANAMAN

(1)

(2)

CENDAWAN ENDOFIT

TEKNIK ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN POTENSI PEMANFAATAN CENDAWAN

ENDOFIT DALAM BUDIDAYA TANAMAN

(3)

Sanksi Pelanggaran Pasa 113

UU No. 28 Tahun 2014 tentang Hak Cipta Ketentuan Pidana

Pasal 113

(1) Setiap Orang yang dengan tanpa hak melakukan pelanggaran hak ekonomi sebagaimana dimaksud dalam Pasal 9 ayat (1) huruf i untuk Penggunaan Secara Komersial dipidana dengan pidana penjara paling lama 1 (satu) tahun dan/atau pidana denda paling banyak Rp lOO.OOO.OOO (seratus juta rupiah).

(2) Setiap Orang yang dengan tanpa hak dan/atau tanpa izin Pencipta atau pemegang Hak Cipta melakukan pelanggaran hak ekonomi Pencipta sebagaimana dimaksud dalam Pasal 9 ayat (1) huruf c, huruf d, huruf f, dan/

atau huruf h untuk Penggunaan Secara Komersial dipidana dengan pidana penjara paling lama 3 (tiga) tahun dan/atau pidana denda paling banyak Rp 500.000.000,00 (lima ratus juta rupiah).

(3) Setiap Orang yang dengan tanpa hak dan/atau tanpa izin Pencipta atau pemegang Hak Cipta melakukan pelanggaran hak ekonomi Pencipta sebagaimana dimaksud dalam Pasal 9 ayat (1) huruf a, huruf b, huruf e, dan/atau huruf g untuk Penggunaan Secara Komersial dipidana dengan pidana penjara paling lama 4 (empat) tahun dan/atau pidana denda paling banyak Rp l.OOO.

OOO.OOO,OO (satu miliar rupiah).

(4) Setiap Orang yang memenuhi unsur sebagaimana dimaksud pada ayat (3) yang dilakukan dalam bentuk pembajakan, dipidana dengan pidana penjara paling lama 10 (sepuluh) tahun dan/atau pidana denda paling banyak Rp 4.000.000.000,00 (empat miliar rupiah).

(4)

Diterbitkan oleh:

CENDAWAN ENDOFIT

TEKNIK ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN POTENSI PEMANFAATAN CENDAWAN

ENDOFIT DALAM BUDIDAYA TANAMAN

Dr. Syamsia, S.P., M. Si Dr. Ir. Abubakar Idhan, M.P.

Dr. Amanda Patappari Firmansyah, S.P., M.P.

Noerfiryani, S.P., M. Si

(5)

iv

TEKNIK ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN POTENSI PEMANFAATAN CENDAWAN ENDOFIT DALAM BUDIDAYA TANAMAN

Penulis:

Dr. Syamsia,S.P.,M. Si Dr. lr. Abubakar ldhan,M.P.

Dr. Amanda Patappari Firmansyah,S.P.,M.P.

Noerfiryani,S.P.,M. Si

Cetakan Pertama: 2021 Ukuran: 15x23 cm, x + 188 ISBN: 978-623-7349-40-2

Editor:

Dr. lradhatullah Rahim,S.P.,M.P.

Penyuting:

Ma'ruf

Desain Sampuldan Tata Letak REESLITERA

Jl. Antang Raya No.99A, Makassar- Sulawesi Selatan Kontak!WA: 082191865019-085342101139

Penerbit:

LPP UNISMUH MAKASSAR Anggota IKAPI

No. 021/Anggota Luar Biasa/SSL/2019

Hak cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang memperbanyak karya tulis ini dalam bentuk dan dengan cara apapun tanpa ijin dari penerbit.

(6)

PRAKATA

Syukur Alhamdulillah, penulisan buku ajar ini dapat dirampungkan. Buku ajar ini merupakan hasil riset penulis yang terkait dengan cendawan endofit sejak tahun 2014 sampai sekarang. Buku ajar ini membahas tentang: pengertian dan manfaat cendawan endofit, peralatan dan bahan untuk isolasi cendawan, isolasi dan identifikasi cendawan, media pertumbuhan dan penyimpanan, serta manfaat cendawan endofit pada pertumbuhan tanaman.

Buku ajar ini diperuntukkan bagi mahasiswa Program Studi Agroteknologi khususnya yang memprogramkan mata kuliah Mikrobiologi, Pengantar Bioteknologi dan Bioteknologi Pertanian serta mata kuliah yang berkaitan dengan pemanfaatan mikroba dalam budidaya tanaman.

Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Kementerian Riset dan Teknologi Badan Riset dan Inovsi Nasional (RISTEK- BRIN) telah mendanai kegiatan hibah penelitian skema Hibah Penelitian Disertasi (2014), Penelitian Produk Terapan (2015- 2017), Penelitian Dasar Unggulan Perguruan Tinggi (2018-2020).

Penulis menyadari buku ajar ini masih banyak kekurangan.

Oleh karena itu, penulis senantiasa menerima kritik dan saran yang sifatnya konstruktif demi penyempurnaan buku ini.

Makassar, 18 Februari 2021

Tim Penulis

(7)

DAFTAR ISI

v vi viii

ix 1 1 2 4 4 8 8 11 14 14 18 18 19 27 27 31 31 32 37 38 PRAKATA

DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR

BAB I PENDAHULUAN ...

1.1 Pengertian Cendawan Endofit ...

1.2 Manfaat Cendawan Endofit ...

Rangkuman ...

Tes Formatif ...

BAB II PERALATAN ISOLASI DAN PENGUJIAN CENDAWAN ENDOFIT ...

2.1 Peralatan ...

2.2 Bahan ...

Rangkuman ...

Tes Formatif ...

BAB III MEDIUM ISOLASI, PERTUMBUHAN DAN PENYIMPANAN CENDAWAN ENDOFIT ...

3.1 Komponen Medium ...

3.2 Jenis Medium ...

Rangkuman ...

Tes Formatif ...

BAB IV ISOLASI DAN PEMURNIAN CENDAWAN ENDOFIT ...

4.1 Persiapan Sampel ...

4.2 Sterilisasi Permukaan ...

Rangkuman ...

Tes Formatif ...

(8)

42 42 48 56 57 60 60 60 65 65 69 69 80 83 84 88 90 108 179 182 185 BAB V IDENTIFIKASI CENDAWAN ENDOFIT ...

5.1 Identifikasi Morfologi ...

5.2 Identifikasi Molekuler ...

Rangkuman ...

Tes Formatif ...

BAB VI METODE PENYIMPANAN CENDAWAN ENDOFIT ...

6.1 Penyimpanan Cendawan Endofit ...

6.2 Metode Penyimpanan Cendawan Endofit ...

Rangkuman ...

Tes Formatif ...

BAB VII MANFAAT CENDAWAN ENDOFIT ...

7.1 Manfaat Langsung ...

7.2 Manfaat Tidak Langsung ...

Rangkuman ...

Tes Formatif ...

BAB VIII PENUTUP ...

DAFTAR PUSTAKA ...

LAMPIRAN-LAMPIRAN ...

GLOSSARY ...

INDEKS ...

BIODATA PENULIS ...

(9)

Daftar Primer yang umum digunakan untuk Barkoding Cendawan

Volume Reaksi untuk Amplifikasi PCR

Tingkat kemiripan Isolat Cendwan endofit asal tanaman Padi Lokal Sulawesi Selatan pada analisis BLASTN Tingkat Kemiripan isolat cendawan endofit asal tanaman cabai berdasarkan pada analisis BLASTN Absorbansi dan konsentrasi IAA dari isolat cendawan endofit

Kemampuan melarutkan fosfat dari isolat cendawan endofit

Tabel 1.

Tabel 2.

Tabel 3.

Tabel 4.

Tabel 5.

Tabel 6.

DAFTAR TABEL

(10)

Gambar 1.

Gambar 2.

Gambar 3.

Gambar 4.

Gambar 5.

Gambar 6.

Gambar 7.

Gambar 8.

Gambar 9.

Gambar 10.

Gambar 11.

Gambar 12.

Gambar 13.

Gambar 14.

Gambar 15.

Gambar 16.

Gambar 17.

Timbangan digital kapasitas 200 g (a), 250 g (b), 5 kg (c)

Autoklaf dengan sumber energi kompor Laminar air flow buatan pabrik (a) dan Lab (b) Botol schott (a), gelas ukur (b), spatula (c) dan jarum Ose lurus (d)

Bahan PDA sintetik Bahan Ekstrak Kentang

Proses pembuatan media PDA alami: kentang dipotong kecil (a), dimasak (b), ekstrak disaring ditambah dekstrose, agar-agar, aquades (c), dimasak (d), dipidah ke erlenmenyer (e), disterilisasi dengan autoklaf (f), dituang ke cawan petri (g)

Sampel tanaman dari lokasi (kiri), bagian daun, batang dan akar sampel tanaman padi (kanan) Alur Sterilisasi Permukaan

Cendawan yang tumbuh pada permukaan batang, daun, dan akar (kiri), cendawan setelah dipindahkan ke medium PDA (kanan)

Isolat cendawan endofit setelah permurnian Isolasi cendawan endofit dari tanaman obat Cendawan endofit diisolasi dari tanaman cabai Cendawan berwarna putih

Warna koloni abu-abu

Warna kuning pada bagian tengah Warna Hitam dan hijau pinggir putih

DAFTAR GAMBAR

(11)

Gambar 18.

Gambar 19.

Gambar 20.

Gambar 21.

Gambar 22.

Gambar 23.

Gambar 24.

Gambar 25.

Gambar 26.

Gambar 27.

Gambar 28.

Gambar 29.

Gambar 30.

Gambar 31.

Tipe pertumbuhan konsentris

Makroskopis dan Mikroskopis Cendawan Endofit dari Padi Lokal Enrekang

Morfologi isolat cendawan endofit dari Annona squamosa

Cendawan endofit dari tanaman karet

Mikroskopis kapang endofitik (kiri) Phoma (kanan) Hasil amplifikasi DNA cendawan endofit asal tanaman cabai menggunakan pasangan primer ITS1/ITS4

Hasil amplifikasi PCR menggunakan pasangan primer NL1 dan NL4

Hasil amplifikasi PCR menggunakan pasangan primer ITS1/ITS4

Perubahan warna pink merupakan indikator kemampuan produksi IAA

Produksi Giberelin Cendawan endofit Skema representasi dari asam organik yang dapat diproduksi oleh Mikroba Pelarut Fosfat dan digunakan untuk melarutkan bentuk fosfat anorganik

Zona bening yang terbentuk disekitar koloni cendawan merupakan indikator kemampuan melarutkan fosfat

Perubahan warna supernata menjadi biru

Merupakan indikator kemamuan melarutkan fosfat Kemampuan produksi siderefor isolat cencawan endofit

(12)

BAB I PENDAHULUAN

1.1. Pengertian Cendawan Endofit

Sebelum membahas pengertian cendawan endofit, terlebih dahulu harus dipahami pengertian dari endofit. Istilah endofit berasal dari Bahasa Yunani yaitu endo yang artinya dalam dan phyte yang artinya tanaman. Jadi pengertian endofit adalah semua organisme yang selama suatu periode siklus hidupnya berada dalam jaringan tanaman inang (Patil et al. 2015). Beberapa ahli memberikan definisi yang hampir sama tentang endofit. Azevedo et al., (2000), menjelaskan bahwa semua mikroorganisme yang berada dalam jaringan tanaman selama satu periode siklus hidupnya dianggap sebagai endofit. Demikian pula dengan Hilarino et al., (2011) dan Afandhi et al., (2018), mendefinisikan endofit sebagai mikroorganisme yang berada dalam jaringan tanaman selama periode tertentu dari siklus hidupnya, tanpa menimbulkan kerusakan pada tanaman.

Hal ini berarti, mikoroba endofit dapat didefinisikan sebagai mikroba dari kelompok bakteri atau cendawan yang menghabiskan seluruh siklus hidupnya dalam jaringan tanaman

Setelah mempelajari bab ini, mahasiswa diharapkan mampu:

1. Menjelaskan pengertian cendawan endofit

2. Membedakan mikroba endofit dengan cendawan endofit 3. Menjelaskan manfaat cendawan endofit dalam bidang pertanian

(13)

tanpa menimbulkan gejala.

Pengertian cendawan endofit telah didefinisikan oleh beberapa ahli. Pengertian cendawan endofit menurut Durham, 2004; Wilia et al., 2011), cendawan endofit merupakan cendawan yang hidup dalam jaringan tanaman tanpa menunjukkan gejala.

Selanjutnya menurut Clay 1988; Ariyanto, Abadi, and Djauhari (2013), yang dimaksud cendawan endofit adalah cendawan yang terdapat di dalam sistem jaringan tumbuhan, seperti daun, bunga, ranting, ataupun akar tumbuhan. Jadi berdasarkan pengertian tersebut, maka cendawan endofit dapat didefinisikan sebagai cendawan yang hidup dalam jaringan tanaman inang tanpa menimbulkan kerusakan pada tanaman inang.

1.2 Manfaat Cendawan Endofit

Cendawan endofit memiliki peranan penting dalam kehidupan manusia seperti dalam bidang pertanian dan farmasi Menurut Gandjar, 1999; Hafsari and Asterina, (2013).

Peranan cendawan endofit dalam bidang pertanian diantaranya adalah sebagai pemacu pertumbuhan dan penghasil enzim. Menurut Sinaga, (2003); Ariyanto, Abadi and Djauhari, (2013), cendawan endofit ada yang berperan sebagai penghasil enzim seperti genus Aspergillus, Fusarium, dan Alternaria.

Sedangkan cendawan endofit dari kelompok Trichoderma sp.

dan Fusarium sp. dilaporkan oleh Amin et al., (1997) dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman tomat.

Yadav and Yadav, (2017), membagi manfaat cendawan endofit kedalam dua kelompok yaitu manfaat langsung dan tidak langsung terhadap tanaman.

a. Manfaat langsung, yaitu:

1. Produksi fitohormon (Fitohormon production)

(14)

2. Fiksasi Nitrogen (Nitrogen Fixation) 3. Pelarutan Fosfat (Phosphate solubilization) 4. Produksi siderophor (Siderophore production) b. Manfaat tidak langsung, berupa:

1. Bioremediasi (Bioremediation)

Bioremediasi merupakan metode untuk menghilangkan polutan dari lingkungan.

2. Fitoremediasi (Phytoremediation)

Endofit membantu fitoremediasi dengan meningkatkan pertumbuhan tanaman, menurunkan fitotoksisitas logam, dan mempengaruhi translokasi dan akumulasi logam 3. Biokontrol (Biocontrol)

Endofit memiliki berbagai mekanisme kontrol untuk menangkal pathogen dan hama tanaman.

4. Toleransi tanaman terhadap cekaman (Plant stress tolerance)

Secara alami tumbuhan menghadapi berbagai tekanan dan bereaksi dengan memodifikasi metabolismenya sehingga menjadi toleran terhadap cekaman.

Tanaman inang yang ditumbuhi mikroba endofit mendapatkan banyak manfaat, seperti mempercepat pertumbuhan, meningkatkan daya tahan terhadap kekeringan dan serangan hama. Menurut Sukmadi, (2013), keberadaan mikroba endofit pada tanaman membantu tanaman berkompetisi di alam.

Pemanfaatan cendawan dalam bidang pertanian sudah banyak dikembangkan diantaranya pemanfaatan Tricoderma untuk meningkatkan ketahanan tanaman terhadap cekaman kekeringan.

Demikian juga penggunaan cendawan dalam pengendalian hama dan penyakit. Manfaat endofit secara langsung dan tidak langsung akan dibahas lebih mendalam pada Bab VII.

(15)

Tes Formatif

1. Endofit berasal dari Bahasa Yunani yaitu endo yang artinya dalam dan pyte yang artinya…

A. hidup B. ilmu

Istilah endofit berasal dari Bahasa Yunani yaitu endo yang artinya dalam, dan phyte yang artinya tanaman. Jadi pengertian endofit adalah semua organisme yang selama suatu periode siklus hidupnya berada dalam jaringan tanaman

Manfaat cendawan endofit pada tanaman diantaranya adalah:

1. meningkatkan pertumbuhan vegetatif tanaman;

2. meningkatkan kemampuan tanaman untuk lebih toleran terhadap kekeringan;

3. menghasilkan toksin yang melindungi tanaman dari patogen

Manfaat cendawan endofit secara langsung pada tanaman adalah

1. Produksi fitohormon (Fitohormon production) 2. Fiksasi Nitrogen (Nitrogen Fixation)

3. Pelarutan Fosfat (Phosphate solubilization) 4. Produksi siderophore (Siderophore production)

Manfaat cendawan endofit secara tidak langsung pada tanaman:

1. Bioremediasi (Bioremediation) 2. Fitoremediasi (Phytoremediation) 3. Biokontrol (Biocontrol)

4. Mekanisme Biokontrol (Biocontrol mechanism) 5. Toleransi Tanaman terhadap cekaman (Plant stress

tolerance) Rangkuman

(16)

C. tanaman D. makanan

2. Pengertian cendawan endofit adalah … A. Mikroba yang hidup dalam tanaman

B. Cendawan yang hidup dalam jaringan tanaman C. Bakteri yang hidup dalam jaringan tanaman D. Mikroba yang hidup dalam akar tanaman

3. Manfaat cendawan endofit secara langsung pada tanaman adalah sebagai berikut, kecuali …

A. Produksi fitohormon B. Biokontrol

C. Pelarut fosfa D. Fiksasi Nitrogen

4. Manfaat cendawan endofit secara tidak langsung pada tanaman adalah

A. Fiksasi Nitrogen B. Produksi Siderefore C. Pelarut fosfat D. Bioremediasi

5. Manfaat cendawan endofit bagi tanaman menurut Moore- Landecker adalah sebagai berikut, kecuali…

A. Toleran terhadap kekeringan

B. Meningkatkan pertumbuhan tanaman C. Memproduksi toksin

D. Memproduksi siderefore 6. Bioremediasi adalah ….

A. Menambah polutan B. Menghilangkan polutan C. Mengikat polutan

D. Mengurai polutan

(17)

7. Endofit membantu fitoremediasi dengan cara berikut ini, kecuali…

A. Mengurangi polutan B. Meningkatkan pertumbuhan C. Menurunkan fitotoksisitas logam

D. Mempengaruhi translokasi dan akumulasi logam Kunci Jawaban

1. C 2. B 3. B 4. D 5. D 6. B 7. A

Tes Essay

1. Jelaskan perbedaan mikroba endofit dan cendawan endofit.

2. Jelaskan manfaat langsung dari cendawan endofit

3. Moore-Landecker membedakan manfaat cendawan endofit dalam 3 kelompok, tuliskan ketiga kelompok tersebut.

Umpan Balik dan Tindak Lanjut

Cocokkanlah jawaban Anda dengan kunci jawaban latihan yang terdapat pada bagian akhir unit ini. Hitunglah jawaban Anda yang benar. Gunakanlah rumus di bawah ini untuk mengetahui tingkat penguasaan Anda terhadap materi subunit 1.

(18)

Rumus:

Jumlah jawaban Anda yang benar

Tingkat penguasaan = --- x 100%

Jumlah soal Arti tingkat penguasaan yang Anda capai:

90 – 100% = baik sekali 80 – 89% = baik 70 – 79% = cukup < 70% = kurang

Bila Anda mencapai tingkat penguasaan 80% atau lebih, Anda dapat melanjutkan dengan unit selanjutnya. Selamat untuk Anda! Tetapi apabila tingkat penguasaan Anda masih di bawah 80%, Anda harus mempelajari kembali materi subunit 1 terutama bagian yang belum Anda kuasai.

(19)

2.1 Peralatan 1. Timbangan

Timbangan digunakan untuk mengetahui berat bahan yang akan digunakan dalam pembuatan medium seperti kentang, PDA, dekstrose, dan lain-lain. Jenis timbangan yang digunakan adalah timbangan digital. Kriteria timbangan yang dapat digunakan adalah: 1) timbangan analitik dengan kapasitas timbangan 200 g dan kemampuan membaca hingga 3 digit dibelakang koma atau 0,01 g (Gambar 1a); 2) timbangan dengan kapasitas 250 g dengan kemampuan membaca hingga 2 digit dibelakang koma atau 0,1 g (Gambar 1b); 3) timbangan dengan kapasitas 5 kg (Gambar 1c).

Gambar 1. Timbangan digital kapasitas 200 g (a), 250 g (b), 5 kg (c) (Dok.pribadi)

BAB II

PERALATAN DAN BAHAN ISOLASI CENDAWAN ENDOFIT

1. Menjelaskan peralatan dasar yang dibutuhkan dalam isolasi cendawan endofit

2. Menjelaskan bahan utama yang dibutuhkan dalam isolasi cendawan endofit

(20)

2. Autoklaf

Autoklat digunakan untuk sterilisasi dengan metode uap panas (Gambar 2). Autoklaf ada dua macam berdasarkan sumber energi yang digunakan yaitu: 1) autoklaf manual menggunakan sumber api kompor dan autoklaf otomatis menggunakan energi listrik. Kedua jenis autoklaf memiliki cara kerja yang sama dalam proses sterilisasi.

Gambar 2. Autoklaf dengan sumber energi kompor (Dokumen Pribadi)

Autoklaf dilengkapi dengan sarangan berupa panci yang terletak pada bagian dalam dari autoklaf sebagai tempat meletakkan bahan yang akan disterilisasi. Autoklaf diisi dengan air sampai batas tempat meletakkan sarangan. Sarangan diisi dengan bahan yang akan disterilkan. Kemudian tutup autoklaf diletakkan di bagian atas dan skrup diputar kencang sampai tidak bisa berputar lagi. Satu katup uap ditutup dan yang satu tetap dibiarkan terbuka. Autoklaf diletakkan diatas kompor yang sudah dinyalakan. Pada saat uap mulai keluar dari katup yang terbuka, katup tersebut ditutup agar suhu dan tekanan naik. Jika sudah mencapai tekanan 17, 5Psi atau suhu 121°C, api kompor

(21)

dikecilkan kemudian suhu dipertahankan selama 20-30 menit (Dwiyani 2015).

3. Laminar air flow

Laminar air flow merupakan salah satu alat utama dalam isolasi cendawan dan perbanyakan cendawan (Gambar 3). Semua kegiatan isolasi dan perbanyakan dilakukan di laminar air flow ini. Laminar air flow dilengkapi dengan lampu ultra violet (UV) yang dapat membunuh mikroorganisme. Selain itu terdapat lampu yang berfungsi sebagai penerang. Sebelum Laminar air flow digunakan, lampu UV dinyalakan selama 30 menit. Setelah itu, air flow dinyalakan untuk mendapatkan hembusan udara steril yang telah disaring oleh filter yang terdapat pada bagian atas dan bagian dalam laminar. Laminar siap digunakan.

Laminar yang telah selesai digunakan, segera dikosongkan dari bahan dan peralatan yang telah digunakan. Laminar kemudian disemprot dengan alkohol untuk mematikan sisa-sisa mikroba yang ada. Setelah disemprot kemudian dilap dengan tissue.

Gambar 3. Laminar air flow buatan pabrik (a) dan lab (b) (Dokumen pribadi)

4. Glassware dan Peralatan kecil lainnya

Glassware adalah peralatan kecil yang terbuat dari bahan

(22)

gelas seperti, botol schott, gelas ukur, cawan petri, objek glass, erlenmeyer dan lain-lain (Gambar 4).

Gambar 4. Botos schott (a), gelas ukur (b), spatula (c) dan jarum Ose lurus (d) (Dokumen Pribadi)

Peralatan kecil lainnya terdiri dari spatula, pinset, ose, dan lain lain yang terbuat dari bahan logam (stainless steel) (Gambar 4). Spatula merupakan pengaduk atau digunakan untuk mengambil bahan berupa serbuk. Pinset digunakan untuk menjepit sampel tanaman saat sterilisasi permukaan. Ose gunanya untuk mengambil misellum cendawan dan meletakkannya pada medium pertumbuhan.

2.2 Bahan

1. Potato Dextrose Agar

Potato Dextrose Agar (PDA) merupakan bahan sintetik untuk pembuatan medium PDA yang akan digunakan untuk isolasi dan perbanyakan cendawan. PDA dijual dalam bentuk serbuk (Gambar 5a). Harganya lumayan mahal, namun dapat diganti dengan membuat ekstrak dari kentang (Gambar. 5b)

(23)

Gambar 5. Bahan PDA sintetik (Dokumen pribadi)

Kelemahan penggunaan medium PDA sintetik adalah harganya cukup mahal, hal ini dapat diatasi dengan menggunakan bahan alami berupa ekstrak kentang yang diperoleh dari kentang segar.

Gambar 6. Bahan Ekstrak Kentang (Dokumen pribadi)

(24)

3. Dekstrose

Dektrose atau glukosa adalah sejenis gula termasuk monosakarida dengan rumurs molekul C6H12O6, banyak digunakan dalam industry permen, ice cream, sirup serta parbir-pabrik farmasi (Dwiyani 2015). Gula juga digunakan dalam pembuatan media untuk kultur jaringan sebagai sumber karbohidra untuk respirasi karena tanaman kultur bersifat heterotrof. Penambahan dekstrose pada pembuatan media untuk pertumbuhan mikroba teruma cendawan berfungsi sebagai sumber (Suryani, Santoso, and Juffrie 2010)energi bagi cendawan.

4. Agar-Agar

Agar-agar terbuat dari ekstrak rumput laut dengan karakteristik memiliki daya ikat terhadap air dan memadat membetuk gel(Suryani, Santoso, and Juffrie 2010). Fungsi agar-agar pada pembuatan medium padat adalah sebagai bahan pemadat medium. Oleh karena itu pada pembuatan medium cair tidak dilakukan penambahan agar-agar.

5. Aquades

Aguades adalah air hasil destilasi/penyulingan yang sama dengan air murni atau H₂O, karena H₂O hampir tidak mengandung mineral (Suryani, Santoso, and Juffrie 2010).

(25)

Tes Formatif

1. Salah satu alat yang dibutuhkan dalam isolasi cendawan adalah autoklaf. Fungsi autoklaf adalah....

a. menimbang b. sterilisasi

c. mengambil bahan d. menjepit bahan

2. Laminar air flow memiliki dua jenis lampu. Salah satunya adalah lampu UV, yang berfungsi untuk….

a. penerangan

b. membunuh mikroorganisme c. pemanasan

d. penguraian

3. Laminar air flow memiliki dua jenis lampu. Salah satunya adalah lampu neon yang berfungsi …

Rangkuman

Peralatan yang dibutuhkan untuk isolasi cendawan endofit diataranya adalah: 1) timbangan; 2) autoklaf; 3) laminar air flow; 4) Glassware.

Timbangan digunakan untuk mengukur bahan yang akan digunakan. Autoklaf untuk sterilisasi bahan dan peralatan. Laminar air flow adalah alat untuk semua kegiatan mulai dari membuat medium, isolasi, dan perbanyakan cendawan endofit. Glassware adalah peralatan kecil yang terbuat dari bahan gelas seperti botol schott, gelas ukur, erlenmeyer, cawan petri. Peralatan kecil seperti: spatula, pinset dan jarum ose.

Bahan yang dibutuhkan untuk medium isolasi cendawan adalah: 1) Potato Dextrose Agar; 2) kentang; 3) dekstrose; 4) agar-agar; 5) aquades.

(26)

a. penerangan b. sterilisasi c. pemanasan d. penguraian

4. Berikut ini adalah bahan untuk pembuatan media PDA alami, kecuali …

a. Aquades b. Alkohol c. Agar-agar d. Kentang

5. Potato Dekstrose Agar dapat dibuat dari … a. Ekstrak tebu

b. Ekstrak kentang c. Ekstrak wortel d. Eksrak kurma

6. Glassware adalah peralatan yang terbuat dari…

a. stainless steel b. kertas

c. gelas d. tanah liat

7. Berikut ini termasuk Glassware, kecuali…

a. Erlenmeyer b. Spatula c. Gelas ukur d. Botos schott

8. Alat yang digunakan untuk menakar bahan yang akan digunakan adalah…

a. Autoklaf b. Spatula c. Gelas ukur

(27)

d. Timbangan

9. Laminar air flow mempunyai dua buah saringan yang berada di bagian atas dan dalam laminar yang berfungsi untuk …

a. membunuh mikoroorganisme b. menerangi laminar

c. mengalirkan udara steril ke dalam laminar d. memanaskan laminar

10. Berikut ini peralatan yang terbuat dari bahan stainless steel, kecuali…

a. Pinset b. Spatula c. Gelas ukur d. Ose

Kunci Jawaban 1. b

2. b 3. a 4. b 5. b 6. c 7. b 8. d 9. c 10. c

Cocokkanlah jawaban Anda dengan kunci jawaban latihan yang terdapat pada bagian akhir unit ini. Hitunglah jawaban Anda yang benar. Gunakanlah rumus di bawah ini untuk mengetahui

(28)

tingkat penguasaan Anda terhadap materi subunit 2.

Rumus:

91 – 100% = baik sekali 81 – 89% = baik 71 – 79% = cukup < 70% = kurang

(29)

3.1 Komponen Medium

Medium merupakan suatu bahan yang terdiri atas campuran zat makanan yang berfungsi sebagai tempat tumbuh mikroba (Octavia and Wantini 2017).

Persyaratan medium untuk pertumbuhan cendawan endofit pada dasarnya sama dengan persyaratan untuk pertumbuhan mikroba antara lain: pH media harus sesuai, steril dan tidak mengandung zat-zat penghambat serta mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan mikroorganisme (Jutono, 1980;(Octavia and Wantini 2017). Medium Potato Dextrose Agar (PDA) cocok dan mendukung pertumbuhan cendawan dan memiliki pH 4.5 sampai 5.5 sehingga menghambat pertumbuhan bakteri yang membutuhkan pH netral (Cappucino & Sherman, 2014;

(Jamilatun, Azzahra, and Aminah 2020).

Mikroorganisme termasuk cendawan membutuhkan nutrisi untuk pertumbuhan. Menurut Cappuino, 2014; (Octavia and Wantini 2017), nutrisi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroorganisme meliputi: karbon, nitrogen, unsur non logam

BAB III

MEDIUM ISOLASI DAN PERTUMBUHAN CENDAWAN ENDOFIT

1. Menjelaskan pengertian medium dan komposisi medium 2. Menjelaskan jenis medium dan peruntukannya

(30)

seperti sulfur dan fosfor, unsur logam seperti Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg dan Fe, vitamin, air dan energi.

3.2 Jenis Medium

Medium berdasarkan bahan penyusunnya dibedakan atas:

1. Potato Dextrose Agar (PDA)

Komposisi medium PDA instan yang dibuat oleh pabrik atau perusahaan dalam bentuk bahan siap pakai mengandung ekstrak kentang, dextrose dan agar. Kentang mengandung karbohidrat, vitamin, dan mikronutrien lain yang dapat dimanfaatkan oleh cendawan, dextrose sebagai sumber gula dan energi dan agar sebagai bahan pemadat (Octavia and Wantini 2017).

Pembuatan Medium PDA

Bahan dan cara pembuatan medium PDA menggunakan bahan PDA sintetik dijelaskan oleh (Jamilatun, Azzahra, and Aminah 2020), sebagai berikut:

a. Medium PDA instan Bahan:

• PDA : 39 GR

• Aquades : 1000 ml Cara membuat:

1. Menimbang bahan PDA sintetik dan memasukkannya ke dalam Erlenmeyer

2. Menambahkan aquades dan mengaduk hingga bahan tercampur

3. Memanaskan bahan hingga mendidih dan homogen 4. Mengukur pH (4.5-5.5), jika pH media kurang asam,

menambahkan asam tartat 10%

5. Menutup erlenmeyer dengan kapas, kasa dan kerta kopi

(31)

6. Mensterilkan bahan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 dengan tekanan 2 atm

7. Menambahkan kloramfenikol 20 mL secara aseptis di dalam laminar air flow.

8. Menuang bahan ke dalam cawan petri dan biarkan memadat

9. Medium PDA siap digunakan b. Medium PDA alami

Bahan untuk pembuatan medium PDA alami adalah:

1. Kentang : 200 g 2. Dextrose :20 g 3. Agar : 20 g 4. Aquades : 1 L

Cara pembuatan medium PDA alami sebagaimana dijelaskan oleh Gunawan et.al., 2006; Budiprakoso, 2010, sebagai berikut:

1. Kentang dikupas sampai bersih dan dicuci kemudian dipotong-potong dengan ukuran 2 cm x 2 cm ( Gambar 7a)

2. Potongan kentang dan air suling (aquades) dimasak (Gambar 7b), setelah setengah jam diangkat dan disaring untuk diambil ekstraknya (Gambar 7c)

3. Ekstrak kentang tersebut kemudian dimasak kembali dan ditambahkan agar-agar dan dekstrose (Gambar 7d) 4. Setelah mendidih, campuran tersebut kemudian diangkat

dan dituangkan ke dalam erlemeyer/botol schott (Gambar 7e). Kemudian PDA tersebut dimasukkan ke dalam autoklaf untuk disterilisasi dengan menggunakan uap air jenuh bertekanan 15 lb/in 2 selama 15 menit pada suhu 121oC (Gambar 7f)

(32)

5. Setelah uap dalam autoklap hilang, agar-agar dituang ke cawan petri dan ditutup dengan plastik wrap dan dibiarkan hingga dingin dan mengeras dalam laminar air flow (Gambar 7g).

6. Media yang sudah dingin dan padat siap disimpan dalam tempat penyimpanan. Setiap hari diperiksa. Jika ada medium yang kontaminasi, segara dipisahkan. Media yang tidak kontaminasi dapat digunakan untuk isolasi cendawan endofit.

2. Carrot Sukrose Agar (CSA)

Bahan dan cara membuat medium CSA sebagaimana dijelaskan oleh (Jamilatun, Azzahra, and Aminah 2020), adalah sebagai berikut:

Gambar 7. Proses pembuatan media PDA alami: kentang dipotong kecil (a), dimasak (b), ekstrak disaring ditambah dekstrose, agar-agar, aquades (c), dimasak (d), dipidah ke erlenmenyer (e), disterilisasi dengan autoklaf (f), dituang ke

cawan petri (g). (Dokumen pribadi)

(33)

Bahan:

• wortel : 200 g

• Sukrose : 20 g

• Agar : 15 g

• Aquades : 1500 mL Cara membuat:

1. Mencuci wortel dengan dengan air bersih

2. Memotong wortel menjadi bentuk dadu dengan ukuran sisi lebih kurang 0.5 cm

3. Mencuci potongan wortel dengan aquades

4. Menghaluskan wortel dengan menggunakan mortar tanpa diberi air

5. Masukkan wotel yang telah halus ke dalam erlenmeyer 6. Menambahkan aquades 500 mL

7. Memanaskan wortel sampai mendidik 8. Menyaring rebusan wortel

9. Menambahkan sukrose dan agar-agar

10. Menambahkan aquades hingga volume 1000 mL 11. Memanaskan hingga mendidih dan homogen 12. Mengukur pH medium

13. Mensterilkan medium dengan autoclave 14. Menambahkan kloramfenikol

15. Menuang ke dalam cawang petri dalam kondisi aseptis dalam laminar air flow

16. Media siap digunakan setelah dingin dan memadat 3. Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC)

Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC) adalah media yang dikembangkan oleh King et al. (1979) (Idriati, Priyanto, and Triwibowo 2010) dan merupakan modifikasi dari

(34)

Rose bengal chloramphenicol (RBC) Agar dari Javis (1973).

Perbedaan dengan RBC, media DRBC mengandung dichloran (0.002 g/L) dan rose Bengal konsentrasi 0.025 g/L (Idriati, Priyanto, and Triwibowo 2010).

Bahan dan cara pembuatan medium Carboxymethylcellulose agar (CMC), Glucose Ammonium Nitrate Agar (GAN), Malt Extract Agar (MEA, Media Czapex Agar (CZA), Oat meal Agar (OA), Miru atau low carbon agar (LCA), Miru atau low carbon agar (LCA) dijelaskan dalam Handbook of Industrial Mycology, Volume 22, Tahun 2005, sebagai berikut:

3. Carboxymethylcellulose agar (CMC) Bahan:

• CMC : 2 g

• MgSO4.7H2O : 0.05 g

• Na2HP4 : 0,5 g

• NaCl : 0,23 g

• Yeast : 0,2 g

• congo red : 0.5%

• Aguadest : 100 mL

4. Glucose Ammonium Nitrate Agar (GAN) Bahan:

• Glukose : 10 g

• NH4NO3 : 1 g

• KH2PO4 : 1 g

• MgSO4.7H2O : 0.5 g

• Rose Bengal : 0.03 g

• Agar : 20 g

• Aguades : 1000 mL

(35)

5. Malt Extract Agar (MEA) Bahan:

• Malt extract : 20 g

• Agar : 20 g

• Air : 1000 mL

6. Czapex Agar (CZA) Bahan:

• Sukrose : 30 g

• NaNO3 : 2 g 7. Oat meal Agar (OA)

Bahan:

• Rolled oats : 30 G

• Agar : 20 g

• Air : 1000 mL

• MgSO4.7H2O : 0.5 g

• KCl : 0.5 g

• FeSO4.7H2O : 0.01 g

• FeSO4.7H2O : 0.001 g

• Agar : 15 g

• Aguades : 1000 mL 8. Miru atau low carbon agar (LCA)

Bahan:

• Glukose : 1 g

• KH2PO4 : 1 g

• MgSO4.7H2O : 0.2 g

• KCl : 0.2 g

• NaNO3 : 2 g

(36)

• Yeast extract : 0.2 g

• Agar : 15 g

• Aquades : 1000 mL 9. Cornmeal Agar (CMA)

Bahan:

• Yellow cornmeal : 40 g

• Agar : 15-20 g

• Aquades : 1000 mL

Medium berdasarkan tujuan penggunaannya oleh (Ilyas.

2007) sebagai berikut:

1. medium untuk isolasi 2. medium untuk identifikasi;

3. medium untuk penyimpanan

Penjelasan masing jenis medium adalah sebagai berikut:

1. Medium untuk Isolasi Cendawan

Medium untuk isolasi cendawan berfungsi meransang pertumbuhan hifa dan perkecambahan spora. Medium tersebut hanya mengandung sedikit nutrient dan biasanya dijual bebas, contoh : Dichloran Rose Gengal Chloramphenicol Agar (DRBC), dan Glucose Ammonium Nitrate Agar (GAN), Water Agar (WA), miura atau low carbon agar ( LCA).

2. Medium untuk identifikasi

Medium untuk identifikasi yang umum digunakan adalah Potato Dextrose Agar (PDA), Malt Extract Agar (MEA), Miura Agar/Low Carbon Agar (LCA), Czapex Agar (CZA), dan Oat meal Agar (OA).

(37)

3. Medium untuk penyimpanan

Medium untuk penyimpanan digunakan menyimpan isolat selama mungkin, dengan tujuan agar tingkat viabilitas cendawan tetap terjaga selama penyimpanan. Medium yang umum digunakan adalah Carboxymethyl cellulose agar (CMC), Cornmeal Agar (CMA) dan Potato Carrot Agar (PCA).

Medium berdasarkan bentuknya ada dua yaitu:

Medium PDA dan PDB terbuat dari bahan yang sama, hanya saja pada pembuatan medium PDB tidak digunakan agar- agar sehingga medium PDB berbentuk cair.

a.

b.

Medium Padat, berbentuk padat dan menggunakan agar-agar sebagai bahan pemadat, contoh medium padat adalah PDA Medium Cair, berbentuk cait dan dalam pembuatannya tidak menggunakan agar-agar, contoh medium cair adalah PDB

(38)

Tes Formatif

1. Suatu bahan yang teridri atas campuran zat makanan yang berfungsi sebagai tempat tumbuh mikroba merupakan pengertian dari …

a. menimbang b. sterilisasi

c. mengambil bahan d. medium

Rangkuman

Medium merupakan bahan yang teridiri atas campuran zat makanan yang berfungsi sebagai tempat tumbuh mikroba sehingga harus memenuhi beberapa persyaratan diantaranya adalah pH media harus sesuai, steril dan tidak mengandung zat-zat penghambat serta mengandung nutrisi yang dibutuhkan mikroba.

Nutrisi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikoror- ganisme meliputi: karbon, nitrogen, unsur non logam dan logam, vitamin, air dan energi.

Jenis medium berdasarkan bahan penyusunnya dibedakan atas: Potato Dextrose Agar (PDA), Carboxymethylcellu- lose agar (CMC), Glucose Ammonium Nitrate Agar (GAN), Malt Extract Agar (MEA), Czapex Agar (CZA), Oat Meal Agar (OA), Miru atau Low Carbon Agar (LCA) dan Cornmeal Agar (CMA).

Medium berdasarkan peruntukannya dibedakan atas:

medium untuk isolasi, medium untuk identifikasi dan medium untuk penyimpanan.

Medium yang digunakan untuk isolasi adalah DRBC, GAN, WA, LCA, medium untuk identifikasi adalah PDA, MEA, LCA, CZA dan OA, sedangkan medium untuk penyimpanan adalah CMC, CMA dan PCA.

(39)

2. Medium untuk pertumbuhan mikroba harus memenuhi syarat sebagai berikut, kecuali …

a. steril b. pH sesuai

c. mengandung nutrisi

d. mengandung zat penghambat

3. Nutrisi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroorganisme adalah sebagai berikut, kecuali…

a. Vitamin b. Air c. Lemak d. Karbon

4. Berikut ini adalah bahan untuk pembuatan media PDA alami, kecuali …

a. Aquades b. Alkohol c. Agar-agar d. Kentang

5. Potato Dekstrose Agar dapat dibuat dari … a. Ekstrak tebu

b. Ekstrak kentang c. Ekstrak wortel d. Eksrak kurma

6. Medium yang merupakan modifikasi dari RBC adalah…

a. DRBC b. GAN c. MEA d. LCA

7. Medium yang dapat digunakan untuk identifikasi cendawan endofit adalah

(40)

a. PCA b. MEA c. CM d. WA

8. Medium yang dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi adalah…

a. Potato Carrot Agar b. Low Carbon Agar c. Malt Extract Agar d. Oat Meal Agar

9. Medium PDA digunakan untuk … a. isolasi

b. identifikasi c. penyimpanan

d. isolasi dan identifikasi

10. Medium yang bahannya mengadung wortel adalah…

a. PCA b. PDA c. MEA d. LCA

Kunci Jawaban 1. d

2. d 3. c 4. b 5. b 6. a 7. b

(41)

8. b 9. b 10.a

Rumus:

92 – 100% = baik sekali 82 – 89% = baik 72 – 79% = cukup

< 70% = kurang

(42)

4. 1 Persiapan Sampel

Cendawan dapat diisolasi dari daerah disekitar perakaran tanaman (rhizosfir), daun (filosfir) dan jaringan tanaman (endofit).

Isolasi cendawan endofit dilakukan pada jaringan tanaman sehat dan diambil dari bagian daun, akar, dan batang.

Cendawan endofit paling banyak ditemukan pada akar, dibandingkan bagian batang dan cabang. Hal ini disebabkan karena jaringan akar tanaman secara morfologi, fisik, dan kimia menyediakan habitat bagi beragam komunitas mikroorganisme, termasuk bagi cendawan endofit (Ramdan et al. 2014).

Sebelum melakukan isolasi cendawan pada jaringan tanaman perlu dilakukan persipan sampel tanaman. Sampel tanaman yang diambil dari lokasi pertanaman disimpan dalam kantong platik dan diberi label nama tanaman, tanggal dan lokasi pengambilan sampel.

Sampel tanaman dibersihkan dari sisa-sisa tanah yang melekat dengan mencuci sampel tanaman di bawah air mengalir sehingga sisa tanah dan debu yang menempel pada tanaman ikut

BAB IV

ISOLASI DAN PEMURNIAN CENDAWAN ENDOFIT

1. Menjelaskan teknik persiapan sampel tanaman 2. Menjelaskan teknik sterilisasi permukaan

3. Menjelaskan teknik isolasi dan permurnian isolate cendawan endofit

(43)

terbuang.

Sampel tanaman yang telah bersih dikering anginkan untuk menghilangkan sisa air yang melekat pada bagian tanaman.

Selanjutnya sampel dipisahkan berdasarkan bagian-bagiannya yaitu akar, batang dan daun sebelum dilakukan sterilisasi permukaan.

Gambar 8. Sampel tanaman dari lokasi (kiri), bagian daun, batang dan akar sampel padi (kanan) (dokumen pribadi) 4. 2 Sterilisasi Permukaan

Sterilisasi permukaan merupakan tahap awal dalam kegiatan isolasi cendawan dengan tujuan untuk membersikan permukaan tanaman dari mikroba dan memastikan cendawan yang diisolasi berasal bagian dalam jaringan tanaman.

Sterilisasi permukaan dapat menggunakan alkohol 70%

dikombinasikan beberapa bahan kimia lain seperti natrium hipoklorit (NaOCl), H₂0₂(3%) dan KMnO₄(2%) (Zang et al, 2006; Agusta, 2009). Ada beberapa metode yang dapat digunakan dalam sterilisasi permukaan sampel untuk isolasi cendawaan endofit. Metode sterilisasi permukaan dikemukan oleh beberapa ahli sebagai berikut:

(44)

1) Metode sterilisasi Permukaan menurut Pimentel et al. 2016;

Russo et al., 2016)

Metode ini menggunakan alkohol 70%, Natrium hipoklorit 3%, dan aquades steril. Tahapan sterilisasi adalah sebagai berikut: 1) Sampel tanaman yang diambil dari bagian daun, batang, dan akar dicuci dua kali dalam air suling; 2) dilakukan perendaman selama 1 menit dalam 70% (v/v) etanol, 3) Bahan direndam lagi selama 4 menit dalam natrium hipoklorit (3%, v/v tersedia klorin) dan, 5) dicuci tiga kali dalam aquadest steril.

2) Metode sterilisasi permukaan menurut Fisher et al., 1994;

Amirita et al., 2012)

Bahan yang digunakan dalam metode ini adalah alkohol 75%, dan Natrium hipoklorit 4%. Tahapan sterilisasi meliputi:

1) Sampel tanaman direndam pertama dalam 75% etanol selama 60 detik; 2) kemudian direndam lagi dalam Natrium hipoklorit 4% selama 180 detik; 3) direndam kembali dalam tanol 75% selama 30 detik.

3) Metode Sterilisasi permukaan menurut Dobranic et al., (1995; (Russo et al. 2016)

Metode ini menggunakan etanol 70%, Natrium hipoklorida 4%, dan air suling. Tahapan sterilisasi: 1) Sampel tanaman dicelupkan dalam etanol 70% selama 5 detik; 3) direndam dalam natrium hipoklorida 4% selama 90 detik; 4) akhirnya dibilas dalam air suling steril untuk 10 detik.

4) Metode sterilisasi permukaan menurut (Yunianto et al., (2012); Akmalasari et al., 2013).

(45)

Metode ini menggunakan alkohol 70%, NaOCl, dan aquades steril. Tahapan sterilisasi, yaitu: 1) Sampel tanaman dimasukkan ke dalam larutan alkohol 70% selama 1 menit; 2) direndam dalam NaOCl selama 5 menit; 3) dimasukkan dalam alkohol 70 % selama 30 detik; 4) dibilas dengan aquades steril 5 detik dengan tiga kali ulangan. Bahan yang disterilisasi kemudian dikeringkan dengan tissue steri l ± 1 menit.

5) Metode sterilisasi permukaan menurut Ezra et al., (2004)

;(Qadri et al. 2013)

Metode ini menggunakan etanol 90% dan Sodium hypochlorite 1%. Tahapan sterilisasi: 1) Sampel tanaman dimasukkan ke dalam 1% sodium hypochlorite; 2) dibilas dengan air suling; 3) dibilas dengan etanol 90% ethanol.

Setelah dilakukan sterilisasi permukaan selanjutnya bagian permukaan akar, batang, dan daun disayat. Bagian dalam permukaan daun, batang, dan akar diletakkan pada medium isolasi cendawan dan diinkubasi selama (2-14) x 24 jam. Cendawan endofit yang tumbuh dimurnikan pada medium Potato Dextrose Agar/PDA (Yunianto et al., 2012; Akmalasari et al., (2013).

Gambar 9. Alur Sterilisasi Permukaan

(46)

4.3 Isolasi Cendawan Endofit

Isolat cendawan endofit yang tumbuh pada permukaan jaringan tanaman dipindahkan ke medium PDA. Isolat cendawan yang tumbuh pada medium PDA umumnya terdiri atas beberapa jenis, ditandai dengan muncul beberapa warna miselia cendawan.

Untuk mendapatkan isolat cendawan murni dari kegiatan isolasi yang telah dilakukan, maka perlu dilakukan pemurnian atau purifikasi.

Gambar 10. Cendawan yang tumbuh pada permukaan batang, daun, dan akar (kiri), cendawan setelah dipindahkan ke medium PDA (kanan) (dokumen pribadi)

4.4 Pemurnian Isolat Cendawan Endofit

Pemurnian atau purifikasi dilakukan pada setiap koloni cendawan yang dianggap berbeda. Perbedaan koloni berdasarkan morfologi makroskopis, yaitu meliputi warna dan bentuk koloni.

Hasil purifikasi akan didapatkan isolat murni atau spora tunggal.

Cendawan endofit yang telah berhasil diisolasi dari berbagai jenis tanaman seperti tanaman pangan, perkebunan, hortikultura (sayuran, buah-buahan, tanaman hias dan tanaman obat-obatan), dan tananaman kehutanan (sengon, mangrove, ebony). Contoh cendawan endofit yang telah diisolasi dari padi lokal Sulawesi Selatan (Gambar 11), cendawan endofit dari tanaman obat

(47)

(Gambar 12), cendawan endofit dari cabai (Gambar 13).

Gambar 11. Isolat cendawan endofit setelah permurnian (Dokumen pribadi)

Cendawan endofit telah diisolasi oleh (G, A, and Kannan 2015) pada jaringan daun dan batang tiga jenis tanaman obat yaitu Terminalia arjuna, Catharanthus roseus, and Azadirachta indica

Gambar 12. Isolasi cendawan endofit dari tanaman obat (G, A, and Kannan 2015).

(48)

Gambar 13. Cendawan endofit diisolasi dari tanaman cabai (Legiastuti and Aminingsih 2012).

Rangkuman

Isolasi cendawan endofit melalui tiga tahapan yaitu: 1) persiapan sampel; 2) sterilisasi; 3) isolasi; 4) pemurnian/purifikasi

Persiapan sampel diawali dengan pembersihan sampel dari sisa tanah yang melekat pada tanaman dan pemisahan bagian-bagian sampel tanaman menjadi akar, batang dan daun. Masing-masing bagian dipotong kecil-kecil sebelum dilakukan sterilisasi permukaan.

Sterilisasi permukaan sampel tanaman untuk isolasi cendawan endofit menggunakan alkohol, natrium hipoklorit, dan aguades.

Sterilisasi permukaan dilakukan secara bertahap.

Isolasi cendawan endofit dilakukan dengan meletakkan setiap potongan yang telah disterilisasi permukaan pada medium PDA dan diinkubasi pada suhu kamar hingga permukaan sampel tumbuh cendawan. Setiap jenis cendawan yang tumbuh pada permukaan sampel tanaman dipindahkan ke medium PDA yang baru.

Pemurnian dilakukan dengan memindahkan setiap isolat yang berbeda ke medium PDA yang baru sampai diperoleh isolat murni atau spora tunggal.

(49)

Tes Formatif

1. Tahapan dalam isolasi cendawan ENDOFIT adalah sebagai berikut, kecuali …

A. Persiapan sampel B. Sterilisasi permukaan C. Purifikasi

D. Pemanasan

2. Bahan yang biasa digunakan untuk sterilisasi permukaan adalah, kecuali…

A. Air mineral B. Alkohol C. Aquades

D. Natrium hipoklorit

3. Pembersihan sampel tanaman di bawah air mengalir merupakan tahapan …

A. Penyimpanan cendawan B. Perbanyakan cendawan C. Persiapan sampel D. Isolasi cendawan

4. Pemindahan setiap isolate ke medium PDA yang baru merupakan kegiatan pada tahap ….

A. Persiapan sampel B. Pemurnian

C. Sterilisasi permukaan D. Identifikasi

5. Pembilasan sampel dengan alkohol pada tahap sterilisasi permukaan dilakukan sebanyak…

A. satu kali B. tiga kali C. dua kali

(50)

D. empat kali

6. Pembilasan sampel dengan air steril dilakukan tahap…

A. awal B. akhir

C. awal dan akhir D. setiap tahap

7. Pembilasan dengan natrium hipokloris dilakukan setelah pembilasan dengan …

A. Alkohol B. Air Steril

C. Alkohol dan Air steril D. Air steril dan Alkohol

8. Kegiatan pemisahan akar, batang dan daun sampel tanaman dilakukan pada tahap…

A. Purifikasi B. Pemurnian C. Persiapan sampel D. Sterilisasi permukaan

9. Metode sterilisasi permukaan menurut Ezra menggunakan etanol dengan konsentrasi ….

A. 70%

B. 80%

C. 90%

D. 95%

10. Cendawan yang diisolasi dari daerah disekitar perakaran tanaman disebut cendawan…

A. filosfir B. endofit C. rhizosfir D. patogen

(51)

Kunci Jawaban 1. D

2. B 3. C 4. B 5. C 6. B 7. A 8. C 9. C 10. C

Rumus:

90 – 100% = baik sekali 80 – 89% = baik 70 – 79% = cukup

< 70% = kurang

Bila Anda mencapai tingkat penguasaan 80% atau lebih,

(52)

Anda dapat melanjutkan dengan unit selanjutnya. Selamat untuk Anda! Tetapi apabila tingkat penguasaan Anda masih di bawah 80%, Anda harus mempelajari kembali materi subunit 1 terutama bagian yang belum Anda kuasai.

(53)

5.1 Identifikasi Morfologi

Identifikasi cendawan penting dilakukan karena cendawan di alam sangat melimpah dan beragaman jenisnya. Identifikasi bertujuan untuk mengetahui jenis cendawan dan membedakannyan dengan jenis yang lain. Identifikasi dapat dilakukan secara konvensional dan molekuler. Identifikasi secara konvensional berdasarkan pada karakter morfologi.

Identifikasi secara morfologi telah berhasil dilakukan oleh beberapa peneliti seperti: Gazis & Chaverri, (2010), menjelaskan bahwa identifikasi secara morfologi berdasarkan pada permukaan koloni, warna, struktur misellium, jenis anamorf, konidiomata, konidia, dan konidiofor (ukuran, warna, bentuk, ornamen, dll.), sedangkan Gandjar, (1999); Hafsari dan Asterina, (2013);

(Syamsia 2016), mengidentifikasi cendawan secara morfologi dengan mengamati karakter makroskopi dan mikroskopi.

Karakter makroskopi meliputi meliputi: warna dan permukaan koloni; garis-garis radial dari pusat koloni ke arah tepi koloni; dan lingkaran-lingkaran konsentris. Karakter mikroskopi meliputi:

BAB V

IDENTIFIKASI CENDAWAN ENDOFIT

1. Menjelaskan identifikasi cendawan endofit secara morfologi 2. Menjelaskan identifikasi cendawan endofit secara molekuler

(54)

bentuk hifa; ada atau tidaknya rhizoid; bentuk sel reproduksi seksualnya dan aseksualnya.

a. Karakter Makroskopis

Karakter makroskopi yang umum diamati pada identifikasi secara morfologi diantaranya adalah:

1. Warna dan permukaan koloni

Warna permukaan koloni cendawan endofit bervariasi, ada yang berwana putih (Gambar 14), ada juga yang berwana putih saat awal petumbuhan namun perlahan lahan berubah menjadi abu-abu (Gambar 15), kuning pinggir putih (Gambar 17), hitam (Gambar 17a), hijau pinggir putih (Gambar 17b).

Gambar 14. Cendawan berwarna putih (kiri) (Syamsia, 2016) dan Kanan (Syamsia Syamsia et al. 2020)

Gambar 15. Warna koloni abu-abu (Legiastuti and Aminingsih 2012)

(55)

Gambar 16. Warna kuning pada bagian tengah (Legiastuti and Aminingsih 2012) dan foto koleksi pribadi (kiri)

Gambar 17. Warna Hitam (Legiastuti and Aminingsih 2012) dan hijau pinggir putih (Syamsia, 2016).

2. Tipe pertumbuhan

Tipe pertumbuhan cendawan ada 2 yaitu tipe pertumbuhan konsentris dan menyebar. Tipe konsentris pertumbuhannya secara terarur ke arah tepi, sedangkan tipe menyebar pertumbuhannya tidak beraturan. Contoh tipe pertumbuhan konsentris pada Gambar 18.

Gambar 18. Tipe pertumbuhan konsentris (Legiastuti and Aminingsih 2012)

(56)

b. Karakter Mikroskopis

Pengamatan mikroskopis tidak dapat dilakukan dengan kasat mata, perlu menggunakan preparat dan diamati di bawah mikroskop. Langkah pertama untuk pengamatan mikroskopis adalah pembuatan preparat. Teknik Pembuatan preparat melalui beberapa tahapan sebagaimana dijelaskan oleh Ariyanto, Abadi, and Djauhari (2013), sebagai berikut:

1. Menyiapkan object glass, cover glass, dan tissue,

2. Cendawan yang telah diisolasi pada medium PDA diambil dengan jarum ose dan ditutup dengan menggunakan cover glass.

3. Preparat diletakkan pada wadah yang telah diberi alas tissue lembab dan inkubasi selama 2-3 hari.

4. Preparat kemudian diamati di bawah mikroskop untuk mengetahui karakter mikroskopis cendawan yang diamati

Berikut ini beberapa contoh hasil identifikasi secara morfologi dari cendawan endofit. Hasil identifikasi cendawan endofit yang diisolasi dari tanaman padi lokal Enrekang berdasarkan pengamatan karakter makroskopis dan mikroskopis morfologi teridentifikasi sebagai cendawan Aspergillus sp1 Aspergillus sp2, Aspergillus candidus, dan Acremonium sp (Syamsia, et al., 2016). Karakter morfologi masing-masing cendawan endofit dijelaskan sebagai berikut:

1. Aspergillus sp1

Warna koloni bagian atas putih, bagian bawah krem, permukaan berbulu halus, konidia berbentuk bulat oval, warna konidia hialin, permukaan konidiofor halus berwarna coklat muda, phialid berbentuk tegak, hifa bersepta.

(57)

2. Aspergillus sp2

Warna bagian atas koloni hijau pinggir putih, permukaan bawah krem, permukaan koloni berbulu halus dengan tipe pertumbuhan radial. Konidia berbentuk bulat dan hialin, Permukaan konidiofr halus dan berwarna coklat muda, phialid berbentuk tegak.

3. Aspergillus candidus

Warna koloni bagian atas dan bawah putih, permukaan koloni halus dan bergelombang, dan tipe pertumbuhan radial.

Konidia berbentuk elips berukuran Elips berukuran 2.2 – 3.4 µm dengan warna hialin. Permukaan konidiofor halus dan berwarna krem, phialid berbentuk tegak, berukuran panjang 5.6 -10 µm dan lebar 2.2 – 3.4 µm, dan hifa hialin.

4. Acremonium sp

Warna permukaan atas koloni putih, permukaan bahwa krem/coklat muda, tekstur permukaan koloni kasar, konidia berbentuk bulat silinder dan berwarna hialin. Permukaan konidiofor halus dan warna transparan. Philaid berbentuk tegak dan berlendir di setiap puncak phialid. Serta hifa hialin.

Gambar 19. Makroskopis dan Mikroskopis Cendawan Endofit dari Padi Lokal Enrekang (Syamsia 2016)

(58)

Identifikasi morfologi cendawan endofit dari tanaman Annona squamosa (Yunianto et. al., 2012) pada Gambar 20.

Gambar 20 Morfologi isolat cendawan endofit dari Annona squamosa (Yunianto et al., 2012)

Cendawan endofit asal tanaman karet juga berhasil diisolasi dan dikarakterisasai (Gambar 21) (Amaria, Taufiq, and Harni 2013)

Gambar 21 Cendawan endofit dari tanaman karet (Amaria, Taufiq, and Harni 2013)

(59)

Gambar 22. Penampakan mikroskopis kapang endofitik (kiri) Phoma (kanan) Pestalotiopsis (Pembesaran 400X) (Ilyas 2007a) Kelemahan Idenifikasi secara morfologi

Identifikasi secara morfologi sudah banyak mengungkap jenis-jenis cendawan endofit yang ada pada berbagai jenis tanaman.

Namun demikian identifikasi secara morfologi seringkali tidak dapat memberikan kepastian identitas isolat.

Beberapa penyebab ketidakpastian identitas isolate yang diisolasi secara morfologi dikemukakan oleh Hyde dan Soytong (2008); Legiastuti & Aminingsih, (2012) adalah: 1) morfologi cendawan endofit dapat berubah; 2) beberapa cendawan endofit memiliki pertumbuhan sangat lambat; 3) sering terjadi sporulasi.

Sedangkan menurut (Diaz, Hennell, and Sucher 2013), beberapa spesies kelihatan sama, padahal sebenarnya tidak sama atau berbeda.

5.2 Identifikasi Molekuler

Identifikasi morfologi secara makroskopis dan mikroskopis perlu diverifikasi dengan metode lainnya, yaitu metode identifikasi molekuler (Rahayu, Saryono, and Nugroho 2015).

Menurut Legiastuti & Aminingsih (2012), identifikasi cendawan endofit menggunakan teknik PCR dan perunutan DNA memiliki kepekaan yang tinggi, cepat, dan akurat. Identitas cendawan

(60)

endofit dapat diketahui hingga tingkat spesies berdasarkan pada analisis BLASTN hasil perunutan DNA.

PCR (Polymerase Chain Reaction). Analisis genetik dengan menggunakan metode PCR memanfaatkan cara replikasi DNA dengan bantuan primer yang mengapit daerah tertentu dan optimasi suhu dilakukan untuk mendapatkan kondisi PCR yang optimal. Sehingga dihasilkan produk PCR spesifik yaitu terbentuk pita DNA tebal (Ludyasari 2005).

Bahan yang digunakan untuk setiap tahapan dalam identifikasi molekuler dijelaskan oleh (Diaz, Hennell, and Sucher 2013) adalah:

a. Bahan untuk Fermentasi dan ekstrasi cendawan - Czapek-Dox broth;

- Aguades steril;

- Miselia cendawan sekitar 500 mg per 250 ml;

- Kertas saring

a. Bahan Elektroforesis Gel Agarose - Gel Agarose

- 50x TAE buffer

- Ethidium bromide (10 mg/mL) - 5x Nucleic acid

- 1- kd ladder

b. Bahan Ektrasksi DNA

- Kertas saring steril 0.22 µm - Nitrogen cair

- mortal dan pestel

- DNeasy plant mini kit (QIAGEN) c. Bahan untuk Amplifikasi PCR

- iProof High-Fidelity PCR kit (Bio- Rad)

- DNA Engine® Peltier Termal Cycler (Bio-Rad)

(61)

d. Bahan PCR Reaction Clean-Up

- PureLink^TMPCR Purification Kit (Invitrogen)

Tahapan identifikasi cendawan menurut (Diaz, Hennell, and Sucher 2013) adalah:

1. Fermentasi cendawan

Metode fermentasi cendawan adalah sebagai berikut:

a. Media cair Czapek Dox dibuat dengan menambahkan 45,5 g Czapek Dox ke dalam botol Schott 1-L dan menambahkan aquades steril. Sterilisasi media dengan diautoklaf selama 15 menit

b. Media Czapek Dox cair yang telah disterilisasi dituangkan ke dalam erlenmeyer 250 mL.

c. Miselia cendawan dikeluarkan dari cawan petri menggunakan jarum steril sekali pakai dan memasukkan ke dalam Erlenmeyer yang telah telah diisi media Czapek Dox Broth d. Erlenmeyer ditutup dengan kain tipis untuk memungkinkan

aerasi.

e. Media berisi cendawan diinkubasikan pada temperatur 25°C dengan agitasi pada 120 rpm selama 7-14 hari.

2. Ekstraksi DNA Genomik menggunakan DNeasy Plant Mini Kit

a. Media cair yang mengandung miselia disaring menggunakan penyaring vakum steril 0,22 m.

b. Miselia sekitar 20 mg berat basah dipindahkan ke mortar dan ditambahkan nitrogen cair. Miselia digiling dengan mortal di bawah nitrogen cair sampai terbentuk bubuk.

Nitrogen cair harus terus-menerus diisi ulang agar miselia tidak mencair.

(62)

c. Miselia dalam nitrogen cair dituang ke dalam tabung centrifuge 2-mL dan biarkan nitrogen cair menguap.

d. Ekstraksi genom DNA (gDNA) menggunakan mini kit DNeasy ® tanaman, sesuai petunjuk perusahaan/pabrik (Qiagen DNeasy ® Plant Handbook, 07/2006. Gunakan air suling sebagai pelarut elusi akhir sebagai ganti buffer AE.

3. Penilaian Kuantitas dan Kemurnian DNA dengan UV Spektrofotometri

a. Spektrum UV dari solusi DNA diukur antara 220 dan 320 nm. Absorbansi harus antara 0,1 dan 1 AU.

b. Konsentrasi DNA diperkirakan dengan mengukur absorbansi larutan pada 260 nm. Absorbansi dilipatgandakan sebesar 50 mg/mL/AU untuk mendapatkan konsentrasi dsDNA yang diperkirakan.

c. Kemurnian DNA dari protein diperkirakan dengan mengukur rasio antara absorbansi pada 260 nm dan absorbansi pada 280 nm. DNA murni memiliki A 260/A 280 rasio 1,7-1,9.

d. Kemurnian DNA dari EDTA, karbohidrat, dan fenol diperkirakan dengan mengukur rasio antara absorbansi 260 nm dan absorbansi 230 nm. DNA murni memiliki A 260/

Rasio 230 dari 2,0–2,3.

4. Penilaian Kualitas gDNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa

a. Gel agarosa 0,7% disiapkan/dibuat dengan melarutkan 0,35 g bubuk agarosa dalam 50 mL 1 × TAE.

b. gDNA (sekitar 20 mg) dicampur dengan buffer ke dalam gel. Digunakan 1-kb ladder untuk referensi ukuran.

c. Gel di running pada 100 V selama sekitar 60 menit.

(63)

d. Gel diwarnai dalam larutan etidium bromida (0,5 mg / mL).

e. Gel divisiualisasikan di bawah sinar UV untuk menentukan kualitas gDNA. Pita tunggal harus jelas di bagian atas gel.

Jika gDNA telah rusak, maka goresan biasanya terjadi.

5. Amplifikasi PCR Cendawan wilayah ITS

Mengatur reaksi PCR menggunakan kit DNA polimerase iProof hi-fi delity sesuai dengan instruksi pabrik. Bisa menggunakan reaksi 50-uL per 1 unit iProof DNA polimerase untuk memastikan DNA yang cukup dihasilkan untuk pemurnian, kontrol kualitas, dan pengurutan. Urutan primer disajikan pada Tabel 1 dan volume reaksi disajikan pada Tabel 2.

Tabel 1. Daftar Primer yang umum digunakan untuk Barkoding Cendawan (Diaz, Hennell, and Sucher 2013)

Primer Sequence 5’-3’

NSI1 (forward) GAT TGA ATG GCT TAG TGA GG NLB4 (reverse) GGA TTC TCA CCC TCT ATG AC

ITS1 (forward) TCC GTA GGT GAA CCT GCG G ITS4 (reverse) TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC

Tabel 2. Volume Reaksi untuk Amplifikasi PCR (Diaz, Hennell, and Sucher 2013)

Komponen Volume per reaksi

5 x Proof buffer 10 µL

dNTP mix 1 µL

Forward primer (10 µM) 2,5 µL

Reverse primer (10 µM) 2,5 µL

DNA template 50 mg

Proof DNA polymerase 0,5 µL

H₂O steril Sampai 50 µL

(64)

Amplifikasi DNA templat menggunakan program suhu yang diadaptasi dari White et al., (1990): (Diaz, Hennell, and Sucher 2013), sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 95°C selama 60 detik; denaturasi 95°C, 30 detik; dan annealing pada suhu 60°C, 40 detik; ekstensi 72°C, 90 detik; perpanjangan waktu terakhir 72°C, 300 detik. Denaturasi, annealing, dan ekstensi diulang 35 kali.

6. Penilaian Kualitas Produk PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa

a. Menyiapkan gel agarosa 1,0% dengan melarutkan 0,5 g bubuk agarose, dalam 50 mL TA 1 ×.

b. Sekitar 20 mg produk PCR yang dicampur dengan menambahkan buffer ke gel. G 1-kb ladder untuk referensi ukuran.

c. Gel dijalankan pada 100 V selama sekitar 60 menit.

d. Gel diwarnai dengan larutan etidium bromida (0,5 mg / mL).

e. Gel divisualisasikan di bawah sinar UV untuk menentukan kualitas gDNA.

Satu pita harus jelas. Jika ada beberapa band atau tidak ada band maka PCR di atas perlu dimodifikasi. Secara umum, suhu annealing dan konsentrasi Mg²⁺ adalah parameter yang dapat disesuaikan.

7. Pembersihan PCR

Bersihkan produk amplifikasi PCR menggunakan Kit Purifikasi PCR PureLink ™, seperti yang dijelaskan oleh instruksi pabrik, kecuali untuk perubahan berikut:

(a) Buffer HC digunakan untuk pengikatan DNA untuk

(65)

menghilangkan produk samping PCR dengan berat molekul rendah.

(b) 30 mL air suling digunakan untuk mengelusi DNA yang dimurnikan.

Gambar 23. Hasil amplifikasi DNA cendawan endofit asal tanaman cabai menggunakan pasangan primer ITS1/

ITS1(Legiastuti and Aminingsih 2012)

Gambar 24. Hasil amplifikasi PCR menggunakan pasangan primer NL1 dan NL4 (Yunianto et al. 2012)

(66)

Gambar 25. Hasil amplifikasi PCR menggunakan pasangan primer ITS1/ITS4 (S. Syamsia et al. 2019).

Contoh hasil identifikasi molecular dari 2 isolat cendawan endofit memiliki kemiripan dengan Podoscypha bolleana dan Coprinopsis cinerea (Tabel 3).

Tabel 3. Tingkat kemiripan Isolat Cendwan endofit asal tanaman Padi Lokal Sulawesi Selatan pada analisis BLASTN (Syamsia Syamsia et al. 2019)

(67)

Tabel 4. Tingkat Kemiripan solate cendawan endofit asal tanaman cabai berdasarkan pada analisis BLASTN

Rangkuman

Cendawan endofit dapat diidentifikai secara morfologi dan molekuler. Identifikasi morfologi didasarkan pada pengamatan makrokopis dan mikroskopis. Makroskopis berdasarkan pada warna koloni, tipe permukaan koloni, dan tipe pertumbuhan. Mikroskopis berdasarkan pada bentuk hifa, struktur misellium, jenis anamorf, konidiomata, konidia, dan konidiofor (ukuran, warna, bentuk, ornamen, tepi, dan lain-lain).

Identifikasi secara molekuler menggunakan teknik PCR dan perunutan DNA. Identifikasi dapat diketahui hingga tingkat sepesis berdasarkan analisis BASTN hasil perunutan DNA. Tahapan Identifikasi cendawan secara molekuler meliputi:

a. Fermentasi cendawan b. Ekstraksi DNA Genomik

c. Penilaian Kuantitas dan Kemurnian DNA dengan spektrofotome tri UV

d. Penilaian Kualitas gDNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa e. Amplifikasi PCR Cendawan wilayah ITS

f. Penilaian kualitas Produk PCR dengan elektroforesis Gel Agaorsa Primer yang umum digunakan untuk barcoding cendawan adalah: pasangan primer NSI1/NLB4 dan ITS2/ITS4.

(68)

Tes Formatif

1. Berikut ini kriteria yang digunakan dalam identifikasi cendawan secara makroskopis, kecuali …

a. Warna koloni b. Permukaan koloni c. Hifa

d. Tipe pertumbuhan

2. Karakter mikroskopis yang digunakan dalam identifikasi secara morfologi adalah …

a. Warna koloni b. Tipe Pertumbuhan c. Permukaan koloni d. Spora

3. Tahap pertama dalam identifikasi molekuler adalah…

a. Ekstraksi DNA genomic b. Amplifikasi PCR

c. Fermentasi cendawan

d. Penilaian kalitas gDNA dengan elektroforesis gel solate 4. Bahan untuk fermentasi cendawan adalah…

a. Gel agarose b. Ethidium bromide c. Czapek-Dox broth d. Nitrogen cair