Validasi metode penetapan kadar etanol hasil produksi \"Ciu\" rumahan Dusun Sentul Desa Bekonang Kabupaten Sukoharjo dengan metode kromatografi gas - USD Repository

(1)

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR ETANOL HASIL

PRODUKSI “CIU” RUMAHAN DUSUN SENTUL_{DESA BEKONANG}

KABUPATEN SUKOHARJO DENGAN METODE KROMATOGRAFI GAS

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Alberthus Djanu Rombang

NIM: 088114126

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

(2)

i

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR ETANOL HASIL

PRODUKSI “CIU” RUMAHAN DUSUN SENTUL_{DESA BEKONANG}

KABUPATEN SUKOHARJO DENGAN METODE KROMATOGRAFI GAS

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Alberthus Djanu Rombang

NIM: 088114126

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

(3)

(4)

(5)

iv

(6)

(7)

(8)

vii INTISARI

Bekonang merupakan daerah penghasil Ciu. Produksi menggunakan bahan baku tetes tebu yang difermentasikan dan didestilasikan secara sederhana sampai diperoleh Ciu yang digunakan sebagai bahan pembuatan etanol medis. Metode Kromatografi Gas merupakan metode yang dipilih untuk menetapkan kadar etanol yang dihasilkan tersebut.

Penelitian ini merupakan penelitian non eksperimental-deskriptif. Kadar etanol ditetapkan dengan metode Kromatografi Gas pada kondisi optimal yaitu dengan penggunakan kolom kapiler Cp-Wax 52 CB (25m, i.d. 0,32mm), tekanan kolom 10 psi, suhu awal kolom 70oC dengan kenaikan suhu kolom 30oC/menit sampai suhu kolom maksimal 220oC, detektor FID (Flame Ionization Detector), sehingga diperoleh pemisahan yang baik dan hasil yang diperoleh memenuhi parameter validitas yang ditentukan yaitu: selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, batas kuantifikasi, batas deteksi, dan rentang.

Hasil penelitian menunjukkan metode ini memiliki nilai selektivitas (Rs) > 1,5. Linearitas etanol standar diperoleh dengan nilai r 0,9996, nilai rata-rata %

recovery untuk kadar rendah, sedang dan tinggi berturut-turut adalah 103,7%; 101,8 %; 101,9%; nilai % CV yang diperoleh untuk kadar rendah, sedang dan tinggi berturut-turut adalah 1,62%; 1,26%, 0,73%. Sedangkan untuk batas kuantifikasi diperoleh nilai 1,729%v/v, dan batas deteksi diperoleh nilai 0,518%v/v dengan rentang kadar sampel yang dapat diukur diantara level kadar 6%v/v sampai dengan 10%v/v. Berdasarkan hasil tersebut maka metode Kromatografi Gas dengan settingan instrumen yang dioptimalkan dapat digunakan untuk menetapkan kadar etanol pada hasil produksi pembuatan Ciu di Dusun Bekonang dengan hasil yang dapat dipercaya.

(9)

viii ABSTRACT

Bekonang is a place where Ciu is produced. The Ciu production uses the raw material molasses which is simply fermented and distillated until getting the Ciu which is used as the substance to make the medical ethanol. Chromatography method was the method chosen to determine the level of ethanol.

This research was a non-experimental-descriptive research. The level of ethanol was determined by chromatography method in optimal condition by using capillary Cp-Wax 52 CB (25m, i.d. 0,3mm) column, with its column pressure 10

psi and its temperature 70o_{C and the temperature raised up to 30}o_{C per second}

with maximum column temperature 220oC and FID (Flame Ionization Detector). The process produced a good result, it could achieve the validity parameter; selectivity, linearity, accuracy, precision, quantification limit, detection limit and range.

The research result showed that the chromatography method had selectivity score which was (Rs) > 1,5.The standard of ethanol linearity was gained with score r 0.9996, The order of the percentage of median for the low, medium and high level of recovery were 103.7%; 101.8%; 101.9%. The order for CV percentage score which was gained for the low, medium and high level were 1.62%, 1.26%, 0.73%. While the obtained quantification limit score was 1.728% v/v and the detection limit score was 0.518% v/v with its level sample which could be measured between range 6% v/v up to 10% v/v. According to its result, thus the chromatography method which set the optimal adjustment could be used to decide the level of ethanol of the Ciu production in the Bekonang village with a reliable result.

(10)

ix

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Bapa Yang Maha Kuasa

atas segala limpahan berkatdan kasih-Nya sehingga penelitan dan penyusunan

skripsi yang berjudul “Validasi Metode Penetapan Kadar dan Profil Kandunga

Ciu Hasil Produuksi Industri Rumahan Di Daerah Sukoharjo Secara Kromatografi

Gas” dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat

untuk meraih gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi, Universitas

Sanata Dharma, Yogyakarta.

Dalam pelaksaaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini,

penulis mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena

itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ibu Aris Widayati, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Bapak Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen pembimbing yang dengan

sabar memberikan pengarahan, masukan, kritik dan saran baik selama

penelitian maupun penyusunan skripsi ini.

3. Bapak Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen penguji yang telah

memberikan saran dan kritik yang membangun dalam penyusunan

skripsi.

4. Bapak Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt.Apt selaku dosen penguji

yang telah memberikan saran dan kritik yang membangun dalam

(11)

x

5. Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc. selaku dosen penguji yang

telah memberikan saran dan kritik yang membangun dalam penyusunan

skripsi.

6. Ibu Christofori Maria Ratna Rini Nastiti, selaku dosen pembimbing

akademik atas bimbingan dan semangat yang telah diberikan selama ini.

7. Ibu Rini Dwi Astuti, M.Sc, Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

8. Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah

memberikan ilmu yang bermanfaat demi kemajuan mahasiswa dalam

bidang farmasi.

9. Seluruh staff laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma: Mas Bimo, Mas Parlan, yang telah banyak membantu selama

penelitian di laboratorium.

10. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah

membantu penulis dalam mewujudkan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan

skripsi ini, sehingga segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis

harapkan. Semoga skripsi ini membantu dan bermanfaat bagi pembaca pada

khususnya dan ilmu pengetahuan pada umumnya.

Yogyakarta, 27 Agustus 2014

(12)

xi DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL……….. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING……….... ii

HALAMAN PENGESAHAN... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA... v

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI... vi

INTISARI... vii

ABSTRACT... viii

KATA PENGANTAR... ix

DAFTAR ISI... xi

DAFTAR TABEL... xv

DAFTAR GAMBAR………. xvi

DAFTAR LAMPIRAN... xvii

BAB I PENDAHULUAN……….. 1

A. Latar Belakang………... 1

1. Permasalahan……….... 4

2. Keaslian Penelitian………... 4

3. Manfaat Penelitian……….... 4

a. Manfaat praktis………... 4

b. Manfaat metodologis……….. 4

B. Tujuan Penelitian………... 5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA………... 6

(13)

xii

B. Etanol………. 6

C. Kromatografi Gas……….. 7

1. Sistem Injeksi Sampel………. 8

2. Gas Pembawa……….. 9

3. Kolom……….. 10

a. Kolom kemas………. 10

b. Kolom kapiler……… 11

4. Fase Diam……… 11

5. Detektor………... 13

6. Pengaturan Suhu……….. 15

D. Validasi Metode………. 15

1. Selektivitas………... 16

2. Linearitasdan rentang ………... 17

3. Akurasi………... 17

4. Presisi………... 18

5. Limit Of Quantitation(LOQ) dan Limit Of Detection(LOD)……….... 19

E. LandasanTeori……….. 19

F. Hipotesis……….... 21

BAB III METODOLOGI PENELITIAN……….. 22

A. Jenis dan Rancangan Penelitian………. 22

B. Variable Penelitian………. 22

1. Variabel bebas……….. 22

2. Variabeltergantung……….. 22

(14)

xiii

C. Definisi Operasional……….. 23

D. Bahan-bahan Penelitian………. 23

E. Alat Penelitian……….... 23

F. Tata Cara Penelitian………... 24

1. Pemilihan sampel dan pengambilan………. 24

2. Preparasi sampel……….. 24

3. Pembuatan larutan baku………... 24

4. Penetapankurva baku………... 24

5. PenentuanrecoverydanCoefficient of Variation(CV) larutanbaku……….. 25

6. PenentuanLimit of QuantitationdanLimit of Detection baku……….. 25

G. Analisis Hasil………. 25

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN………... 28

A. Pemilihan Sampel………... 28

B. Preparasi Sampel……… 28

C. Pembuatan LarutanBaku………... 29

D. PenetapanKurva Baku………... 29

E. Validasi Metode Analisis……… 32

1. Selektivitas……….... 33

2. Linearitas……….. 35

3. Akurasi……….. 35

4. Presisi……… 36

(15)

xiv

6. Rentang……… 38

BAB V Kesimpulan Dan Saran……….. 39

A. Kesimpulan……….. 39

B. Saran……… 39

DAFTAR PUSTAKA………. 40

LAMPIRAN………... 42

(16)

xv

DAFTAR TABEL

Tabel I Jenis fase diam dan penggunaannya………... 12

Tabel II Jenis detektor danpenggunaannya………. 14

Tabel III Parameter analisis validasi metode……….... 16

Tabel IV Kriteria %recoveryyang diijinkan untuk konsentrasi analit

yang berbeda………... 18

Tabel V Kriteria presisi yang diijinkan untuk konsentrasi analit yang

berbeda………... 18

Tabel VI Data replikasi larutan seri baku etanol………... 30

Tabel VII Data rasio AUC……….. 31

Tabel VIII PerbandinganRetention Timebaku etanol dan standar internal

n-butanol………. 33

Tabel IX Data %recovery………. 36

(17)

xvi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1 Skema Instrumen Kromatografi Gas... 8

Gambar 2 Kolom kemas (a) dan kolom kaplier (b)... 11

Gambar 3 Hubungan antara konsentrasi etanoal dengan

AUC (replikasi III)... 32

Gambar 4 Kromatogram pengukuran sampel pada kondisi optimal….. 34

Gambar 5 Kromatogram baku etanol konsentrasi 600 µl... 34

(18)

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Sertifikat analisis etanol………. 43

Lampiran 2 Sertifikat analisis n-butanol……… 45

Lampiran 3 Parameter Instrumen Kromatografi Gas……… 47

Lampiran 4 Kromatogram seri baku etanol replikasi I……….. 48

Lampiran 5 Kromatogram seri baku etanol replikasi II………. 50

Lampiran 6 Kromatogram seri baku etanol replikasi III………... 53

Lampiran 7 Kromatogram seri baku etanol replikasi IV..……… 55

Lampiran 8 Kromatogram seri baku etanol replikasiV……… 58

Lampiran 9 Kromatogram validasi metode………... 60

Lampiran 10 Data perhitungan konsentrasi seri larutan baku etanol………... 68

Lampiran 11 Persamaan kurva baku dan gambar baku etanol……… 70

Lampiran 12 Nilai AUC etanol dan perhitungan recovery etanol…………... 70

Lampiran 13 PerhitunganCoefficient of Variations(CV) etanol……… 73

(19)

1

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Desa Bekonang yang terletak di kecamatan Sukoharjo merupakan tempat

penghasil etanol. Masyarakat sekitar mengenal etanol hasil produksi ini dengan

nama ‘Ciu’_{. Produksi Ciu dibuat dari molase atau tetes tebu sisa hasil produksi}

gula tebu yang difermentasikan dan kemudian didestilasi atau disuling sehingga

dihasilkan Ciu. Hasil produksi terdiri dari dua macam yaitu: Ciu dengan tingkat

kadar 30-34% dan dengan tingkat kadar yang lebih tinggi (sekitar 90%). Sebagian

besar warga di Bekonang merupakan produsen industri rumahan pembuatan Ciu

(Sabariyono, 2012).

Fermentasi atau peragian Ciu dilakukan dengan bantuan spesies ragi

tertentu seperti Saccharomyces cerevisiae. Ragi ini akan memetabolisme gula

tanpa oksigen menghasilkan etanol dan CO2. Peragian oleh warga Bekonang

dilakukan dengan takaran 1 kantong kecil ragi Saccharomyces cerevisiae untuk

250 L bahan dasar tetes tebu di dalam wadah drum. Satu kali proses peragian

tersebut memerlukan waktu 5-6 hari dan dapat dilihat fermentasi tidak berjalan

lagi jika sudah tidak ada gelembung yang terbentuk (Sabariyono, 2012).

Proses penyulingan selanjutnya dilakukan untuk mendapatkan hasil

produksi. Pada tahun 1940-1970 warga Bekonang masih menggunakan bambu

dan kelenting untuk menyuling tetes tebu yang difermentasikan. Kelenting

(20)

dari tetes tebu yang dipanaskan. Pada tahun 1971 warga mulai menggunakan

metode destilasi untuk menyuling hasil fermentasi tetes tebu sehingga dapat

diperoleh Ciu dengan kadar etanol lebih tinggi dibandingkan dengan cara

terdahulu (Sabariyono, 2012).

Paguyuban produsen Ciu di Bekonang menyalurkan hasil produksi ke

produsen pabrik. Ciu yang disalurkan baik yang masih tingkat kadar 30-34% dan

yang sudah dimurnikan lagi kadarnya (90%). Hanya 3 produsen di Bekonang

yang memasok Ciu dengan kadar tinggi (90%) kepada produsen pabrik,

selebihnya memasok dengan kadar 30-34%. Hal ini dikarenakan untuk

mendapatkan Ciu dengan kadar yang lebih tinggi diperlukan tahapan lebih lanjut

yang memakan biaya lebih besar. Penelitian ini lebih diutamakan kepada para

produsen Ciu yang memproduksi dengan kadar 30-34% karena merupakan

mayoritas dilakukan warga Bekonang (Sabariyono, 2012).

Ciu yang dipasok kepada produsen pabrik ini digunakan untuk keperluan

medis yang nantinya digunakan masyarakat luas. Perlu diadakan penelitian

mengenai kandungan etanol dan kandungan lainnya. Sehingga dapat dipastikan

Ciu hasil produksi industri rumahan di desa Bekonang aman untuk digunakan

dalam keperluan Ciu medis.

Etanol dapat ditetapkan kadarnya secara kromatografi gas karena

senyawa ini merupakan senyawa organik yang mudah menguap serta tahan

terhadap pemanasan tinggi. Prinsip dasar penetapan kadar dengan kromatografi

gas adalah sampel yang diinjeksikan pada tempat injeksi diuapkan dengan

(21)

detektor. Ketika sampel melewati kolom, komponen-komponen sampel akan

mengalami pemisahan oleh fase diam dan menghasilkan resolusi. Komponen

senyawa terdeteksi oleh detektor dan dicatat oleh recorder. Hasil pencatatan akan

keluar berupa data kromatogram. Dari data kromatogram, kadar suatu senyawa

dapat dideteksi dengan menghitung luas atau tinggi kromatogram.

Penelitian penetapan kadar etanol dari Ciu hasil produksi industri

rumahan di daerah Sukoharjo menggunakan metode kromatografi gas yang telah

dilakukan optimasi. Sebelum melakukan penelitian penetapan kadar etanol hasil

produksi Ciu Bekonang perlu diadakan serangkaian pengujian lebih lanjut untuk

memastikan metode Kromatografi gas yang dipilih memiliki validitasi yang baik

dan dapat memisahkan sampel Ciu dari komponen lainnya dengan baik. Pengujian

tersebut didasarkan pada parameter akurasi, presisi, selektivitas, Limit of

Quantitation (LOQ) dan Limit of Detection (LOD), serta linearitas dan rentang

yang dihasilkan. Metode kromatografi gas dikatakan layak untuk digunakan dan

memiliki validitas yang baik apabila berdasarkan penggujian tersebut memenuhi

nilai-nilai parameter yang ditentukan, dan hasil yang diperoleh pada penggujian

(22)

1. Permasalahan

Apakah metode kromatografi gas yang telah dioptimasi untuk penetapan

kadar etanol hasil produksi “_Ciu” rumahan _{dusun Sentul desa Bekonang}

kabupaten Sukoharjo memenuhi parameter-parameter validasi yaitu selektivitas,

linearitas, akurasi, presisi, rentang, batas kuantitasi (LOQ), serta batas deteksi

(LOD)?

2. Keaslian Penelitian

Berdasarkan sumber informasi yang diperoleh pernah dilakukan

penelitian mengenai perbandingan metode kromatografi gas dan berat jenis pada

penetapan kadar etanol dalam minuman anggur (Mardoni, 2006). Namun sejauh

penelusuran belum dilakukan penelitian mengenai validasi metode penetapan

kadar etanol hasil produksi‘_Ciu’_{rumahan dusun Sentul kecamatan Sukoharjo.}

3. Manfaat Penelitian

a. Manfaat praktis

Dengan penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai

akurasi, presisi, selektivitas, sensitivitas, linearitas, batas kuantitasi (LOQ) serta

batas deteksi (LOD) metode kromatografi yang dipilih untuk menetapkan kadar

etanol hasil produksi industri rumahan desa Bekonang.

b. Manfaat metodologis

Penelitian ini dapat memberikan sumbangan ilmiah dan sebagai acuan

mengenai penetapan kadar dan profil kandungan etanol dalam Ciu dengan metode

(23)

B. Tujuan Penelitian

Untuk mengetahui metode kromatografi gas yang telah dioptimasikan

memenuhi parameter-parameter validasi dilihat dari nilai: selektivitas, linearitas,

akurasi, presisi, Limit of Quantitation (LOQ), Limit of Detection (LOD), serta

rentang sehingga dapat memberikan hasil yang dapat dipercaya untuk menetapkan

kadar etanol dan profil senyawa dari hasil produksi “_Ciu” industri rumahan di

(24)

6 BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Ciu produksi industri rumahan

Ciu hasil produksi industri rumahan di daerah Sukoharjo desa Bekonang

dibuat dari tetes tebu (molase) yang difermentasikan. Proses fermentasi dilakukan

dengan menggunakan ragi sepertiSaccharomyces cerevisiaeyang memetabolisme

gula tanpa menggunakan oksigen dan menghasilkan etanol, gas CO2, dan senyawa

lain. Untuk menghasilkan kadar Ciu 30-34% dilakukan proses destilasi (Widodo,

2004).

Tetes tebu (Molase) merupakan hasil samping yang berasal dari

pembuatan gula tebu (Saccharum officianarumL). Tetes tebu berupa cairan kental

dan diperoleh dari tahap pemisahan kristal gula. Molase tidak dapat lagi dibentuk

menjadi sukrosa mineral. Tingginya kandungan gula dalam molase sangat

potensial dimanfaatkan sebagai bahan baku etanol (Juwita, 2012).

B. Etanol

Etanol adalah cairan yang bening, tidak berwarna, mudah mengalir,

mudah menguap, titik didih 78oC, higroskopik, mudah terbakar dengan api biru

tanpa asap. Campur dengan air, kloroform, eter, gliserol, dan hampir semua

pelarut organik lainnya. Penyimpanan pada suhu 8-15oC, jauh dari api di dalam

wadah kedap udara. Dilindungi dari cahaya. Nama lain dari etanol adalah:

(25)

Etanol diperoleh dari peragian karbohidrat yang berkataliskan enzim.

Satu tipe enzim mengubah karbohidrat ke glukosa, kemudian ke etanol, tipe yang

lain menghasilkan cuka (asam asetat), dengan etanol sebagai zat antara

(Fessenden dan Fessenden, 1986).

C. Kromatografi Gas

Kromatografi gas adalah teknik yang dipilih untuk memisahkan

komponen-komponen senyawa organik yang mudah menguap dan tahan terhadap

pemanasan tinggi (Dean, 1995). Kromatografi gas menggunakan gas sebagai fase

geraknya. Ada dua jenis kromatografi gas, yaitu kromatografi gas-cair (KGC)

yang fase diamnya berupa cairan yang diikatkan pada suatu pendukung sehingga

solut akan terlarut dalam fase diam; dan kromatografi gas-padat (KGP) yang fase

diamnya berupa padatan dan kadang-kadang berupa polimerik (Rohman, 2009).

Komponen dasar kromatografi gas adalah sebagai berikut.

1. Tempat injeksi dan kemungkinan disertaisplitter

2. Suplai gas pembawa dengan pengatur tekanan dan pengendali aliran

3. Kolom

4. Detektor

5. Oven dengan pengendali termostatis yang juga bisa diprogram untuk

berbagai tingkat pemanasan

6. Recorderatau alat pencatat lainnya

(26)

Gambar 1. Skema Instrumen Kromatografi Gas (Miller dan McNair, 1998)

Senyawa-senyawa yang dapat ditetapkan dengan kromatografi gas sangat

banyak, namun ada batasan-batasannya. Senyawa tersebut harus mudah menguap

dan stabil pada temperatur pengujian, utamanya dari 50-300o_{C. Jika senyawa}

tidak mudah menguap atau tidak stabil pada temperatur pengujian, maka senyawa

tersebut bisa diderivatisasi agar dapat dianalisis dengan kromatografi gas

(Christian, 2004).

1. Sistem Injeksi Sampel

Fungsi tempat penginjeksian adalah untuk menyediakan jalan masuk

bagi syringe dan juga sampel ke dalam aliran gas pembawa dan untuk

menyediakan panas yang cukup untuk menguapkan sampel (Dean, 1995).

Sampel dimasukkan ke dalam ruang suntik melalui gerbang suntik yang

(27)

suntik harus dipanaskan tersendiri (terpisah dari kolom) dan biasanya 10-15oC

lebih tinggi daripada suhu kolom maksimum (Gandjar dan Rohman, 2007).

Pada dasarnya, ada 4 jenis injektor pada kromatografi gas, yaitu:

a. Injeksi langsung (direct injection), yang mana sampel yang

diinjeksikan akan diuapkan dalam injektor yang panas dan 100%

sampel masuk menuju kolom.

b. Injeksi terpecah (split injection), yang mana sampel yang diinjeksikan

diuapkan dalam injektor yang panas dan selanjutnya dilakukan

pemecahan.

c. Injeksi tanpa pemecahan (splitness injection), yang mana hamper

semua sampel diuapkan dalam injektor yang panas dan dibawa ke

dalam kolom karena katup pemecah ditutup.

d. Injeksi langsung ke kolom (on column injection), yang mana ujung

semprit dimasukkan langsung ke dalam kolom (Rohman, 2009).

2. Gas Pembawa

Gas pembawa merupakan fase gerak yang berfungsi untuk membawa

cuplikan melewati kolom. Gas yang biasa digunakan adalah helium, nitrogen,

hidrogen, dan argon. Gas-gas ini relatif tidak mahal, bisa didapatkan dengan

mudah, tidak begitu berbahya serta bersifat tidak reaktif sehingga tidak bereaksi

dengan molekul-molekul cuplikan pada tekanan dan suhu kromatografi (Christian,

(28)

Gas pembawa biasanya mengandung gas helium, nitrogen, hidrogen, atau

campuran argon dan metana. Pemilihan tipe gas ini tergantung penggunaan

spesifik dan jenis detektor yang digunakan. Helium merupakan tipe gas pembawa

yang sering digunakan karena memberikan efisiensi kromatografi gas yang lebih

baik (mengurangi pelebaran pita) (Gandjar dan Rohman, 2007).

3. Kolom

Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena di

dalamnya terdapat fase diam. Oleh karena itu, kolom merupakan komponen

sentral pada kromtatografi gas (Gandjar dan Rohman, 2007).

Pada kromatografi gas terdapat dua jenis kolom yang umumnya

digunakan yaitu: kolom kemas dan kolom kapiler

a. Kolom kemas

Kolom kemas terbuat dari gelas silanized, kolom dikemas dengan

partikel kecil yang dilapisi dengan fase diam cair. Diameter dalam kolom

umumnya antara 2-5 mm dengan panjang kolom yang bervariasi sekitar 2-3 m

(Watson, 1999).

Kolom dapat berbentuk apapun selama masih dapat mengisi tempat

pemanas. Biasanya kolom berbentuk U dan W tetapi yang paling sering

(29)

b. Kolom kapiler

Kolom kaplier terbuat dari campuran silika yang dilapisi dengan

polyamide untuk memberikan feleksibilitas kolom. Diameter dalam 0.15–0.5 mm

(Watson, 1999).

Jenis kolom kapiler berbeda dengan kolom kemas, dan kolom kapiler

lebih sering digunakan dikarenakan kemampuan kolom kapiler memberikan harga

jumlah plat terori yang sangat besar (> 300.000 Plat) (Gandjar dan Rohman,

2007).

Gambar 2. Kolom Kemas (a) dan Kolom Kapiler (b) (Miller dan McNair, 1998)

4. Fase Diam

Fase diam dipilih berdasarkan polaritas sampel yang akan diujikan

dengan prinsip “Like dissolve like”, oleh karena itu fase diam yang bersifat polar

(30)

diam yang bersifat nonpolar akan berinteraksi dengan senayawa yang lebih

nonpolar (Christian, 2004).

Tabel I. Jenis fase diam dan penggunannya (Harvey, 2000)

Fase diam Polaritas Nama Dagang Batas Temperatur

(o_C)

Aplikasi

Squalane Nonpolar Squalane 150 Senyawa - senyawa hidrokarbon alifatik dengan titik didih rendah

Apezion L Nonpolar Apezion L 300 Amida

Metil ester asam lemak Hidrokarbon alifatik titik Obat–obat derivatif Pestisida

Agak polar OV-17 375 Alkaloid

Obat-obatan

Agak polar OV-210 275 Alkaloid

Senyawa turunan asam amino Obat-obatan

Polar OV-225 275 Nitril

Pestisida

Untuk dapat memisahkan sampel, komponen-komponen sampel harus

dapat tertahan oleh fase diam. Dalam gas kromatografi, gas pembawa yang inert

tidak mempengaruhi selektitifitas sampel walaupun itu mempengaruhi resolusi.

Selektivitas sampel dapat divariasikan dengan merubah polaritas fase diam atau

(31)

5. Detektor

Detektor merupakan prangkat yang berada di ujung kolom tempat

keluarnya fase gerak yang membawa sampel yang telah dipisahkan menjadi

komponennya (Gandjar dan Rohman, 2007).

Detektor yang digunakan harus peka terhadap komponen-komponen

yang terpisahkan di dalam kolom serta mengubah kepekaannya menjadi sinyal

listrik. Kuat lemahnya sinyal bergantung pada laju aliran massa sampel bukan

pada konsentrasi sampel gas penunjang (Khopkar, 1990).

Detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Sensitivitas yang tinggi.

2. Tingkatnoiseyang rendah.

3. Respon yang linier pada rentang dinamis yang lebar.

4. Respon yang baik pada semua komponen organik.

5. Tidak sensitif pada variasi aliran dan perubahan suhu.

6. Stabil danruggedness.

(32)

Tabel II. Jenis detektor dan penggunaannya (Gandjar, 2007)

Jenis detektor Jenis sampel Batas deteksi Kecepatan alir (ml/ menit)

Gas pembawa H2 Udara

Hantar panas Senyawa umum 5-100 ng 15-30 -

-Ionisasi nyala Hidrokarbon 10-100 pg 20-60 30-40 200-500

Penangkap

elektron

Halogen organik,

pestisida 0,05-1 pg 30-60 - 70-100

Nitrogen-fosfor

Senyawa nitrogen

organik dan fosfat

organik

0,1-10 g 20-40 1-5 60-80

Fotometri nyala

(393nm)

Senyawa-senyawa

sulful 10-100 pg 20-40 50-70 100-150

Fotometri nyala

(393nm)

Senyawa-senyawa

fosfor 1-10 pg 20-40 120-170

-Fotoionisasi

elektronik Halogen, N, S

0,5 pg Cl

Selektif massa Sesuai untuk senyawa

apapun 10 pg- 10 ng 0,5-30 -

-Emisi atom Sesuai untuk elemen

apapun 0,1–20 pg 60-70 -

-Flame Ionization Detector (FID) mengukur jumlah atom karbon dan

dapat digunakan untuk mendeteksi hampir semua senyawa organik (Gandjar dan

Rohman, 2007). Detektor ini memberikan sensitifitas yang sangat baik, mampu

mengukur kadar komponen pada rentang konsentrasi part per billion (ppb)

(33)

6. Pengaturan Suhu

Kromatografi gas didasarkan pada 2 sifat senyawa yang dipisahkan yaitu:

kelarutan senyawa dalam cairan tertentu dan tekanan uapnya. Karena tekanan uap

berbanding langsung dengan suhu, maka suhu merupakan faktor utama dalam

kromatografi gas (Gandjar dan Rohman, 2007).

Suhu pada ruang injeksi, komponen kolom dan detektor harus dimonitor

dan diatur. Pada ruang injeksi, suhu yang diatur harus dapat menguapkan sampel

dengan cepat sehingga tidak terjadi dekomposisi dan fraksinasi sampel. Suhu pada

kolom tidak boleh melebihi titik didih sampel supaya sampel tetap berada pada

fase uap. Suhu pada detektor harus cukup tinggi supaya eluen tidak mengalami

kondensasi (Dean, 1995).

D. Validasi Metode

Validasi metode merupakan proses untuk menyatakan suatu prosedur

analisis yang digunakan pada pengujian tertentu sesuai dan dapat digunakan untuk

mendapatkan hasil yang dapat dipercaya dalam pengujian tersebut (Nash dan

Wachter, 2003).

Validasi metode dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis

bersifat akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analisis yang akan

dianalisis (Rohman, 2009).

Beberapa parameter analisis harus dipertimbangkan dalam validasi

(34)

deteksi dan batas kuantitasi. Menurut United States Pharmacopeia 30th tahun

2007, metode analisis dibedakan menjadi empat kategori, yaitu:

a. Kategori I, mencakup prosedur analisis kuantitatif, untuk menetapkan

kadar komponen utama bahan obat atau zat aktif dalam sediaan farmasi.

b. Kategori II, mencakup prosedur analisis kualitatif dan kuantitatif yang

digunakan untuk menganalisis impurities dalam sediaan farmasi.

c. Kategori III, mencakup prosedur analisis yang digunakan untuk

menentukan karakteristik penampilan suatu sediaan farmasi, misalnya

disolusi dan pelepasan obat.

d. Kategori IV, mencakup uji identifikasi.

Setiap kategori metode analisis memiliki persyaratan validasi yang

berbeda-beda seperti yang tercantum pada tabel III

Tabel III. Parameter analisis validasi metode (United States Pharmacopeial Convention, 2007) Parameter

kinerja analisis

Kategori I

Kategori II Kategori III Kategori IV Kuantitatif Batas Tes * = Mungkin diperlukan (tergantung sifat spesifik tes)

1. Selektivitas

Selektivitas merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk

mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya

komponen-komponen lain dalam matriks sampel seperti adanya pengganggu, prekursor

(35)

2. Linearitas dan Rentang

Linearitas merupakan kemampuan metode analisis untuk mendapatkan

hasil yang secara langsung atau dengan rumusan matematika yang sesuai,

proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel dalam rentang

area pengukuran yang diberikan sehingga memberikan nilai koefisien korelasi

yang lebih besar daripada nilai koefisien korelasi pada tabel statistik (United

States Pharmacopeial, 2007).

Koefisien korelasi (r) merupakan nilai yang digunakan untuk mengukur

baik buruknya liniearitas yang dimiliki. Suatu metode dikatakan memiliki nilai

linearitas yang baik jika nilai r > 0,99 atau r20,997 (Chan dkk, 2004).

Rentang merupakan interval konsentrasi pada level terendah dan level

tertinggi dalam suatu sampel yang dapat diukur secara kuantitatif dan dapat

diterima akurasi dan presisinya (Jones, 2002).

3. Akurasi

Akurasi dapat didefinisikan dengan tepat sebagai kedekatan suatu nilai

terukur dengan nilai sebenarnya, yaitu nilai yang diharapkan tanpa adanya

kesalahan. Akurasi dari suatu metode analisis umumnya dijelaskan sebagai

kedekatan nilai yang diamati (dianalisis) dengan nilai yang diharapkan (Jones,

2002).

Menurut United States Pharmacopeial Convention penentuan akurasi

dapat dilakukan dengan aplikasi metode analisis terhadap analit yang telah

diketahui kadarnya (misalnya suatu standar) atau dengan membandingkan suatu

(36)

recovery dari pengujian sejumlah analit dalam sampel yang diketahui jumlahnya

atau sebagai perbedaan antara nilai rata-rata tehadap nilai sebenarnya yang

diterima, bersama dengan taraf kepercayaan.

Tabel IV. Kriteria %recoveryyang diijinkan untuk konsentrasi analit yang berbeda (United States Pharmacopeial Convention, 2007)

Analit pada matrik

Presisi merupakan ukuran kedekatan antar serangkaian hasil analisis

yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran pada sampel homogen yang sama.

Konsep presisi diukur dengan simpangan baku. Komisi eropa membagi presisi

menjadi dua kategori yaitu keterulangan (repeatability) dan ketertiruan

(reproducibility) (Miller dan Ermer, 2005).

Koefisien variasi (KV) merupakan nilai yang digunakan untuk

menyatakan baik buruknya persisi yang dimiliki dalam penelitian. Suatu metode

dinyatakan memiliki presisi yang baik apabila memiliki KV ≤ 2% (Mulja dan

Hanwar, 2003).

Tabel V. Kriteria presisi yang diijinkan untuk konsentrasi analit yang berbeda (United States Pharmacopeial Convention,2007)

(37)

5. Limit of Quantitation(LOQ) danLimit of Detection(LOD)

Batas kuantitasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam

sampel yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan.

Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang

masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko (Miller dan

Ermer, 2005).

Ada dua pendekatan yang dapat digunakan dalam menentukan batas

kuantitifikasi dan batas deteksi, yaitu pendekatan signal-to-noise dan pendekatan

standard deviation. Pendekatan signal-to-noise diartikan konsentrasi dari sampel

akan memberikan rasio signal-to-noise 10:1 untuk batas kuantitasi dan rasio

signal-to-noise 3:1 untuk batas deteksi. Pendekatan standard deviationdilakukan

dengan menghitung respon standar deviasi pada konsentrasi rendah denggan

menggunakan persamaan QL = 10 x dan DL 3 x (Chan dkk, 2004).

E. Landasan Teori

Produsen ‘Ciu’ di desa Bekonang menggunakan tetes tebu (molase) sebagai bahan baku produksi. Ciu dihasilkan dengan cara memfermentasikan tetes

tebu dengan katalis ragi Saccharomyces cerevisiae dan yang dapat memetabolis

gula tanpa bantuan oksigen dan menghasilkan etanol, gas CO2dan senyawa lain.

Etanol merupakan senyawa golongan Ciu yang memiliki titik didih 70oC,

mudah menguap dan tahan terhadap pemanasan tinggi. Berdasarkan sifat fisika

(38)

kromatografi gas. Metode kromatografi gas merupakan metode analisis dengan

pemisahan senyawa berdasarkan perbedaan titik didih antar komponen dalam

sampel dan terjadi pada suhu kolom yang tinggi, umumnya digunakan untuk

anailsis senyawa-senyawa yang mudah menguap, titik didih 50–300oC, serta tahan

terhadap pemanasan tinggi.

Dengan dikondisikan berdasarkan settingan hasil optimasi, metode

kromatografi Gas yang digunakan untuk penetapan kadar etanol dalam minuman

keras ‘Ciu’ akan memberikan hasil yang tepat dan dapat dipercaya. Untuk

mengetahui kemampuan pemisahan sampel dengan metode kromatografi gas yang

telah dioptimasikan untuk digunakan dalam mengukur kadar etanol, perlu

dilakukan validasi metode Kromatografi Gas. Parameter validasi metode

didasarkan antaralain pada nilai linaritas, akurasi, presisi, batas kuantifikasi

(LOQ), batas deteksi (LOD), linearitas, serta rentang. Nilai linearitasi dianalisis

berdasarkan koefisien determinasi (r) > 0,99, nilai perolehan kembali berdasarkan

mean % recovery antara 98–102% dan presisi dianalisis berdasarkan CV

(Coefficient of Variation) ≤2%, batas kuantifikasi dianalisis berdasarkan LOD ≤

(39)

F. Hipotesis

Berdasarkan landasan teori, dapat disusun hipotesis bahwa metode

kromatografi gas untuk penetapan kadar etanol hasil produksi Ciu rumahan dusun

Sentul desa Bekonang memiliki validitas yang baik pada parameter akurasi,

persisi, selektivitas, batas kuantifikasi (LOQ), batas deteksi (LOD), serta linearitas

(40)

22 BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian noneksperimental deskriptif

dikarenakan tidak dilakukan manipulasi terhadap subjek uji dan hanya

mendeskripsikan keadaan yang ada.

B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah sistem Kromatografi Gas yang

telah dioptimasi, yaitu suhu dan tekanan.

2. Variabel tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah parameter validasi yaitu:

selektivitas, akurasi, presisi, Limit of Quantitation (LOQ), Limit of Detecion

(LOD), serta linearitas dan rentang.

3. Variabel pengacau terkendali

Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah:

Pelarut, untuk mengatasinya digunakan pelarut pro analisis dengan

(41)

C. Definisi Operasional

1. Sampel yang digunakan adalah Ciu hasil produksi fermentasi tetes tebu yang

sudah didestilasi dan disaring sebanyak tiga kali penyaringan.

2. Penetapan kadar digunakan sistem kromatografi gas dengan cara

penginjeksian sampel, suhu injektor, suhu kolom, suhu detektor dan kecepatan

alir gas pembawa berdasarkan hasil optimasi.

3. Parameter validasi yang digunakan adalah selektivitas, linearitas, akurasi,

presisi,Limit of Quantitation(LOQ),Limit of Detection(LOD) serta rentang.

4. Kadar etanol dinyatakan dalam satuan % v/v.

D. Bahan-bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah Ciu hasil pengolahan

fermentasi tetes tebu, baku etanol p.a.(E. Merck), n-butanol p.a (E. Merck),

aquabidest (Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma), gas hydrogen HP

99,995% (CV Perkasa), udara tekan HP 99,9995% (CV Perkasa), gas nitrogen HP

99,9995% (CV Perkasa).

E. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi seperangkat alat

Kromatografi Gas (HP 5890) dengan Flame Ionization Detector (FID), kolom

kapiler CP-Wax (25 m, i.d. 0,32 mm), alat-alat gelas yang umum dalam analisis

(42)

F. Tata Cara Penelitian 1. Pemilihan dan pengambilan sampel

Dipilih sebanyak 14 dari total 70 populasi produsen Ciu di desa

Bekonang secara acak melalui sistem pengundian. Produsen Ciu yang terpilih

secara acak akan diambil sampel Ciu sebanyak 600,0 ml. Pengambilan dilakukan

sebanyak tiga kali dalam satu minggu pengambilan sampel.

2. Preparasi sampel

Sampel Ciu yang diperoleh masing - masing diambil sebanyak 100,0 ml

dan dimasukkan ke dalam wadah. Sampel di dalam wadah dicampur homogen dan

diambil sebanyak 100,0 ml.

Sampel homogen disaring dengan kertas whatman no 1 agar lebih jernih

kemudian sampel disimpan dalam botol tertutup untuk menghindari penguapan.

3. Pembuatan larutan baku

Diambil sejumlah 200 µl, 400 µl, 600 µl, 800 µl, dan 1000 µl etanol p.a

dan masing-masing dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 ml kemudian

ditambahkan standar internal larutan n-butanol sejumlah 600 µl ke dalam

masing-masing labu ukur, diencerkan dengan aquabidest hingga tanda batas dan gojog

homogen sehingga diperoleh konsentrasi 2 % v/v, 4 % v/v, 6 % v/v, 8 % v/v, dan

10 % v/v. Replikasi dilakukan sebanyak lima kali.

4. Penetapan kurva baku

Diambil sebanyak 1 mikroliter (µl) masing-masing konsentrasi seri

larutan baku dan kemudian suntikkan ke dalam kolom melalui tempat injeksi ke

(43)

kromatogram etanol dan n-butanol. Kurva baku dibuat dengan memplotkan luas

puncak dari etanol/n-butanol vs kadar etanol lalu dicari persamaan regresi

linearnya.

5. PenentuanrecoverydanCoefficient of Variations(CV) larutan baku

Diambil sejumlah 200 µl, 600 µl, dan 1000 µl etanol p.a dan diberi

perlakuan seperti pada poin F.3 sehingga diperoleh konsentrasi 2 % v/v, 6 % v/v,

dan 10 % v/v, dilakukan replikasi sebanyak lima kali . Hitung kadar terukur

dengan menggunakan persamaan kurva baku yang telah dibuat pada poin F.4.

Recoverydan CV ditentukan berdasarkan data yang diperoleh.

6. PenentuanLimit of QuantitationdanLimit of Detectionbaku

Dihitung nilai LOQ dan LOD baku dengan menggunakan persamaan

sebagai berikut:

LOQ = dan LOD =

Dimana Sb merupakan simpangan baku dari kelima replikasi seri larutan

baku dan s merupakan slope dari persamaan regresi linear yang paling

(44)

G. Analisis Hasil 1. Selektivitas

Selektivitas dinyatakan dengan nilai resolusi yaitu kemampuan memisah

antara komponen-komponen sampel. Selektivitas dikatakan baik jika nilai resolusi

(Rs) lebih besar atau sama dengan 1,5.

2. Linearitas

Linearitas metode analisis dinyatakan dengan nilai koefisien korelasi.

Suatu metode analisis dikatakan memiliki linearitas yang baik jika nilai r > 0,999.

3. Akurasi

Akurasi metode analisis dinyatakan dengan % recovery atau perolehan

kembali yang dihitung dengan cara:%recovery= 100%_.

4. Presisi

Presisi dinyatakan dengan % CV (koefisien korelasi) yang dihitung

dengan cara: % CV = 100%_.

5. Limit Of Ouantitation(LOQ)

LOQ dapat dihitung dengan rumus: LOQ = , dimana SD merupakan

simpangan baku dan S merupakanslopekurva baku.

6. Limit Of Detection(LOD)

(45)

7. Rentang

Rentang merupakan interval konsentrasi analit yang diperoleh pada level

rendah dan level tinggi yang dapat diukur secara kuantitatif dan dapat

(46)

28

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pemilihan Sampel

Penelitian ini menggunakan sampel Ciu dari hasil produksi industri

rumahan yang terdapat di dusun Sentul desa Bekonang, Kabupaten Sukoharjo,

Jawa Tengah. Dari total 70 produsen yang ada memproduksi Ciu, dilakukan

pengambilan sampel secara acak dengan melakukan pengundian terhadap 70

produsen dan sebanyak 14 dari populasi produsen dijadikan sebagai tempat

pengambilan sampel. Melalui hasil pengundian acak diperoleh 14 rumah produksi

yang dijadikan tempat pengambilan sampel. Masing-masing industri rumahan

yang terpilih diambil sampel akohol sebanyak 600,0 ml selama tiga kali masa

produksi dalam satu minggu. Dengan penggundian ini, sampel yang terpilih

merupakan sampel yang repersentatif/mewakili dari populasi yang ada karena

setiap rumah produksi memiliki kesempatan yang sama untuk terambil dalam

pengundian.

B. Preparasi Sampel

Untuk mengecilkan jumlah sampel maka dari sampel 600,0 ml dari

masing-masing rumah produksi yang terpilih diambil sebanyak 100,0 ml dari

setiap bagian wadah kemudian dicampur menjadi satu sehingga diperoleh 1400,0

ml sampel dari berasal dari 14 rumah produksi. Untuk pengujian, pada penelitian

(47)

wadah. Pada penelitian ini tidak dilakukan destilasi untuk mendapat sampel yang

lebih murni karena ingin diketahui kadar Ciu dan kandungan senyawa lain yang

terdapat dalam sampel.

C. Pembuatan Larutan Baku

Pada penelitian ini menggunakan 5 seri konsenterasi larutan baku etanol

yaitu 2 % v/v, 4 % v/v, 6 % v/v, 8 % v/v, dan 10 % v/v. Pemilihan seri konsentrasi

ini disesuaikan dengan respon detektor terhadap sinyal (peak) yang dihasilkan dan

tidak tergganggun oleh noise yang dihasilkan alat. Selain itu pemilihan seri

konsentrasi ini juga bertujuan agar respon analit dalam sampel dapat masuk dalam

respon seri larutan baku yang dibuat, sehingga persamaan kurva baku yang

diperoleh dapat digunakan dalam penetapan kadar analit dalam sampel.

Pada optimasi diketahui bahwa AUC sampel yang dihasilkan tidak

memberikan hasil yang stabil dikarenakan jumlah sampel yang diinjeksikan tidak

selalu tepat dengan sistem injeksi sampel secara manual. Selain itu pengguapan

sampel dalam instrumen kromatografi gas tidak bisa diatur sehingga kecepatan

penguapan sampel pada setiap injeksi berbeda-beda. Oleh karena itu diperlukan

suatu pengkoreksi berupa standar internal, pada penelitian ini digunakan faktor

pengkoreksi standar internal n-butnol.

D. Penetapan Kurva Baku

Tujuan penetapan kurva baku adalah untuk mendapatkan persamaan

(48)

penetapan akurasi dan presisi. Penetapan kurva baku etanol dilakukan replikasi

tiga kali untuk mendapatkan korelasi yang paling baik, yaitu nilainya yang paling

mendekati 0,99 karena menunjukkan adanya korelasi yang linear antara kosentrasi

dengan respon yang dihasilkan, yaitu berupa Area Under Curve(AUC).

Tabel VI. Data replikasi seri baku etanol

Seri baku

(v/v)

Replikasi I Replikasi II Replikasi III Replikasi IV Replikasi V

AUC

2% 0,178 0,739 0,187 0,784 0,173 0,880 0,171 0,880 0,170 0,904 4% 0,407 0,829 0,434 0,806 0,415 1,020 0,437 1,020 0,426 0,962 6% 0,628 0,730 0,601 0,725 0,616 0,888 0,614 0,888 0,647 0,977 8% 0,804 0,730 0,755 0,705 0,770 0,882 0,758 0,882 0,825 0,906 10% 0,884 0,588 1,096 0,810 0,917 0,817 0,917 0,817 1,116 0,956

Penggunaan standar internal n-butanol pada penelitian ini sebagai faktor

pengkoreksi terhadap kehilangan analit dalam sampel pada saat pengujian. Pada

kromatografi gas, analit dalam sampel pada saat pengujian sulit untuk

mendapatkan hasil penggukuran yang sama. Pada saat preparasi sampel dapat

terjadi kesalahan dalam pengambilan sampel, serta pada saat injeksi, volume

sampel yang masuk ke dalam injektor dan kolom tidak dapat dikendalikan

sehingga bisa mempengaruhi perbedaan hasil pengukuran analit.

Dengan penggunaan standar internal n-butanol, dapat dihitung

perbandingan/rasio Area Under Curve (AUC) etanol:n-butanol sehingga dapat

(49)

Tabel VII. Data rasio AUC

Baku etanol

Replikasi I Replikasi II Replikasi III Replikasi IV Replikasi V

Seri

10% 1,435 10% 1,353 10% 1,122 10% 1,117 10% 1,167

A -0,0738 A -0,0223 A -0,0362 A -0.0178 A -0,0536

B 0,1500 B 0,1381 B 0,1159 B 0.1169 B 0,1214

r 0,9981 r 0,9993 r 0,9981 r 0,9971 r 0,9996

Kurva baku yang digunakan adalah kurva baku yang memiliki linearitas

yang paling baik. Linearitas menyatakan adanya hubungan respon pengukuran

yang secara langsung proporsional terhadap konsentrasi (jumlah) analit. Suatu

kurva baku memiliki linearitas yang baik apabila memiliki nilai r > 0,99 atau

(Chan dkk, 2004). Pada tabel II di atas dapat dilihat bahwa kurva baku semua

replikasi telah memenuhi persyaratan linearitas yang baik, namun dipilih kurva

baku replikasi V karena memiliki nilai korelasi yang paling mendekati 1, sehingga

nantinya persamaan kurva baku replikasi V yang digunakan dalam penetapan

kadar. Persamaan kurva bakunya yaitu, y = 0,1214x – 0,0536 dengan r = 0,9996.

Hubungan antara konsentrasi etanol dengan AUC dapat dilihat pada gambar

(50)

Gambar 3. Hubungan antara konsentrasi etanol dengan rasio AUC (replikasi III)

E. Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis bertujuan untuk membuktikan bahwa metode

analisis yang digunakan telah memenuhi persyaratan validitas sehingga dapat

memberikan hasil analisis yang dapat dipercaya. Berdasarkan United States

Pharmacopeial convention, penelitian ini dikategorikan ke dalam kategori II yang

mencakup prosedur analisis kualitatif dan kuanitatif dalam menganalisis

impurities dalam sediaan farmasi sehingga parameter validasi pada penelitian ini

meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, rentang,limit of detection,limit of

quantitation, dan batas kuantitasi. Validasi dilakukan dengan tiga seri konsentrasi

dan direplikasikan sebanyak lima kali. Konsentrasi yang digunakan merupakan

kosentrasi rendah, sedang, dan tinggi dari konsentrasi seri baku yang dibuat yaitu

0,2% v/v, 0,6% v/v, dan 1,0% v/v. Digunakan tiga konsentrasi tersebut karena

mewakili konsentrasi seri baku lainnya.

y = 0.1214x - 0.0536

(51)

1. Selektivitas

Selektivitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mengukur

dengan akurat respon analit di antara seluruh komponen sampel yang mungkin

ada dalam matriks sampel. Selektivitas dinyatakan dengan parameter resolusi

yaitu dengan mengukur kemampuan memisah antara peak baku etanol dengan

peakstandar internal n-butanol.

Menurut Grob dan Eugene (2004), jika dalam suatu pengujian,

pemisahan antara dua senyawa yang muncul pada kromatogram berjarak 4 s maka

nilai resolusi yang digunakan adalah Rs = 1, dan jika pemisahan dua senyawa

pada kromatogram berjarak 6 s maka nilai resolusi yang digunakan adalah Rs ≥

1,5. Pada penelitian ini jarak yang dihasilkan pada pemisahan etanol dan

n-butanol lebih dari 6 s, maka digunakan parameter nilai resolusi Rs≥ 1,5.

Tabel VIII. Perbandingan waktu retensi (tR) baku etanol dan standar internal n-butanol Konsentrasi seri

larutan baku etanol

(v/v)

tRetanol tRn-butanol Resolusi

2% 254 324 15,7

6% 254 324 12,9

10% 254 324 14,0

Berdasarkan tabel di atas dapat dilihat bahwa resolusi antar peak analit

(etanol) dengan peak terdekat telah memenuhi persyaratan resolusi yang baik

(52)

Peak Start tR Max tR End tR

1 252 254 256

2 321 324 326

Gambar 4. Kromatogram pengukuran sampel pada kondisi optimal

1 254 256 260

2 324 327 329

Gambar 5. Kromatogram baku etanol konsentras 600µL

Berdasarkan kedua gambar, dapat dilihat kromatogram hasil pengukuran

baku dan kromatogram hasil pengukuran sampel pada kondisi optimasi

menunjukkan waktu retensi yang tidak jauh berbeda. Dengan demikian dapat

dipastikan peak 1 pada kromatogram sampel merupakan etanol dan peak 2

(53)

merupakan standar internal n-butanol. Oleh karena itu, metode kromatografi gas

yang digunakan untuk pengukuran kadar etanol mempunyai selektivitas yang baik

dan dapat memisahkan komponen dalam sampel dengan baik.

2. Linearitas

Linearitas suatu metode menunjukkan proporsionalitas dari nilai kadar

terhadap respon (absorbansi, luas area, tinggi puncak). Linearitas ditunjukkan oleh

nilai koefisien korelasi (r). Menurut Chan dkk (2004), suatu metode analisis

dikatakan memenuhi parameter linearitas yang baik apabila memiliki nilai

korefisien korelasi r > 0,99.

Berdasarkan data yang diperoleh dari pembuatan kurva baku, didapatkan

nilai untuk replikasi I = 0,9981 ; replikasi II = 0,9993 ; replikasi III = 0,9981,

replikasi IV = 0,9971; dan replikasi V = 0,9996. Nilai r untuk kelima replikasi

tersebut sudah memenuhi persyaratan dan dipilih nilai r yang paling mendekati 1

yaitu nilai r pada replikasi V. Oleh karena itu, metode Kromatografi Gas ini telah

memenuhi persyaratan linearitas yang baik untuk menetapkan kadar etanol dalam

sampel Ciu hasil produksi industri rumahan di Dusun Bekonang.

3. Akurasi

Akurasi dinyatakan sebagai % recoveryatau % perolehan kembali. Nilai

% recovery diperoleh dengan cara membandingkan kadar yang terukur terhadap

kadar sebenarnya. Penetapan % recovery dilakukan dengan mengukur tiga seri

(54)

kosentrasi rendah (2% v/v), seri baku konsentrasi sedang (6% v/v), dan seri baku

konsentrasi tinggi (10% v/v). Ketiga seri konsentrasi baku ini dipilih karena

dianggap mewakili kelima seri konsentrasi baku yang diggunakan.

Berdasarkan United States Pharmacopeial Convention untuk kategori

pengujian dengan jumlah analit pada matriks sampel lebih besar dari 10% maka

rentang % perolehan kembali yang diijinkan pada penelitian ini adalah 98-102%

sehingga metode tersebut dapat dikatakan memiliki parameter akurasi yang baik.

Tabel IX. Data %recovery

Kadar

2% 105,10 103,10 105,10 104,10 101,10 103,7

6% 103,77 102,60 101,17 100,76 100,76 101,8

10% 101,30 101,80 102,50 101,70 102,50 101,9

Berdasarkan tabel di atas, nilai recovery yang masuk pada rentang

akurasi yang baik (98-102%) adalah pada konsentrasi level sedang (6% v/v) dan

konsetrasi level tinggi (10% v/v).

4. Presisi

Presisi merupakan parameter untuk menyatakan metode yang digunakan

dalam suatu penelitian dapat memberikan hasil yang reprodusibel atau

memberikan keterulangan hasil yang sama dalam setiap pengujian dengan kondisi

dan perlakuan yang sama. Presisi dinyatakan dengan Coefficient of Variation

(CV) yang menunjukkan kedekatan nilai data yang satu dengan yang lain dalam

(55)

Berdasarkan United States Pharmacopeial Convention untuk kategori

pengujian dengan jumlah analit pada matriks sampel sama dengan atau lebih besar

dari 1% maka %Coefficient of Variation(CV) yang diijinkan adalah CV≤ 2.

Tabel X. DataCoefficient of Variation(CV) Kadar etanol

(V/V)

Rata-rata kadar (v/v) SD CV (%)

2% 2,072% 0,034 1,62

6% 6,110% 0,077 1,26

10% 10,19% 0,061 0,59

Dari hasil yang diperoleh dapat dilihat pada konsentrasi 2% v/v, 6% v/v,

dan 10% v/v telah memenuhi syarat presisi yang baik dengan nilai CV kurang dari

2%. Dengan demikian, metode ini memiliki presisi yang baik dalam menetapkan

kadar etanol.

5. LOQ dan LOD

Nilai batas kuantifikasi (LOQ) yang diperoleh adalah 0,4047% v/v.

Berdasarkan nilai tersebut kadar sampel yang digunakan pada tidak boleh lebih

rendah dari kadar 0,4047%v/v, sehingga pada penelitian ini penggunaan kadar

terkecil 2%v/v masih memenuhi persyaratan akurasi dan presisi.

Nilai batas deteksi (LOD) yang diperoleh adalah 0,2747% v/v.

Berdasarkan nilai tersebut dapat diketahui jika metode kromatografi gas yang

digunakan masih dapat mengukur etanol sampai batas kadar terkecil 0,2747% v/v

(56)

6. Rentang

Rentang merupakan interval antara konsentrasi analit pada level rendah

dan level tinggi dalam suat sampel yang masih memenuhi parameter akurasi,

presisi dan linearitas. Rentang yang ditetapkan dalam pengujian dapat digunakan

untuk mengarahkan jumlah sampel saat penetapan kadar ke level sampel yang

memenuhi rentang sehingga dapat memberikan hasil dengan akurasi dan presisi

yang baik.

Gambar 6. Rentang konsentrasi pengukuran etanol

Pada gambar tersebut dapat dilihat bahwa pada kosentrasi sedang (6%

v/v) dan konsentrasi tinggi (10% v/v) memenuhi parameter akurasi dan presisi

sehingga penetapan kadar etanol dapat dilakukan pada rentang konsentrasi

tersebut.

Konsentrasi etanol (% v/v) Akurasi

(57)

39 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Metode Kromatografi Gas dengan instrumen HP 5890, kolom Cp-Wax

52 CB (25m, i.d. 0,32mm) fase diam polyethylene glycol, gas pembawa nitrogen

(N2), tekanan kolom 10 psi, suhu kolom terprogram (gradient temperature)

memiliki selektivitas, linearitas, dan presisi yang baik pada konsentrasi 6-10%

v/v, nilai LOQ yang diperoleh adalah 0,4047% v/v dan nilai LOD 0,2747% v/v.

Berdasarkan hasil tersebut, maka metode kromatografi gas ini memiliki validitas

yang baik untuk menetapkan kadar etanol yang terdapat pada hasil produksi Ciu

oleh produsen di dusun Sentul desa Bekonang kabupaten Sukoharjo.

B. Saran

Perlu dilakukan penetapan kadar etanol yang terdapat pada hasil produksi

Ciu oleh produsen industri rumahan di desa Bekonang kecamatan Sokoharjo

(58)

40

DAFTAR PUSTAKA

Adamovics, 1997, Chromatographic Analysis of Pharmaceuticals, 2nd Edition, Marcel Dekker, New York, pp. 5–11.

Chan, C.C., Lam, H., Lee, Y.C., and Zhang, X., 2004, Analytical Method Validation and Instrumen Performance Verification, Jhon Wiley & Sons, Inc., USA, Pp. 12–26.

Christian, G. D., 2004 Analytical Chemistry, Sixth Edition, Jhon wiley & Sons, Inc., United States of America, pp. 65–66, 575–588.

Dean, J. A., 1995, Analyticl Chemistry Handbook, Mc Graw-Hill, Inc., United States of America, pp. 5.2–5.22, 5.32, 5.46, 5.50–5.51.

Fessenden, R. J. dan Fessenden, J. S., 1986. Kimia Organik, Edisi Ketiga, diterjemahkan oleh Aloysius Hadyana Pudjaatmaka, Penerbit Erlangga, Jakarta, 267.

Gandjar, I.G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 420–429, 433.

Grob. L. R., and Eugene. F. B., 2004, Modern Practice of Gas Chromatography, Fourth Edition, Jhon wiley & Sons, Inc., United States of America, pp 98–99.

Harmita, 2004, Petunjuk Validasi Metode dan Cata Perhitungannya, Departemen Farmasi-FMIPA UI, Jakarta.

Harvey. D., 2000, Modern Analytical Chemistry, McGraw Hillcompanies, Inc, USA. pp. 536–576.

Jones, D. S., 2002, Pharmaceutical Statistics, diterjemahkan oleh Hesty Utami Ramadaniati dan H. Harrizul Rivai, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, pp. 31–32.

Juwita, R., 2012,Studi Produksi Ciu Dari Tetes Tebu (Saccharum Officinarum L) Selama Proses Fermentasi. Skripsi Universitas Hasanudin Makasar, 3.

Khopkar, S. M., 1990, Konsep Dasar Analitik, diterjemahkan oleh A. Saptorahardjo, Penerbit Universitas Indonesia, Jakarta, pp. 163–165.

(59)

Miller. J. H., and Ermer. J., 2005,Method Validation in Pharmaceutical Analyisis, Wiley-VCH Varleg GmBH & Co. KGaA, Germany, pp. 4 – 5, 21 –

25, 63, 80–81, 99.

Mulja, H. M., dan Suharman, 1995, Analisis Instrumenal, Airlangga University Press, Surabaya, pp. 102.

Mulja, H.M. dan Hanwar, 2003, Prinsip Cara Berlaboratorium yang Baik (Good Laboratory Practice),Majalah Farmasi Airlangga, Vol III, No.2, 71–

76.

Nash. R. A., and Wachter. A. H., 2003, Pharmaceutical Process Validatiion, Third Edition, Marcel Dekker, Inc., New York.

Pharmaceutical Press, 2009, Martindale The Complete Drug Refrence, 36th Edition, edited by Kathleen Parfitt, Pharmaceutical Press, London, UK, pp. 1625, 2024.

Rohman, A., 2009,Kromatografi untuk Analisis Obat, Edisi Pertama, Graha Ilmu, Yogyakarta, pp 183, 188, 217–240.

United States Pharmacopeial Convention, 2007,The United States Pharmacopeia,

30th edition, United States Pharmacopeial Convention Inc., New York.

Waskito, A. A. P., 2014, Optimasi Metode Penetapan Kadar Etanol Dan Profil Senyawa Yang Terdapat Dalam Hasil Produksi “Ciu” Rumahan Dusun Sentul Kabupaten Sukoharjo Dengan Metode Kromatografi Gas,Skripsi (In Progress), Universitas Sanata Dharma.

Watson, D. G., 1999,Pharmaceutical Analysis A Textbook for Pharmacy Students and PharmaceuticalChemists, Churchill Livingstone, London, United Kingdom, pp. 211–212.

Widodo, Arif, 2004, Tinjauan Sosiologi Kesehatan Mengenai Kebiasaan

Minu-Minuman Keras (“CiuBekonang”) Di Daerah Sukoharjo dan Upaya

(60)

(61)

(62)

(63)

(64)

(65)

Lampiran 3. Parameter Instrumen Kromatogrfi Gas

Parameter diperoleh berdasarkan hasil optimasi instrumen Kromatografi Gas

Gas Nitrogen, Hidrogen, Udara

Column Cp-Wax 52 CB, 25m x

032mm

Column Head Presure 10 psi

Press. Udara 4 bar

Press. Hidrogen 2.2 bar

Press. Nitrogen 1.5 bar

Split Vent 99.0 ml/min

Purge Vent 3.22 ml/min

Flow Total Flow Udara Flow Hidrogen

Flow Nitrogen Carier

Init temp 70

Init time 2 menit

Rate 30 deg/min

Fnal temp 220

Final Time 2 menit

Injector B 200

Detector A 250

Range 2

(66)

Lampiran 4. Kromatogram seri baku etanol replikasi I 1. Kromatogram seri baku etanol 2%

1 254 256 259

2 324 326 326

2. Kromatorgam seri baku etanol 4 %

1 254 256 263

(67)

3. Kromatogram seri baku etanol 6 %

1 254 256 258

2 323 326 328

1 254 255 257

(68)

1 254 256 258

2 324 326 328

Lampiran 5. Kromatogram seri baku etanol replikasi II 1. Kromatogram seri baku etanol 2%

1 255,1 256,2 258,6

(69)

2. Kromatogram seri baku etanol 4%

1 254 256 257

2 324 326 329

1 253 255 258

(70)

1 253 255 262

2 323 325 328

1 254 255 265

(71)

Lampiran 6. Kromatogram seri baku etanol replikasi III 1. Kromatogram seri baku etanol 2%

1 253 254 256

2 323 325 327

1 254 256 262

(72)

1 254 255 258

2 324 326 329

1 254 255 258

(73)

1 253 255 258

2 323 325 328

Lampiran 7. Kromatogram seri baku etanol replikasi IV 1. Kromatogram seri baku etanol 2 %

1 255 258 262

(74)

1 255 257 259

2 325 327 330

1 255 257 261

(75)

1 254 257 259

2 324 326 328

1 254 257 265

(76)

Lampiran 8. Kromatogram seri baku etanol replikasi V 1. Kromatogram seri baku etanol 2%

1 253 255 258

2 323 326 329

1 254 255 259

(77)

1 254 255 259

2 324 327 329

1 254 256 259

(78)

Peak Start tR Max tRtR End tR

1 254 256 259

2 324 327 329

Lampiran 9. Kromatogram validasi metode 1. Konsentrasi rendah

(79)

1 254 255 257

2 324 326 328

b. Replikasi II

1 253 255 258

2 323 325 327

c. Replikasi III

1 253 255 257

(80)

d. Replikasi IV

1 253 255 258

2 323 325 329

e. Replikasi V

1 254 255 258

(81)

2. Konsentrasi sedang a. Replikasi I

1 254 256 258

2 324 326 328

b. Replikasi II

1 254 256 257

(82)

1 254 256 258

2 324 326 328

d. Replikasi IV

1 254 256 262

(83)

e. Replikasi V

1 254 256 260

2 324 327 329

3. Konsentrasi tinggi a. Replikasi I

1 254 256 258

(84)

b. Replikasi II

1 254 256 258

2 324 326 328

1 253 255 260

(85)

d. Replikasi IV

1 254 256 265

2 323 326 328

e. Replikasi V

1 254 256 259