BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tanaman Gambir
Gambir (Gambar 2.1.) dikenal dengan nama latin Uncaria gambir Roxb. , nama English; Cat’s Claw, nama Spanish; Uña de Gato atau nama India; Vilcacora. Nama daerah untuk gambir di Indonesia yaitu gambir. (Rukmana, 1994). Spesis-spesis gambir yaitu Uncaria elliptica R.Br. & G. Don (Malaysia), Uncaria gambir Roxb. – Gambir (Indonesia), Uncaria guianensis J.F.Gmel. (Guyana), Uncaria rhynchophylla (Miq.) Jacks. (China), Uncaria tomentosa DC - Cat's Claw (South America).
Taksonomi tanaman ini dapat dilihat pada table 2.1.
Tanaman gambir termasuk dalam suku kopi-kopian. Taksonomi tanaman ini dapat dilihat pada table 2.1. Bentuk keseluruhan dari tanaman ini seperti pohon bougenvil, yaitu merambat dan berkayu. Komponen kimia gambir sebagai berikut :
1. Catechin biasanya disebut juga dengan asam catechoat dengan rumus kimia C15H14O6, tidak berwarna, dan dalam keadaan murni sedikit tidak larut dalam air dingin
tetapi sangat larut dalam air panas, larut dalam alkohol dan etil asetat, hampir tidak larut dalam koloroform, benzen dan eter.
2. Asam Catechu Tannat merupakan anhidrat dari catechin, dengan rumus kimia C15H12O5. Apabila catechin dipanaskan pada temperatur 110oC atau dengan cara
memanaskan pada larutan alkali karbonat, ia akan kehilangan satu molekul air dan berubah menjadi Asam Catechu Tannat yang berupa serbuk berwarna coklat kemerah-merahan, cepat larut dalam air dingin, alkohol, tidak berwarna dalam larutan timah hitam asetat.
3. Pyrocatechol merupakan hasil penguraian dari zat lain seperti catechin dengan rumus molekul C6H6O2, bisa larut dalam air, alkohol, eter, benzen, dan kloroform. Jika
dipanaskan akan membentuk catechol; membentuk warna hijau dengan FeCl3;
membentuk endapan dengan Brom; larutannya dalam air cepat berwarna coklat; dapat mereduksi perak amoniakal dan Fehling.
4. Gambir Flouresensi merupakan bagian kecil dari gambir dan memberikan flouresensi yang berwarna hijau, dapat dilihat apabila larutan gambir dalam alkohol dikocok dengan petrolium eter dalam suasana sedikit basa.
5. Catechu Merah yaitu gambir yang memberikan warna merah.
6. Quersetin adalah suatu zat yang berwarna kuning yang terdapat dalam tumbuh-tumbuhan dan berupa turunan flavonol dengan rumus molekul C15H10O7, disebut huga
dengan melatin atau supheretin dan larut dalam asam asetat glasial yang memberikan warna kuning, serta larut dalam air dan alkohol, memberikan warna hijau dengan Fe3+ dan akan berubah menjadi warna gelap dengan pemanasan.
7. Fixed Oil merupakan minyak yang sukar menguap.
8. Lilin (malam) terletak pada lapisan permukaan daun gambir. Merupakan monoester dari suatu asam lemak dan alkohol.
9. Alkaloid pada gambir terdapat 7 macam, yaitu dihidro gambirtaninna, gambirdina, gambirtanina, gambirina, isogambirina, auroparina, oksogambirtanin(Hiller K dan Melzig, 2007)
Tabel 2.1. Taksonomi Tanaman Gambir (Keplinger, 1999)
2.1.1 Morfologi tanaman
Tanaman gambir (Uncaria Gambir Roxb) biasa tumbuh liar di hutan dan tempat-tempat lainnya yang bertanah agak miring dan cukup mendapatkan sinar matahari serta curah hujan merata setiap tahun. Biasanya tumbuh di ketinggian antara 200 m - 900 m di atas permukaan laut. Tanaman ini kebanyakan berada di daerah Kalimantan dan Sumatra. Tumbuhan ini termasuk tumbuhan perdu yang memiliki batang keras yang membelit. Daunnya bertangkai pendek dan berwarna hijau muda. Bunganya berwarna putih, berbentuk kecil-kecil dan tongkol bulat. Bagian gambir yang dipanen adalah daun dan ranting yang selanjutnya diolah untuk menghasilkan ekstrak gambir yang bernilai ekonomis. (Zamarel dan Hadad,1999). Panen dan pemangkasan daun dilakukan setelah tanaman berumur 1,50 tahun. Pemangkasan dilakukan 2-3 kali setahun dengan selang 4-6 bulan. Pangkasan daun dan ranting harus segera diolah, karena jika pengolahan ditunda lebih dari 24jam, getahnya akan berkurang (Zamarel dan Hadad, 1999).
Kerajaan Plantae
Divisi Angiosperms
Sub Divisi Eudicots
Kelas Asterids
Ordo Gentianales
Familia Rubiaceae
Genus Uncaria
2.1.2 Kegunaan gambir
Antara kegunaan gambir yaitu mengobati mencret (daunnya), perut mulas, eksema, disentri, radang gusi (getahnya), radang tenggorokan, demam-kuning, batuk, haid banyak dan berdarah.
2.1.3 Pengolahan gambir
Proses pengolahan gambir adalah proses pengeluaran getah yang terkandung dalam daun dan ranting dengan menggunakan alat pengepres, sedangkan bahan yang akan dikeluarkan adalah catechin, kandungan inilah yang menentukan persyaratan mutu gambir. Bagian gambir yang dipanen adalah daun dan ranting yang selanjutnya diolah untuk menghasilkan ekstrak gambir yang bernilai ekonomis. (Zamarel dan Hadad,1999). Panen dan pemangkasan daun dilakukan setelah tanaman berumur 1,50 tahun. Pemangkasan dilakukan 2-3 kali setahun dengan selang 4-6 bulan. Pangkasan daun dan ranting harus segera diolah, karena jika pengolahan ditunda lebih dari 24jam, getahnya akan berkurang (Zamarel dan Hadad,1999)
Secara garis besarnya ada beberapa tahapan pengolahan yag harus dilalui, setelah membawa bahan yang telah dipanen ke tempat kempa dan dilakukan penimbangan bahan. Tahapan pengolahan gambir terdiri dari :
1. Perebusan Bahan
Daun dan ranting yang telah dipetik dimasukkan ke dalam wadah berupa keranjang bambu (kapuak = Minangkabau) dengan terlebih dahulu bagian dalam kapuak tersebut dipasang rajut (jala). Bahan baku dalam wadah harus dipadatkan sedemikian rupa. Secara tradisional, para petani melakukan pekerjaan ini dengan cara bergantung pada palang rumah kempa lalu menghentak-hentakkan kakinya terhadap bahan baku di dalam wadah dengan kekuatan penuh.
Pada proses perebusan ini yang terpenting adalah proses melepaskan catechin dari sel daun. Terlepasnya catechin ini akan menentukan besar rendemen gambir yang dihasilkan. Proses melepaskan butiran catechin ini sangat tergantung dengan proses perebusan yang tepat. Perebusan secara tradisional dilaksanakan selama lebih kurang 1,5 jam untuk setiap kapuaknya. Selama perebusan dilakukan sekali pembalikan kapuak sehingga perebusan merata ke seluruh bahan. Selain itu, buntelan gambir kadang
ditusuk-tusuk dengan kayu runcing guna memberikan jalan air panas masuk ke dalam buntelan gambir tersebut.
2. Pengempaan Bahan
Bahan yang telah direbus kemudian dikempa dengan menggunakan alat kempa. Secara tradisional, bahan yang akan dikempa terlebih dahulu harus dililit dengan tali untuk memudahkan proses pengempaan dan menjaga supaya bahan yang dikempa tidak berserakan. Proses pelilitan ini membutuhkan waktu sekitar 30-45 menit. Alat kempa yang selama ini digunakan oleh petani tidak memungkinkan untuk dilakukan berulang kali untuk satu satuan bahan karena waktu yang digunakan untuk satu kali pengempaan cukup lama, sehingga mengakibatkan panas yang dikandung bahan setelah perebusan akan berkurang.
Selanjutnya lilitan tersebut juga akan menyebabkan tidak optimalnya pengempaan yang dilakukan karena tertahan oleh tali pelilit. Keadaan ini menyebabkan proses keluarnya getah tidak optimal karena suhu bahan sudah berkurang, dimana oleh Suherdi (1994) dijelaskan bahwa suhu yang dibutuhkan oleh getah gambir untuk lepas dari jaringan daun dan ranting secara optimal tidak boleh kurang dari 900 C.
Dalam pengempaan gambir ada beberapa faktor yang harus dipertimbangkan, yaitu : rendemen, tekanan maksimum di dalam buntelan gambir, kadar catechin gambir kering, kadar abu, kadar air setelah pengeringan. Hasil pengempaan daun gambir dari perebusan tradisional, masih menyisakan lebih kurang 25 % dari lembaran daun yang telah terkempa masih memiliki warna hijau daun yang pekat dan tebal hal ini menandakan bahwa bagian yang masih berwarna hijau tersebut masih mengandung catechin. Hal ini berarti masih terdapat lebih kurang 25 % lagi dari bahan baku daun gambir yang masih belum terekstrak.Saat ini ada beberapa jenis alat kempa yang dipergunakan oleh petani di Sumatera Barat yang dapat mempengaruhi rendemen dan mutu gambir kering yang dihasilkan karena adanya perbedaan tekanan maksimum di dalam bahan yang dikempa.
Namun bila ditinjau dari daya tahan alat maka akan dijumpai bahwa alat tradisional yang mempergunakan rangka kayu akan mudah patah akibat tekanan yang diberikan sering tidak sesuai dengan kekuatan dari rangka alat tersebut. Demikian pula dengan alat kempa sistem ulir yang membutuhkan tenaga yang cukup besar untuk pengoperasiannya, walaupun memperlihatkan hasil yang cukup baik, namum akan sulit untuk dibawa ke kebun gambir yang pada umumnya berada di daerah dengan topografi
berbukit.Pengolahan model pabrik kurang diminati petani, karena pada umumnya mereka tidak mau menjual daunnya untuk diolah di tempat lain sebab ampas hasil olahannya selalu disebar kembali di areal pertanaman mereka sebagai pupuk.
Lama pengempaan berkisar antara 10-15 menit bergantung kepada jenis alat yang digunakan. Getah daun dan air perasan dari getah daun (ekstrak) hasil kempa ditampung dengan baskom plastik untuk selanjutnya dilakukan pengendapan. (Nasrun et al,1997) 3. Pengendapan Getah
Ekstrak gambir hasil kempaan dipindahkan ke dalam peraku panjang yang terbuat dari kayu dengan terlebih dahulu dilakukan penyaringan agar kotoran daun yang terbawa dalam cairan dapat dipisahkan, untuk selanjutnya dilakukan proses pengendapan. Pengendapan getah dapat dirangsang dengan menggesek-gesek getah tersebut dengan kumpulan serat karung goni/plastik. Di dalam paraku biasanya terpisah antara kristal yang terdapat pada bagian bawah yang dominan terdiri dari katechin, sementara cairan yang berwarna kecoklatan yang berada pada bagian atas adalah tannin atau katechu tanat. Sedapat mungkin setelah air katechu tanat diambil baru kristal katechin dikumpulkan untuk selanjutnya ditiriskan. Proses pengendapan ini biasanya berlangsung sekitar 20 jam. (Yuliani et al,1999)
4. Penirisan Getah
Penirisan dilakukan dengan memasukkan endapan getah (getah yang mengkristal) ke dalam karung goni dan dihimpit dengan benda yang berat. Air penirisan ditampung dalam paraku, dimana biasanya air ini dapat digunakan kembali untuk perebusan. Penirisan ini dilakukan selama 10-20 jam, tergantung dengan banyaknya jumlah bahan yang ditiriskan. Setelah didapatkan bongkahan sari getah gambir yang berbentuk pasta padat, maka untuk selanjutnya bisa dilakukan pencetakan.
5. Pencetakan
Ekstrak gambir yang telah melewati proses penirisan akan berbentuk seperti pasta. Pasta ini sudah dapat dicetak. Pencetakan dilakukan dengan menggunkan alat cetakan yang terbuat dari bambu (cupak = Minangkabau), yang mempunyai diameter sekitar 1 inch. Di Sumatera Barat terdapat 3 macam bentuk alat cetakan, yang terdiri dari bentuk silinder, koin, dan silinder cekung.
Untuk keperluan konsumsi, gambir dicetak dengan menggunakan cetakan yang berbentuk silinder cekung, dan unutk keperluan industri/ekspor gambir dicetak dengan alat cetakan yang berbentuk koin atau silinder. Untuk 1 orang yang mencetak I kg gambir dibutuhkan waktu 20-25 menit.
6. Pengeringan
Gambir yang telah selesai dicetak diletakkan dalam wadah yang terbuat dari bambu/kayu yang mirip baki, disusun rapi dan siap untuk dijemur dengan cahaya matahari atau di atas tungku pemanas/perebus daun gambir. Pengeringan ini dilakukan selama 3-4 hari, atau tergantung cuaca jika dijemur dengan cahaya matahari.
(Zeijistra,1943)
2.2 Proses pembuatan histoteknik 2.2.1 Teknik Pewarnaan
Pewarnaan adalah proses pemberian warna pada jaringan yang telah dipotong sehingga unsur jaringan menjadi kontras dan dapat dikenali/diamati dengan mikroskop. Proses timbulnya warna terkait dengan terjadinya ikatan antara molekul tertentu yang terdapat pada daerah dan struktur jaringan yang tertentu. Sinar dengan panjang gelombang tertentu yang terdapat dalam sinar yang berasal dari cahaya matahari atau lampu mikroskop yang dipaparkan pada sajian yang telah diwarnai akan diabsorpsi (diserap) atau diteruskan. Zat warna yang terikat pada jaringan akan menyerap sinar dengan panjang gelombang tertentu sehingga jaringan tersebut akan tampak berwarna.
Dengan beberapa pengecualian, kebanyakan jaringan tidak berwarna, sehingga sulit untuk memeriksa jaringan yang tidak diwarnai di bawah mikroskop cahaya. Oleh karena itu, telah ditemukan metode-metode pewarnaan jaringan, yang tidak hanya membuat berbagai jaringan menjadi menyolok, tetapi memungkinkan pula diadakan perbedaan di antara komponen-komponen tersebut. Ini dilakukan dengan menggunakan campuran zat warna yang mewarnai komponen jaringan lebih kurang secara selektif.
Kebanyakan zat warna yang digunakan dalam pemeriksaan histologi bersifat seperti senyawa asam atau basa dan mempunyai kecenderungan untuk membentuk ikatan elektrostatik (garam) dengan gugus-gugus jaringan yang dapat berionisasi. Komponen
jaringan yang lebih mudah diwarnai dengan zat warna basa disebut basofilik; yang menpunyai afinitas terhadap zat warna asam disebut asidofilik.
Contoh zat warna basa adalah biru toluidin dan biru metilen. Hematoksilin berkelakuan seperti zat warna basa, yaitu mewarnai jaringan basofilik. Komponen ringan utama yang berionisasi dan bereaksi dengan zat warna basa melakukan hal itu karena asam dalam komposisi mereka (nucleoprotein dan mukopolisakarida asam). Zat warna asam misalnya orange G, eosin dan fuchsin asam kebanyakan mewarnai komponen basa yang ada di dalam protein sitoplasma. Sifat basa atau asam suatu zat biasanya menjelaskan reaksi pewarnaan secara kimia, tetapi juga ada dasar-dasar fisika.
Dari semua zat warna, yang paling sering digunakan adalah gabungan hematoksilin dan eosin (H&E). Banyak warna lain yang digunakan dalam berbagai prosedur histologik. Meskipun mereka berguna dalam menggambarkan berbagai komponen jaringan, mereka biasanya tidak memberikan keterangan mengenai sifat kimia jaringan yang sedang dipelajari.
Didasarkan pada metoda produksi, ada dua jenis zat warna, yaitu yang alami dan sintetis (Carleton, 1976). Hematoksilin diperoleh dari pohon logwood yaitu Haematoxylum Campachianum adalah contoh pewarnaan alami (Baker & Silverton, 1976). Hematoksilin adalah zat warna mitra untuk eosin di teknik pewarnaan Hematoksilin & Eosin. Ia akan membuat nukleus berwarna biru-violet atau coklat. Sedangkan eosin adalah pewarna sintetis yang mewarnai sel darah merah, sitoplasma, membran sel, kalogen dan struktur di luar sel dengan memberikan warna merah muda atau warna merah.
Sebelum melakukan pewarnaan serangkaian persiapan yang harus dilakukan adalah sebagai berikut:
1. Peralatan gelas harus dibersihkan dulu dan dibilas dengan akuades 2. Timbang zat warna dengan cermat dan tepat
3. Larutkan zat warna dalam pelarut yang benar dengan memperhatikan urutan pencampurannya, misalnya hematoksilin selalu harus dilarutkan dalam alkohol dulu sebelum ditambahkan bahan lain.
4. Aduk zat warna dengan baik agar seluruh partikel zat warna terlarut dengan baik 5. Tuangkan larutan zat warna ke dalam wadah yang sesuai untuk proses pewarnaan
6. Siapkan juga larutan-larutan lain yang diperlukan untuk proses pewarnaan dan tuangkan dalam wadah yang sesuai
7. Atur urutan larutan-larutan tersebut sesuai dengan prosedur proses pewarnaan 8. Zat warna beralkohol harus ditutup rapat untuk mencegah penguapan alkohol
yang akan menyebabkan presipitasi (pengendapan) zat warna
Pelarut yang umum dipakai dalam proses pewarnaan adalah air dengan derajat keasaman yang netral (pH 7). Disamping itu juga dapat digunakan cairan pelarut lainnya seperti etilalkohol (etanol) dengan derajat konsentrasi yang bervariasi. Bila tidak ada keterangan dalam proses pelarutan yang menggunakan alkohol berarti konsentrasi alkohol yang digunakan adalah alkohol absolut dengan konsentrasi 99.9%.
2.2.2 Pulasan (Pewarnaan) Hematoksilin-Eosin
Pulasan (pewarnaan) yang sering digunakan secara rutin adalah pewarnaan yang dapat digunakan untuk memulas inti dan sitoplasma serta jaringan penyambungnya yaitu pulasan hematoksilin-eosin (HE). Pada pulasan HE digunakan dua macam zat warna yaitu hematoksilin yang berfungsi untuk memulas inti sel dan memberikan warna biru (basofilik) serta eosin yang merupakan counterstaining hematoksilin, digunakan untuk memulas sitoplasma sel dan jaringan penyambung dan memberikan warna merah muda dengan nuansa yang berbeda.
Hematoksilin merupakan zat warna alami yang pertama kali dipakai tahun 1863. Hematoksilin akan mengikat inti sel secara lemah, kecuali bila ditambahkan senyawaan lainnya seperti alumunium, besi, krom dan tembaga. Senyawaan hematoksilin yang dipakai adalah bentuk oksidasinya yaitu hematein. Proses oksidasi senyawaan hematoksilin ini dikenal sebagai Ripening dan dapat dipercepat prosesnya dengan menambahkan senyawaan yang bertindak sebagai oksidator seperti merkuri oksida, hidrogen peroksida, potassium permanganat dan sodium iodat.
Selama proses oksidasi berlangsung kemampuan hematoksilin utuk mewarnai inti sel akan terus berlangsung dan akan berkurang bila proses oksidasi telah selesai. Untuk memperpanjang proses ini larutan hematoksilin dapat disimpan dalam wadah tertutup dan disimpan dalam ruangan gelap. Dalam kondisi terpapar oleh cahaya sebaiknya larutan diganti sekurangnya seminggu sekali. Jenis hematoksilin yang sering dipakai adalah
mayer, delafied, Erlich, Bullard dan Bohmer, sedangkan counterstaining yang dipakai adalah eosin, safranin, dan phloxine.
Beberapa larutan hematoksilin yang digunakan adalah: 1. Hematoksilin Erlich (Zulham,2009).
Hematoksilin Erlich adalah hematoksilin yang paling tahan lama, mudah berdifferensiasi dan warnanya relatif tahan lama. Hematoksilin ini baru bisa digunakan setelah 1-2 bulan dibuat. Waktu inkubasinya adalah 30 menit dan counterstainingnya adalah 0.5 -1% larutan eosin dalam air. Formulanya adalah sebagai berikut
- Hematoksilin ………... 6 gram - Alkohol absolut ……….. 300ml - Akuades ……….. 300ml - Glycerol ……….. 300 ml - Glacial acetic acid ………... 30 ml - Potassium alum ………30 ml
Cara pembuatannya adalah sebagai berikut : - Hematoksilin dilarutkan dalam alkohol
- Sambil digerus dalam mortar secara perlahan-lahan tambahkan bahan lainnya secara berurutan sambil digerus
- Akhirnya tambahkan kristal potassium alum (Aluminium potassium sulfate) sambil menggoyang-goyang botol hingga terdapat endapan kristal alum di dasar botol.
- Botol berisi larutan hematoksilin Ehrlich kemudian ditutup secara longgar dengan gumpalan kapas dan disimpan ditempat terang selama 1-2 bulan sehingga
hematoksilinnya teroksidasi menjadi haematin. Proses ini dikenal sebagai pematangan
2. Hematoksilin Delafield (Zulham,2009).
Larutan zat warna ini tahan bertahun-tahun dalam penyimpanan, bisa digunakan 3 hari setlah pembuatan, counterstaining dengan menggunakan 0.5-1% larutan eosin dalam air, waktu inkubasi 15-20 menit. Formula larutan pewarna ini adalah :
- Hematoksilin kristal ………... 6 gr - Alkohol absolut ………. 50 ml - Ammonium alum ………. 55 gr - Aquades ……….. 600ml - Glycerol ……… 150ml
Cara pembuiatan larutan hematoksilin Delafield adalah sebagai berikut : - Larutkan kristal hematoksilin dengan alkohol absolut
- Larutkan ammonium alum dengan akuades hingga jenuh (saturated) - Campurkan kedua larutan tersebut dan diamkan selama 3-5 hari - Saring dan tambahkan glycerol
- Biarkan selama 3 hari dalam botol terpapar cahaya
- Setelah 3 hari simpan dalam botol tertutup dan lindungi dari cahaya
3. Hematoksilin Mayer
Larutan hematoksilin Mayer merupakan larutan yang dapat disimpan dalam waktu lama (berbulan-bulan), counterstaining dengan 0.5-1% larutan eosin dan waktu inkubasinya 10-15 menit. Formulanya adalah
- Hematoksilin kristal ……….. 1gr - Aquades ……….. 1000ml - Sodium iodate ……….. 0.2 gr - Ammonium/potassium alum ………. 50gr - Citric acid ……… 1gr - Chloral hydrate ……… 50gr
Cara pembuatannya adalah sebagai berikut
- Larutkan ammonium/potassium alum di dalam aquades - Tambahkan hematoksilin dan campurkan secara baik
- Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik - Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya
4. Hematoksilin Harris
Larutan pewarna yang dapat dipakai segera setelah selesai dibuat, counterstaining dengan 0.5-1% larutan eosin dan waktu inkubasinya adalah 15-20 menit. Formulanya adalah sebagai berikut
- Kristal hematoksilin ……… 5.0 gr - Alkohol 100% ……….. 50 ml - Ammonium/potassium alum ……… 100 gr - Distilled water ……… 1000 ml - Merkuri oksida ……… 2.5 gr Cara pembuatannya adalah sebagai berikut
- Larutkan hematoksilin di dalam alkohol
- Larutkan ammonium/potassium alum di dalam distilled water dan panaskan - Hentikan pemanasan dan campur kedua larutan tersebut
- Panaskan dengan cepat sambil di aduk
- Hentikan pemanasan dan campurkan merkuri oksida kedalamnya perlahan-lahan
- Panaskan kembali hingga larutan bewarna purple gelap
- Hentikan pemanasan dan tempatkan wadah berisi larutan tersebut di dalam wadah berisi air dingin hingga laurtan hematoksilin menjadi dingin
- Larutan siap untuk digunakan segera setelah dinginkan
- Tambahkan 2-4ml asam asetat glasial per 100ml Larutan untuk meningkankan ketajaman warna inti
2.2.3 Larutan Counterstaining
Beberapa pulasan yang dipakai sebagai counterstaining larutan hematoksilin adalah eosin, safranin dan phloxine.
1. Larutan Eosin
Larutan eosin yang digunakan terdiri atas larutan stok (Stock solution) dan larutan kerja (working solution). Adapun kedua larutan ini adalah sebagai berikut
1% Stock Alkohol-Eosin
Eosin Y, water soluble ………. 1.0 gr Distilled water ……….. 20 ml Larutkan dan tambahkan
Alkohol 95% ……….. 80 ml Working Eosin Solution
Eosin stock solution ……… 1 bagian Alkohol 80% ………... 3 bagian
Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam asetat glasial 0.5ml untuk setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik
2. Larutan Phloxine
Laurtan phloxine terdiri atas larutan stock eosin, stock phloxine, working solution dan larutan Safran. Larutan-larutan tersebut adalah sebagai berikut
Stock Eosin
Eosin Y water soluble ……… 1 gram Distilled water ……… 100ml Stock Phloxine Phloxine B ……….. 1.5 gr Distilled water ………... 100ml Working Solution Stock Eosin ……….. 100ml
Stock Phloxine ………. 10ml Alkohol 95% ………. 780ml Asam asetat glasial ……….. 4ml 2% Alkohol Safran
Safran du Gatinais ………. 2 gram Alkohol 100% ……….. 100ml
2.3 Pulasan(pewarnaan) rutin yang banyak dipakai 2.3.1 Pewarnaan Mayer Hematoxylin-Eosin
Pulasan ini banyak dipakai dengan beberapa pertimbangan : 1. Differensiasi warna sangat jelas
2. Mewarnai inti sel dengan baik dan jelas dengan background yang tidak bewarna
3. Hasil konsisten
4. Prosedurnya sederhana
5. Dapat mewarnai preparat yang difiksasi dengan fiksasi apapun juga prosedur yang dipakai adalah sebagai berikut
a. Deparafinisasi dengan xylol (2x2 min)
b. Hidrasi dengan serial Alkohol 100% (2x2 min) – 95% (2min) – 90% (2 min) – 80% (2 min) - 70% (2min) – Distilled water (3min)
c. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Mayers selama 15 min d. Cuci dalam air mengalir selama 15-20menit
e. Observasi di bawah mikroskop, bila masih terlalu biru cuci lagi di air mengalir selama beberapa menit. Bila sudah cukup warnanya lanjutkan ke langkah selanjutnya
f. Counterstaining dalam larutan Eosin working solution selama 15 detik hingga 2 menit tergantung pada umur eosin dan kedalaman warna yang diinginkan
g. Dehidrasi dalam serial alkohol dengan gradasi meningkat perlahan mulai 70% hingga 100% masing-masing 2 menit.
h. Jernihkan dan dealkoholisasi dalam xylol 2x2min i. Tutup dengan balsem kanada
Hasil/ Interpretasi adalah - Inti sel bewarna biru
- Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada komponen tertentu (Zulham, 2009).
Gambar 2.2 Jaringan serebellum dengan pewarnaan hematoksilin-eosin. Dengan pembesaran 10x40.
2.3.2 Pewarnaan Hematoksilin Harris-Eosin
Protokol pulasan hematoksilin Harris –eosin adalah sebagai berikut a. Deparafinisasi dalam xylol
b. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%-90%-80%-70%
c. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Harris selama 15 min d. Bilas dalam air mengalir dalam waktu yang singkat
e. Celup dalam campuran asam-alkohol secara cepat 3-10 celup cek diferensiasi warna di bawah mikroskop
f. Bilas dalam air mengalir secara singkat
g. Celup sebanyak 3-5 kali dalam larutan ammonium atau lithium carbonat hingga potongan bewarna biru cerah
h. Cuci dalam air mengalir selama 10-20 menit Bila pencucian tidak maksimal jaringan sulit terwarna oleh Eosin
i. Inkubasi dalam eosin selama 15 detik hingga 2 menit
j. Dehidrasi dalam alkohol dengan konsentrasi yang meningkat secara perlahan, masing-masing selama 2 menit
k. Inkubasi dalam xylol 2x2menit l. Tutup dengan kaca penutup
Hasil/Interpretasi hasil pulasan - Inti sel bewarna biru
- Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada komponen tertentu (Zulham, 2009).
2.3.3 Pewarnaan Hematoksilin Mayer-Phloxyne-Safran Prosedur pewarnaan adalah sebagai berikut
a. Deparafinisasi dalam xylol
b. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%-90%-80%-70%
c. Inkubasi dalam larutan asam pikrat jenuh selama 5 menit d. Cuci dalam air mengalir hingga seluruh asam pikrat hilang e. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Mayer selama 15 menit f. Basuh dengan air mengalir selama 20 menit
g. Warnai dalam larutan 1.5% larutan Phyloxine B selama 2 menit h. Basuh dengan air selama 5 menit
i. Cuci dengan alkohol absolut 3 kali
j. Warnai dalam 2% larutan alkohol Safran selama 5 menit k. Cuci dengan alkohol absolut 2 kali
l. Inkubasi dalam xylol 2 kali masing-masing selama 2 menit m. Rekatkan dengan objek glass menggunakan Balsam Kanada
Hasil/interpretasi
- Inti bewarna biru
- Sel darah merah bewarna vermillion pink - Tulang bewarna kuning
- Tulang rawan bewarna hijau kekuningan - Otot bewarna merah
