BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah, Sentrifiige SED 5 (United Kingdom), seperangkat alat Destilasi, alkoholmeter, pH meter merek HANNA, timbangan analitik merek METTLER AE 200, spektronik D 20, HPLC Shimadzu LC-20AD, detektor HPLC SPD 20A, printer HP Laser Jet PI005, ultrasonik Branson 3510, milipore 0,45|jm, kolom Shim-pack VP-ODS 250L x 4,6 (CI8) dan seperangkat alattitrasi.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah limbah buah nenas, starter Kombucha, Amonium heptamolybdat-Tetrahydrat ((NH4)6Mo7024.4H20)
Merck, di-natriumhydrogenarsenat-Heptahydrat (Na2HAs04.7H20) Merck, Asam sulfat (H2SO4) delta aldrick. Natrium karbonat anhidrat (Na2C03) Unilab, asam oksalat dihidrat (C2H2O4.2H2O) Merck, Kaliumnatriimi tartarat-tetrahydrat (C4H4KNa06.4H20) Merck, Natrium sulfat (Na2S04) Merck, Natrium hidroksida (NaOH) Merck, kupri sulfat pentahidrat (CUSO4.5H2O) Merck, Natrium hidrogen karbonat (NaHCOa) Wako Pure Chemical, glukosa anhidrat, akuabiDestilasi dan asam asetat standar ( C H 3 C O O H ) .
3.2. Peremajaan kombucha
Sebelum digunakan sebagai starter maka dilakukan peremajaan terhadap
kombucha dengan cara mendidihkan air sebanyak I L , gula sebanyak 100 gram dicampur dengan baik dan didihkan kembali selama 5 menit, teh dicelupkan pada larutan. Larutan dipindahkan dalam wadah kaca dan dinginkan. Setelah larutan teh dingin kemudian masukkan koloni kombucha yang telah ada sebelumnya dan ditutup dengan kain kasa. Inkubasi selama 10 hari maka akan terbentuk lapisan baru dari koloni kombucha yang dapat kita gunakan untuk penelitian selanjutaya (semakin lama inkubasi maka semakin tebal lapisan kombucha yang kita dapat).
Gambar 5. Kombucha 3.3. Teknik pengambilan dan persiapan sampel
Sampel limbah buah nenas diambil dari usaha keripik nenas PRIMA TANI di Jl.raya Pekanbaru Bangkinang KM26 Kualu Nenas Kecamatan Tambang Kabupaten Kampar. Sampel (empulur, kulit dan limbah daging) dibersihkan dari kotoran, kemudian homogenkan, dan diblender sehingga didapat jus limbah buah nenas. Air teh dipersiapkan dengan cara melarutkan 100 gram gula dalam 1 L air mendidih dan the dicelupkan pada larutan. Persiapan sampel ini dapat langsung digunakan untuk percobaan pada tahap I .
Kulit Empelur Limbah daging
Gambar 6. Jenis sampel limbah nenas yang dianalisis
3.4. Rancangan Penelitian
Tahap I : Menentukan kandungan gula pereduksi dari limbah buah nenas dan larutan air teh menggunakan metode Nelson Somogyi.
Tahap II: Menentukan kandungan substrat optimal yang dilakukan pada variasi , : substrat 25%, 50%, 75% dan 100% (w/v) dengan menggunakan berat starter konstan 25 gram dan difermentasi selama dua hari, optimalisasi ditandai dengan kadimgan alkohol optimal yang diukur V menggunakan alkoholmeter.
Tahap III: Menentukan berat starter optimal yang dilakukan pada variasi 15 gram, 25 gram, 35 gram, 45 gram dan 55 gram dengan menggunakan kandimgan substrat optimal dan difermentasi selama dua hari, optimalisasi ditandai dengan kandungan alkohol optimal yang diukur menggunakan alkoholmeter.
Tahap IV: Menentukan waktu fermentasi optimal untuk asam asetat yang dilakukan pada variasi fermentasi selama 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dan 11 hari dengan substrat dan berat starter optimal yang telah didapatkan pada tahap sebelumnya, optimalisasi ditandai dengan menentukan ? kadar asam asetat menggunakan metode titrasi dan HPLC.
3.5. Prosedur Penelitian
3.5.L Tahap I (Penetapan Gula Pereduksi) A. Penentuan waktu kestabilan wama
Waktu kestabilan wama ditentukan menggimakan larutan standar glukosa anhidrat dengan konsentrasi 30 ppm yang dipipet sebanyak 1 mL. Reagen Nelson-somogyi ditambahkan sebanyak 1 mL dan selama 20 menit larutan dipanaskan di atas penangas air. Tabung diangkat dan dinginkan hingga suhu 24*'C. Reagen arsenomolibdat sebanyak 1 mL ditambahkan, dikocok sampai endapan CU2O larut kembali. Aquades ditambahkan kembali 7 mL. Absorbansi larutan ditentukan mulai dari 0 menit sampai 80 menit dengan interval waktu 5 menit pada panjang gelompang 660 nm, sehingga kestabilan wama dapat diketahui dari kurva antara absorbansi dengan waktu pengukuran.
B. Penentuan panjang gelombang optimum
Panjang gelombang optimum ditentukan menggunkan larutan standar glukosa anhidrat dengan konsentrasi 30 ppm yang dipipet sebanyak 1 mL. Reagen Nelson-somogyi ditambahkan sebanyak 1 mL dan selama 20 menit dipanaskan di atas penangas air. Tabung diangkat dan dinginkan hingga suhu 24°C. Reagen arsenomolibdat ditambahkan sebanyak 1 mL, larutan dikocok sampai endapan CU2O larut kembali. Aquades ditambahkan kembali 7 mL. Untuk panjang gelombang optimimi dapat diketahui dengan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 600-900 nm dengan interval 10 run. Pengukuran dilakukan selama waktu kestabilan wama tercapai.
C. Pembuatan kurva standar
Standar yang digunakan adalah glukosa anhidrat yang ditimbang sebanyak 0,2503 gram dalam 250 mL aquades (larutan induk). Larutan induk diambil 10 mL yang kemudian diencerakan sampai volume 100 mL dengan aquades (larutan intermediet). Larutan intermediet digimakan untuk membuat deretan larutang standar dengan masing-masing diambil 5, 10, 15, 20, 25, 30 dan 40 mL dan masing-masingnya ditambahkan aquades sampai volume 50 mL. Deretan larutan standar diambil 1 mL masing-masingnya dan dimasukkan dalam tabung reaksi. Reagen Nelson-somogyi ditambahkan sebanyak 1 mL dan larutan dipanaskan selama 20 menit di atas penangas air. Tabung diangkat dan dinginkan hingga suhu 24*'C. Reagen arsenomolibdat ditambahkan sebanyak 1 mL, larutan dikocok sampai endapan CuiO larut kembali. Aquades ditambahkan kembali 7 mL, larutan didiamkan selama 10 menit. Absorbansinya larutan ditentukan pada panjang gelombang 760 nm.
D. Penetapan sampel
Larutan air teh dan sampel jus limbah buah nenas ditimbang kemudian filtratnya diambil sebanyak 10 mL. Filtrat disentrifiis selama 10 menit dengan kecepatan 2000 rpm. Ekstrak yang didapat diambil 5 mL kemudian dilarutkan kembali sampai volume 100 mL dengan aguades, hasil pengenceran ini dipipet
1 mL dan diencerkan kembali sampai volume 100 mL. Filtrat pengenceran ini ditentukan kadamya gula sama seperti standar.
3.5.2. Tahap II (Penetapan kandungan substrat optimal) A. Persiapan substrat
Sampel limbah nenas (empulur, kulit dan limbah daging) ditimbang masing-masing 300 gram, dengan penambahan air 900 mL campuran sampel diblender hingga halus dan dipanaskan selama 10 menit (lakukan dua kali pengulangan). Jus limbah buah nenas diambil masing - masing sebanyak 250 gram, 500 gram, 750 gram dan 1000 gram dan dimasukkan dalam wadah kaca . Air yang telah didihkan terlebih dahulu ditambahkan sampai volume larutan 1000 mL sehingga diperoleh kandungan secara berurut 25%, 50%, 75% dan 100% (wA'). > . , ,
B. Penetapan
Starter sebanyak 25 gram ditimbang, pada masing-masing variasi kandungan sampel di dalam wadah kaca dimasukkan starter, kemudian larutan ditutup dengan kain kasa. Larutan diinkubasi pada suhu 24*'C- 34°C selama 2 hari. Setelah 2 hari larutan didestilasi, dan kandungan alkohol ditentukan menggunakan alkoholmeter. Kandungan sampel optimal ditunjukkan dengan hasil pengukuran kandungan maksimal dari alkohol.
3.5.3. Tahap III (Penetapan berat starter optimal)
Substrat dengan kandungan optimal yang didapat dimasukkan dalam empat wadah kaca masing-masing 1 L. Lima variasi berat starter kombucha ditimbang masing-masing 15, 25, 35, 45 dan 55 gram kemudian dimasukkan dalam wadah kaca dan ditutup dengan kain kasa. Larutan dinkubasi pada suhu 24*^C- 34°C selama 2 hari. Setelah 2 hari larutan didestilasi, dan kandungan alkoholnya ditentukan menggunakan alkoholmeter. Kandungan starter optimal ditunjukkan dengan hasil pengukuran kandungan optimal dari alkohol.
3.5.4. Tahap IV (Penetapan waktu optimal pembentukan asam asetat)
Penentuan waktu optimal dilakukan dengan cara menggunakan kandungan substrat optimal dan kandungan starter optimal yang telah didapat sebelumnya. Substrat dimasukkan dalam wadah kaca. Starter Kombucha dimasukkan dan larutan ditutup dengan kain kasa. Larutan diinkubasi pada suhu 24°C- 34°C dengan variasi waktu 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 dan 11 hari.
Setelah waktu fermentasi selesai, tutup wadah yang berisi sampel tadi dibuka. Nata kombucha baru yang terbentuk selama fermentasi dipisahkan dari larutan. Larutan hasil fermentasi disaring menggunakan kertas whatman no 42. Filtrat dimasukkan pada wadah yang tertutup rapat dan disimpan di refrigerator. Kadar asam asetat ditentukan secara titrimetri dan HPLC pada setiap variasi waktu. Kadar yang tertinggi dari asam asetat adalah sebagai waktu optimum yang digunakan untuk fermentasi asam asetat.
3.5.4.1. Penentuan asam asetat dengan metode titrasi
Hasil fermentasi dipipet sebanyak 10 mL, kemudian dimasukkan dalam labu 100 mL, larutan dipaskan sampai tanda batas dengan akuades. Larutan
dipipet sebanyak 10 mL dan diencerkan sampai volvmie 250 mL. Larutan hasil pengenceran sebanyak 10 mL dititrasi dengan larutan standar NaOH 0,1 N menggunakan indikatir phenol ptalein 1-3 tetes.
3.5.4.2. Penentuan asam asetat dengan metode HPLC
Kandungan asam asetat pada sampel dianalisis di BPOM Manado. Kolom yang digunakan adalah Shim-pack VP-ODS 250Lx4,6 (CI8) dengan panjang gelombang detektor 214 nm. Volume injeksi 20 ^ l , sistim yang digunakan elusi isokratik dengan fase gerak aquabides dan kecepatan alir 1,5 ml/menit. Pembuatan kurva standar dilakukan dengan cara memipet 10 ml asam asetat p.a 100% kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml (larutan induk). Aquabides ditambahkan sampai tepat tanda batas. Deretan larutan standar 0,1%, 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0% dibuat dari larutan induk, kemudian larutan disonikasi/degas selama 15menit dengan ultrasonik dan diinjeksikan ke HPLC. Kurva standar didapat dengan cara memplotkan konsentrasi deretan standar dengan luas area kromatogram masing-masing standar.
Pengukuran sampel dilakukan dengan cara memipet 2 ml sampel hasil fermentasi, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 20 ml dan diencerkan dengan aquabides tepat sampai tanda batas. Larutan sampel yang telah diencerkan disaring dengan milipore 0,45 fxm kemudian disonikasi/degas selama 15 menit dan diinjeksikan ke HPLC. Kandimgan asam asetat dari sampel dapat dihitvmg berdasarkan kurva standar.
3.5.5. Analisis Data
Data hasil pengukuran yang diperoleh dianalisis secara deskriptif melalui tabel dan grafik.
