1 UJI TOKSISITAS AKUT (LD50)
1. Tujuan percobaan
Adapun tujuan yang diharapkan dalam praktikum ini adalah :
a. Untuk mengetahui dosis suatu obat yang menimbulkan kematian 50% dari hewan percobaan.
b. Untuk melihat tingkat klasifikasi suatu obat.
2. Tinjauan Pustaka
Toksisitas adalah suatu keadaan yang menandakan adanya efek toksik/racun yang terdapat pada bahan sebagai sediaan single doseatau campuran. Toksisitas akut ini diteliti pada hewan percobaan yang menunjukkan evaluasi keamanan dari kandungan kimia untuk penggunaan produk rumah tangga, bahan tambahan makanan, kosmetik, obat-obatan, dan sediaan biologi.
Uji toksisitas akut adalah pengujian yang dilakukan untuk mengetahui nilai LD50 dan dosis maksimal yang masih dapat ditoleransi hewan uji (menggunakan 2 spesies hewan uji). pemberian obat dalam dosis tunggal dan diberikan melalui 2 rute pemerian (misalnya oral dan intravena).
Hasil uji LD50 dan dosisnya akan ditransformasi (dikonversi) pada manusia. (LD50 adalah pemberian dosis obat yang menyebabkan 50 ekor dari total 100 ekor hewan uji mati oleh pemerian dosis tersebut)
Uji toksisitas dilakukan untuk mendapatkan informasi atau data tentang toksisitas suatu bahan (kimia) pada hewan uji. Secara umum uji toksisitas dapat dikelompokkan menjadi uji toksisitas jangka pendek/akut, dan uji toksisitas jangka panjang. Uji toksisitas akut dimaksudkan untuk mendapatkan informasi tentang gejala keracunan, penyebab kematian, urutan proses kematian dan rentang dosis yang mematikan hewan uji (Lethal dose atau disingkat LD50) suatu bahan. Uji toksisitas akut merupakan efek yang merugikan yang timbul segera sesudah pemberian suatu bahan sebagai dosis tunggal, atau berulang yang diberikan dalam 24 jam.
2 Uji toksisitas akut dirancang untuk menentukan atau menunjukkan secara kasar median lethal dose (LD50) dari toksikan. LD50 ditetapkan sebagai tanda statistik pada pemberian suatu bahan sebagai dosis tunggal yang dapat menyebabkan kematian 50% hewan uji. Jumlah kematian hewan uji dipakai sebagai ukuran untuk efek toksik suatu bahan (kimia) pada seke lompok hewan uji. Jika dalam hal ini hewan uji dipandang sebagai subjek, respon berupa kematian tersebut merupakan suatu respon diskretik. Ini berarti hanya ada dua macam respon yaitu ada atau tidak ada kematian.
Quantal respon , yaitu jumlah respon pada sekelompok hewan uji terhadap dosis tertentu suatu obat atau bahan. Pengamatan terhadap efek ini dilakukan untuk menentukan jumlah respon dari suatu respon diskretik (all or none response) pada suatu kelompok hewan uji. Jumlah respon tersebut dapatn100%, 99%, 50%, 20%, 10%, atau 1%. Respon yang bersifat diskret itu dapat berupa kematian, aksi potensial, dan sebagainya.
Lethal Dose 50 adalah suatu besaran yang diturunkan secara statistik, guna
menyatakan dosis tunggal sesuatu senyawa yang diperkirakan dapat mematikan atau menimbulkan efek toksik yang berarti pada 50% hewan percobaan setelah perlakuan. LD50 merupakan tolak ukur kuantitatif yang sering digunakan untuk menyatakan kisaran dosis letal. Ada beberapa pendapat yang menyatakan tidak setuju, bahwa LD50 masih dapat digunakan untuk uji toksisitas akut. Namun ada juga beberapa kalangan yang masih setuju, dengan pertimbangan:
a. Jika lakukan dengan baik, uji toksisitas akut tidak hanya mengukur LD50, tetapi juga memeberikan informasi tentang waktu kematian, penyebab kematian, gejala – gejala sebelum kematian, organ yang terkena efek, dan kemampuan pemulihan dari efek nonlethal.
b. Hasil dari penelitian dapat digunakan untuk pertimbangan pemilihan design penelitian subakut.
c. Tes LD50 tidak membutuhkan banyak waktu.
d. Hasil tes ini dapat langsung digunakan sebagai perkiraan risiko suatu senyawa terhadap konsumen atau pasien.
3 Pada dasarnya, nilai tes LD50 yang harus dilaporkan selain jumlah hewan yang mati, juga harus disebutkan durasi pengamatan. Bila pengamatan dilakukan dalam 24 jam setelah perlakuan, maka hasilnya tertulis “LD50 24 jam”. Namun seiring perkembangan, hal ini sudah tidak diperhatikan lagi, karena pada umumnya tes LD50 dilakukan dalam 24 jam pertama sehingga penulisan hasil tes “LD50” saja sudah cukup untuk mewakili tes LD50 yang diamati dalam 24 jam. Bila dibutuhkan, tes ini dapat dilakukan lebih dari 14 hari. Contohnya, pada senyawa tricresyl phosphat, akan memberikan pengaruh secara neurogik pada hari 10 – 14, sehingga bila diamati pada 24 jam pertama tidak akan menemukan hasil yang berarti. Dan jika begitu tentu saja penulisan hasil harus deisertai dengan durasi pengamatan. Ada beberapa hal yang dapat mempengaruhi nilai LD50 antara lain spesies, strain, jenis kelamin, umur, berat badan, gender, kesehatan nutrisi, dan isi perut hewan percobaan.
Teknis pemberian juga mempengaruhi hasil, antara lain waktu pemberian, suhu lingkungan, kelembaban, sirkulasi udara. Tidak luput kesalahan manusia juga dapat mempengaruhi hasil ini. Sehingga sebelum melakukan penelitian, ada baiknya kita memeperhatikan faktor – faktor yang mempengaruhi hasil ini. Secara umum, semakin kecil nilai LD50, semakin toksik senyawa tersebut. Begitu pula sebaliknya, semakin besar nilai LD50, semakin rendah toksisitasnya. Hasil yang diperoleh (dalam mg/kgBB) dapat digolongkan menurut potensi ketoksikan akut senyawa uji menjadi beberapa kelas, seperti yang terlihat pada tabel berikut (Loomis (1978)) :
No KELAS LD50 (mg/KgBB)
1 Luar biasa toksik 1 atau kurang
2 Sangat toksik 1 – 50
3 Cukup toksik 50 – 500 4 Sedikit toksik 500 – 5000 5 Praktis tidak toksik 5000 – 15000 6 Relatif kurang
berbahaya
4 Menurut Farmakope Indonesia persyaratan yang harus dipenuhi agar dapat menggunakan Farmakope Indonesia ini adalah :
1. Menggunakan seri dosis dengan pengenceran berkelipatan tetap
2. Jumlah hewan percobaan / jumlah biakan jaringan tiap kelompok harus sama.
3. Dosis diatur sedemikian rupa sehingga memberikan efek daro 0-100% dan perhitungan dibatasi pada kelompok percobaan yang memberikan efek dari 0-100%.
Rumus :
Keterangan :
m = log LD50
a = log dosis terendah yang menyebabkan kematian 100% tiap kelmpok
b = beda log dosis yang berurutan
Pi = jumlah hewan yang mati yang menerima dosis sebanyak i dibagi jumlah hewan seluruhnya yang menerima dosis i
Uji toksisitas akut ini biasanya menggunakan hewan uji mencit dari kedua jenis kelamin. Hewan uji harus sehat dan berasal dari satu galur yang jelas. Menurut Weil penelitian uji toksisitas akut ini paling tidak menggunakan 4 peringkat dosis yang masing-masing peringkat dosis menggunakan paling sedikit 4 hewan uji. Dosis dibuat sebagai suatu peringkat dengan kelipatan logaritmik yang tetap. Dosis terendah merupakan dosis yang tidak menyebabkan timbulnya efek atau gejala keracunan, dan dosis tertinggi merupakan dosis yang menyebabkan kematian semua (100%) hewan uji. Cara pemberian obat atau
5 bahan yang diteliti harus disesuaikan pada pemberiannya pada manusia, sehingga dapat mempermudah dalam melakukan ekstrapolasi dari hewan ke manusia.
Dalam uji toksisitas akut, penentuan LD50 dilakukan dengan cara
menghitung jumlah kematian hewan uji yang terjadi dalam 24 jam pertama sesudah pemberian dosis tunggal bahan yang diteliti menurut cara yang ditunjukkan oleh para ahli. Namun demikian, kematian dapat terjadi sesudah 24 jam pertama karena proses keracunan dapat berjalan lambat. Gejala keracunan yang muncul sesudah 24 jam menunjukkan bahwa bahan obat atau bahan itu mempunyai titik tangkap kerja pada tingkat yang lebih bawah sehingga gejala keracunan dan kematian seolah-olah tertunda (delayed toxicity). Oleh karena itu banyak ahli berpendapat bahwa gejala keracunan perlu diamati sampai 7 hari, bahkan juga sampai 2 minggu.
Sediaan yang akan diuji dipersiapkan menurut cara yang sesuai dengan karakteristik bahan kimia tersebut, dan tidak diperbolehkan adanya perubahan selama waktu pemberian. Untuk pemberian per oral ditentukan standar volume yang sesuai dengan hewan uji.
Dosis efektif 50% adalah dosis suatu obat yang dapat berpengaruh terhadap 50% dari jumlah hewan yang diuji, sedangkan, dosis lethal 50% adalah, dosis suatu obat atau bahan kimia yang dapat menyebabkan kematian sampai 50% dari jumlah hewan yang diuji.
Tujuan dilakukannya uji toksisitas akut adalah untuk menentukan potensi ketoksikan akut dari suatu senyawa dan untuk menentukan gejala yang timbul pada hewan percobaaa. Data yang dikumpulkan pada uji toksisitas akut ini adalah data kuantitatif yang berupa kisaran dosis letal atau toksik, dan data kualitatif yang berupa gejala klinis.
Bahan racun adalah semua bahan kimia yang dapat menyebabkan kerusakan/kesakitan pada makhluk hidup. Sebagai akibat dari kerusakan tersebut ialah adanya gangguan pada struktur anatomi dan fisiologik dari jaringan yang menderita, bahkan dapat menimbulkan kematian. Semua bahan kimia mungkin akan beracun bila diberikan berlebihan atau rute pemberian yang tidak lazim.
6 Terlalu banyak oksigen murni, air ataupun garam dapat menyebabkan kematian Tetapi hal tersebut tidak dapat digunakan sebagai pegangan, karena bahan yang biasanya disebut racun sperti sianida, arsen dan sebagainya tidak dapat dikatakan tidak beracun, sehingga kita harus menyatakan bahwa semua bahan kimia akan beracun bila diberikan secara tidak proporsional.
3. Bahan dan Alat
a. Bahan
Hewan percobaan : anak ikan lele
Obat yang diberikan : ekstrak dengan berbagai konsentrasi atau fenol dengan berbagai konsentrasi (0,04%, 0,02%, 0,01%, 0,005%, 0,0025%, 0.00125%) Aquades. b. Alat Beaker glass Stopwatch 4. Cara Kerja
a. Siapkan fenol dengan berbagai konsentrasi di dalam beaker glass.
b. Siapkan anak ikan 10 ekor, masukkan kedalam masing-masing beaker glass, dan mulai hitung waktunya.
c. Lakukan pengamatan selama 1,5-2 jam.
d. Hitung berapa jumlah ika yang mati dan jumlah ikan yang hidup. e. Tabelkan dan hitung LD50 nya.
5. Hasil dan Pembahasan a. Hasil dan perhitungan Tabel hasil semua kelompok :
7 P e r h i tungan LD50 : Rumus : m = a – b ( Σ Pi – 0.5 ) Data :
1.) Log dosis terendah yang mnyebabkan kematian 100% tiap kelompok ( a ) = 0.0025% , Log 0.0025 = -2.602
2.) Beda log dosis yang berurutan ( b ) = log 0.04 - log 0.02 = 0.301
3.) Jumlah hewan yang mati yang menerima dosis sebanyak i dibagi jumlah hewan seluruhnya yang menerima dosis i
( Pi ) = Σ Pi = ( 1 + 0 ) = 1 m = a – b ( Σ Pi – 0.5 ) Log LD50 = -2.602 – 0.301 ( 1 – 0.5 ) = -2.602 – 0.301 ( 0.5 ) = -2.602 – 0.150 = -2.752 Anti Log = -2.752
Dosis Jumlah Hewan Perkelompok Jumlah Hewan Pi Mati Hidup 0.04 % 10 10 0 1 0.02 % 10 10 0 1 0.01 % 10 10 0 1 0.005 % 10 10 0 1 0.0025% 10 10 0 1 0.00125% 10 0 10 0 Kontrol 10 0 10 0 Σ Pi = 1
8 LD50 = 1.770 x 10-3 mg/Kg BB Contoh soal : Dosis Jumlah hewan seluruhnya Jumlah hewan yang mati Jumlah hewan yang hidup Pi 500 mg/kgBB 10 10 0 1 250 mg/kgBB 10 8 2 0.8 125 mg/kgBB 10 5 5 0.5 62,5 mg/kgBB 10 2 8 0.2 31,25 mg/kgBB 10 0 10 0 Σ Pi = 2.5 m = a – b (∑ Pi – 0,5 )
= log 500 – ( log 500 – log 250 ) ( 2.5 – 0.5 ) = 2.699 – ( 0.301 ) ( 2 ) = 2.699 – 0.602 = 2.097 = Antilog 2.097 = 125.026 mg/kgBB Dosis Jumlah hewan Jumlah hewan yang Jumlah hewan yang Pi
9
seluruhnya mati hidup
500 mg/kgBB 10 10 0 1 250 mg/kgBB 10 10 0 1 125 mg/kgBB 10 8 2 0.8 62,5 mg/kgBB 10 2 8 0.2 31,25 mg/kgBB 10 0 10 0 Σ Pi = 2 m = a – b (∑ Pi – 0,5 )
= log 250 – ( log 500 – log 250 ) ( 2 – 0.5 ) = 2.398 – ( 0.301 ) ( 1.5 ) = 2.398 – 0.452 = 1.946 = Antilog 1.946 = 88.308 mg/kgBB b. Pembahasan
Percobaan uji toksisitas akut LD50, objek yang digunakan adalah ikan lele sebanyak 10 ekor. 10 ekor ikan lele di masukkan kedalam beaker glass yang berisi fenol dengan konsentrasi 0.005 %. Pengamatan ini dilakukan selama 1,5. Pada awal ikan lele dicelupkan ke dalam larutan fenol, ikan masih dalam keadaan seperti biasa. Setelah menit ke 13 beberapa ikan lele sudah mulai melayang – layang, dan pada menit ke 21 semua ikan lele mati. Sementara untuk konsentrasi fenol 0.00125 % tingkat kematian tidak terjadi, dan pada konsentrasi fenol 0.04 % tingkat kematian ikan lele lebih cepat.
10 Pada beaker glass yang diberi larutan kontrol, ikan lele yang berada di dalam larutan tersebut bertahan hidup dengan baik. Sementara pada beaker glass yang berisi larutan fenol konsentrasi 0.005% ikan lele yang berada didalamnya tidak bertahan lama dan pada menit ke 21 ikan tersebut mati 100%. Hal ini membuktikan bahwa larutan fenol tersebut mengandung senyawa-senyawa fenol merupakan senyawa organik yang mempunyai sifat racun ( toksik ). Apabila senyawa ini mencemari perairan maka akan membuat rasa dan bau tidak sedap, dan pada nilai konsentrasi tertentu dapat menyebabkan kematian organisme di perairan tersebut.Oleh karena itu pada konsentrasi larutan fenol 0.04% lebih cepat terjadi kematian pada ikan lele di bandingkan pada konsentrasi fenol 0.0025%.
11 6. Kesimpulan
1. Toksisitas adalah suatu keadaan yang menandakan adanya efek toksik/racun yang terdapat pada bahan sebagai sediaan single doseatau campuran.
2. Uji toksisitas akut adalah pengujian yang dilakukan untuk mengetahui nilai LD50 dan dosis maksimal yang masih dapat ditoleransi hewan uji (menggunakan 2 spesies hewan uji). pemberian obat dalam dosis tunggal dan diberikan melalui 2 rute pemerian (misalnya oral dan intravena).
3. Dosis efektif 50% adalah dosis suatu obat yang dapat berpengaruh terhadap 50% dari jumlah hewan yang diuji, sedangkan, dosis lethal 50% adalah, dosis suatu obat atau bahan kimia yang dapat menyebabkan kematian sampai 50% dari jumlah hewan percobaan.
4. Semakin kecil nilai LD50, semakin toksik senyawa tersebut. Begitu pula sebaliknya, semakin besar nilai LD50, semakin rendah toksisitasnya.
5. Dari percobaan dapat dilihat tingkat toksisitas akut LD50 yang terjadi pada ikan lele yang dicelupkan pada larutan fenol konsentrasi 0.04% lebih cepat terjadi. Hal ini dipengaruhi oleh senyawa fenol yang bersifat racun ( toksik ). Dapat di lihat perbandingan dengan menggunakan larutan kontol, yaitu air saja. Pada larutan kontrol tidak ada ikan lele yang mati. Pada konsentrasi kecil, yaitu 0.00125 % tingkat kematian ikan lele termasuk rendah, tidak mencapai 50%. Dari pengamatan kelompok kami, dapat kami simpulkan bahwa pengaruh senyawa fenol akan menyebabkan rusaknya suatu organisme bahkan apabila dalam konsentrasi tinggi akan menyebabkan kematian organisme tersebut. Semakin banyak larutan fenol yang diberikan, atau semakin besar konsentrasi fenol yang diberikan maka akan semakin cepat dan tinggi tingkat toksisitas yang terjadi pada organisme tersebut.
12 DAFTAR PUSTAKA
Donatus IA. 2001.Toksikologi Dasar. Yogyakarta: Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Fakultas Farmasi, Universitas Gajah Mada;
Atmojo, D.D. 2009. Uji ToksisitasAkut Penentuan LD50 Ekstrak Valerian Valeriana officinalis) terhadap Mencit BAL B/C.
http://ilmualambercak.blogspot.com/2013/03/uji-toksisitas-akut.html http://ilmu-kefarmasian.blogspot.com/2013/04/uji-toksisitas.html
