PENGARUH LEVEL GLUTATHIONE DALAM PENGENCER TRIS-SITRAT KUNING TELUR TERHADAP MOTILITAS DAN ABNORMALITAS SPERMA
KAMBING PERANAKAN ETAWAH POST THAWING
THE EFFECT OF GLUTHATIONE LEVEL IN EGG YOLK TRIS-CITRATE EXTENDER ON MOTILITY AND ABNORMALITY OF POST THAW ETAWAH
CROSSBREED GOATS SPERM
Levana Putri Adinda*, Siti Darodjah**, Rangga Setiawan**
Universitas Padjadjaran
*Alumni Fakultas Peternakan Unpad Tahun 2016
**Staf Pengajar Fakultas Peternakan Unpad
e-mail : adindalevana@gmail.com ABSTRAK
Glutathione merupakan salah satu antioksidan yang mampu mempertahankan kualitas semen beku. Namun, glutathione pada level yang terlalu tinggi dapat menyebabkan keracunan pada semen sehingga menurunkan motilitas. Motilitas dan abnormalitas merupakan parameter penting dalam penilaian kualitas semen. Tujuan dari dilakukannya penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh penambahan glutathione terhadap kualitas semen kambing Peranakan Etawah post thawing. Semen ditampung dengan menggunakan bantuan vagina buatan dari 5 ekor kambing PE jantan yang berumur 2 – 3 tahun. Metode yang digunakan adalah eksperimental dengan rancangan acak kelompok yang terdiri atas 5 perlakuan dan 5 kelompok sebagai ulangan dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan. Hasil analisis statistik menunjukan penambahan glutathione 6 mM memberikan pengaruh nyata (P>0,05) terhadap motilitas namun tidak berpengaruh nyata (P<0,05) terhadap abnormalitas dengan nilai 44,36%
dan 2,9% dibandingkan dengan penambahan 0; 4; 8; dan 10 mM glutathione yang hasilnya secara berturut-turut (34,68; 40,49; 46,18; 36,88% dan 3,3; 3,0; 2,6; 3,2%). Kesimpulan dari penelitian ini adalah level glutathione berpengaruh terhadap motilitas dan memberikan pengaruh yang sama terhadap abnormalitas sperma kambing PE post thawing. Level glutathione 6 mM merupakan dosis yang optimal dalam menghasilkan motilitas dan abnormalitas sperma kambing PE post thawing yang baik.
Kata kunci: Glutathione, motilitas, abnormalitas.
ABSTRACT
Glutathione is one of antioxidant that could be maintain the quality of frozen semen.
Unappropiate level of gluthatione could cause toxication to sperm. Motility and abnormality are the important parameters of quality of semen assesment. The aim of this research was to determine the effect of glutathione level on motility and abnormality of post thowed Etawah Cross goat sperm. Semen was collect using artificial vagina from 5 Etawah Cross age 2 – 3 years. Research was conducted by randomized block design with 5 glutathione level treatments with 5 groups of goat followed by Duncan test. The result showed that the addition 6 mM of glutathione gave significant effect (P>0,05) on motility but were not significant on abnormality (P<0,05) with percentage 44.36% and 2.9% than 0; 4; 8; and 10 mM (34.68; 40.49; 46.18; 36.88% and 3.3; 3.0; 2.6; 3.2%) respectively. As a conclusion, glutathione levels was effected on motility and give the same affected on abnormality
crossbred ettawa goat sperm post thawing. Level 6 mM of glutathione give the best motility and abnormality crossbred ettawa goat sperm post thawing.
Keywords: Glutathione, sperm motility, sperm abnormality.
PENDAHULUAN
Kambing Peranakan Etawah (PE) merupakan salah satu jenis komoditas ternak hasil persilangan antara kambing Etawah yang berasal dari India dengan kambing kacang (lokal).
Kambing PE banyak diternakan sebagai penghasil daging dan penghasil susu dengan kualitas yang baik. Namun terdapat keterbatasan dalam populasi kambing PE di Indonesia yang disebabkan oleh beberapa faktor diantara lain yaitu peningkatan populasi yang masih rendah, masih tergantung dengan kawin alam, ketergantungan pejantan, sehingga menyebabkan populasinya kurang berkembang.
Salah satu cara yang dapat dilakukan untuk dapat menambah populasi dari kambing PE adalah dengan introduksi IB (Inseminasi Buatan) menggunakan semen beku yang berasal dari kambing PE jantan unggul. Penggunaan semen beku cukup memberikan banyak manfaat antara lain semen beku dapat dipakai untuk beberapa tahun kemudian, optimalisasi pejantan, dan menghemat biaya pemeliharaan ternak jantan.
Permasalahan yang umum terjadi pada semen beku adalah penurunan kualitas semen beku akibat dari pembentukan Reactive Oxygen Species (ROS). ROS adalah radikal bebas yang dihasilkan oleh adanya kontak antara oksigen dan semen. Pembentukan ROS terjadi selama proses pengolahan dapat meningkatkan kerusakan morfologi yang berpengaruh terhadap kapasitas sperma, menyebabkan penurunan motilitas, dan dapat meningkatkan abnormalitas yang merupakan parameter penting dalam kualitas semen. Apabila terjadi produksi radikal bebas secara berlebihan pada spermatozoa maka akan menyebabkan stres oksidatif.
Permasalahan ROS dapat diatasi yaitu dengan cara penambahan antioksidan kedalam pengencer semen. Antioksidan yang umum digunakan adalah glutathione. Glutathione adalah salah satu antioksidan yang umum digunakan yang mempunyai sifat menetralkan radikal bebas dan berfungsi melindungi sel dari kerusakan akibat sifat toksik yang disebabkan oleh oksigen reaktif (ROS). Penggunaan glutathione lebih efisien dibandingkan antioksidan lain seperti αtokoferol, dan vitamin A. Hal ini dikarenakan glutathione lebih mudah didapat, lebih murah dibandingkan dengan vitamin A, dan memberikan hasil yang lebih baik. Namun, penggunaan glutathione harus disesuaikan dengan kebutuhan pengencer karena jika
penambahan glutathione tidak sesuai dengan kebutuhan makaakan menyebabkan efek negatif atau toksik yang akan mempengaruhi kualitas semen.
Berdasarkan uraian diatas, penulis meneliti mengenai level glutathione yang optimal dalam pengencer tris-sitrat kuning telur terhadap motilitas dan abnormalitas kambing Peranakan Etawah post thawing.
BAHAN DAN METODE
Objek penelitian yang digunakan adalah semen yang berasal dari lima ekor kambing peranakan etawah jantan dengan umur yaitu 2-3 tahun yang dikandangkan di Breeding Station Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran. Pakan yang diberikan yaitu berupa hijauan sebanyak 5-6 kg/ekor/hari serta diberi tambahan konsentrat sebanyak 700-800 gram/ekor/hari.
Alat dan bahan yang digunakan adalah haemocytometer, kamar hitung neubaeur, mikroskop, straw 0,25 ml, tabung semen, counter, glutathione, container, gliserol, tris-sitrat, kuning telur, penicillin dan streptomycin, eosin, N2 cair, pembakar Bunsen, cawan petri.
Penelitian diawali dengan melakukan penampungan semen kambing dengan menggunakan bantuan vagina buatan yang berisi air hangat bersuhu 400 C serta vaselin setelah itu semen yang didapat kemudian di evaluasi makroskopis yang meliputi volume semen, warna semen, pH semen, dan konsistensi (derajat kekentalan) dan dilanjutkan dengan evaluasi mikroskopis yang meliputi: gerakan massa, konsentrasi total sperma, motilitas sperma, membran plasma utuh (MPU), dan recovery rate.
Semen segar yang telah dievaluasi dan memiliki kriteria yang baik sebagai semen untuk keperluan inseminasi buatan akan diuji lanjut dengan diencerkan menggunakan tris sitrat kuning telur. Semen yang telah diencerkan kemudian dikemas menggunakan ministraw dengan volume setiap straw sebesar 0,25 ml. Pengemasan dilakukan dengan suhu lingkungan 50C. Semen cair yang telah dikemas disimpan kedalam lemari es dengan temperatur 50C selama 2 jam, sehingga sperma dapat menyesuaikan diri dengan pengencer dan lingkungannya sebelum proses pembekuan. Tahapan pembekuan diawali dengan proses pre freezing dengan cara menguapi straw oleh uap Nitrogen Cair bersuhu -80 sampai dengan -100 0C selama 7 hinga 8 menit dengan jarak antara straw dan permukaan cairan sekitar 3-5 cm. Tahapan selanjutnya yaitu meletakan straw yang telah membeku di dalam goblet menggunakan pinset, kemudian goblet tersebut ditempatkan dalam canister dan dimasukan ke dalam container berisi Nitrogen Cair dengan suhu mencapai -196°C. Proses thawing (pencairan kembali) dilakukan dengan cara memasukan ke dalam wadah berisi air dengan temperatur 40°C selama 35-40 detik. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak
Kelompok (RAK) dengan 5 perlakuan dan 5 kelompok sebagai ulangan yaitu P0 = Semen + (Pengencer + 0 mM Glutathione), P1 = Semen + (Pengencer + 4 mM Glutathione), P2 = Semen + (Pengencer + 6 mM Glutathione), P3 = Semen + (Pengencer + 8 mM Glutathione), P4 = Semen + (Pengencer + 10 mM Glutathione) setelah itu dilakukan Uji Jarak Berganda Duncan untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan (α = 0,05).
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Karakteristik Semen Segar Kambing PE
Data hasil rataan dalam pengamatan semen segar kambing PE baik makroskopis dan mikroskopis dilakukan untuk mengetahui kelayakan semen untuk dilakukan proses selanjutnya yaitu proses pengenceran dan pembekuan. Hal ini bisa dilihat di dalam Tabel 1.
Tabel 1. Data Karakterisitik Semen Segar
Penilaian
Kelompok Koefisien
Variasi 1 2 3 4 5 (%)
Makroskopis
Volume (ml) 0,70 0,50 1,10 0,60 0,50 32,75
Warna krem krem krem krem Krem
Konsistensi kental kental kental kental Kental
pH 6,70 6,70 6,50 6,50 6,50 1,49
Mikroskopis
Gerakan Massa +++ +++ +++ +++ +++
Konsentrasi sperma total(107 sel sperma/ml)
256,00 326,00 408,00 226,00 412,00 23,40
Motilitas (%) 75,00 85,20 79,90 81,40 77,20 4,40 Abnormalitas
(%)
1,00 1,50 2,00 1,50 1,50 21,80
Membran Plasma Utuh (%)
84,50 87,00 89,00 88,00 81,00 3,34
Hasil volume yang didapat dari semen segar berkisar antara 0,5 – 1,1 ml dimana nilai tersebut masih dalam kisaran normal yaitu antara 0,1 – 1,5 ml (Hafez, 1993). Bervariasinya volume dari semen yang diperoleh dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu cara pengambilan dan frekuensi penampungan, umur ternak, dan bangsa ternak (Tambing et al., 2001). Warna, konsistensi, dan konsentrasi semen mempunyai hubungan yang erat satu sama lain, yaitu semakin encer suatu semen maka konsentrasinya akan semakin rendah begitu juga jika
konsentrasinya semakin rendah maka warna semen akan semakin pucat, begitu juga sebaliknya jika konsentrasinya tinggi maka warna semen akan semakin keruh dengan konsistensi tinggi atau kental (Evan dan Maxwell, 1987). Warna semen segar kambing Peranakan Etawah adalah putih hingga krem dengan konsistensi kental (Tambing et al., 2001). Konsentrasi spermatozoa kambing yang normal berkisar antara 2.500 juta sampai 5.000 juta sel/ml (Evans dan Maxwell, 1987). Derajat keasaman (pH) sangat mempengaruhi daya hidup spermatozoa, dimana pH yang didapat berkisar antara 6,5 – 6,7 hal ini sesuai dengan pernyataan dimana semen yang berkualitas baik mempunyai pH yaitu dengan kisaran 5,9 – 7,3 (Bearden dan Fuquay, 2004). Variasi pH semen kemungkinan dipengaruhi oleh konsentrasi asam laktat yang dihasilkan dalam proses akhir metabolisme (Toelihere, 1985).
Menurut Hafez (1987) standar derajat keasaman semen kambing yang dapat diolah menjadi semen beku adalah 6,2 – 7,2. Apabila pH terlalu tinggi atau rendah, akan menyebabkan kematian pada spermatozoa.
Gerakan massa semen kambing nampak lebih cepat, tebal, dan hitam jika dibandingkan dengan semen domba. Semen yang mempunyai kualitas baik, jika diamati dibawah mikroskop akan memberikan tampilan kumpula sperma bergerak yang bergerombol dalam jumlah besar sehingga membentuk gelombang atau awan yang bergerak (Toelihere, 1985). Gerakan massa semen kambing Peranakan Etawah yang terlihat gelombang besar, hitam, dan cepat maka memiliki skor +++ atau sangat baik (Suwarso, 1999). Semen dengan skor gerakan massa ++/+++ layak untuk dilakukan proses pengenceran atau proses pembekuan, sedangkan semen dengan skor gerakan massa + tidak layak dipergunakan untuk inseminasi buatan (Evans dan Maxwell, 1987).
Motilitas merupakan salah satu kriteria penentu kualitas semen yang dilihat dari banyaknya spermatozoa yang motil progresif dibandingkan dengan seluruh spermatozoa yang ada dalam satu pandang mikroskop. Motilitas sperma kambing pada umumnya berkisar antara 75% - 90% (Suwarso, 1999). Namun kisaran tersebut tidak menjadi patokan dikarenakan beberapa jenis kambing mempunyai motilitas yang berbeda-beda. Motilitas sperma kambing Peranakan Etawah adalah sebesar 78,13% (Suwarso, 1999), tetapi hal ini berbeda dengan pernyataan Sandi et al., (1989) yang menyebutkan bahwa motilitas sperma kambing Peranakan Etawah hanya sebesar 60%.
Persentase spermatozoa abnormal kambing Peranakan Etawah adalah sebesar 10,17%
(Tambing et al., 2001). Standar persentase spermatoozoa abnormal kambing yang sehat adalah sekitar 6%-10% (Delgadillo, 1992). Sifat fisik semen segar dapat mengalami
perbedaan yang disebabkan oleh perbedaan individu ternak, nutrisi, frekuensi ejakulat (Toelihere, 1985).
2. Pengaruh Level Glutathione dalam Pengencer Tris-Sitrat Kuning Telur terhadap Motilitas Sperma Kambing PE Post Thawing
Berdasarkan hasil penelitian mengenai pengaruh level glutathione dalam pengencer Tris-Sitrat kuning telur terhadap motilitas sperma kambing PE post thawing didapatkan data yang dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Data Hasil Penelitian Motilitas Post Thawing
Kelompok
Perlakuan
P0 P1 P2 P3 P4
...%...
1 29,62 36,84 44,40 43,47 33,33
2 36,36 45,45 45,83 47,36 42,85
3 37,03 40,90 43,75 47,61 33,33
4 32,31 38,09 41,67 45,40 36,00
5 38,09 41,17 46,15 47,05 38,89
Rataan 34,68±3,2a 40,49±2,9a 44,36±2b 46,18±1,6c 36,88±3,6c Keterangan :
P0 = Pemberian 0 mM Glutathione P1 = Pemberian 4 mM Glutathione P2 = Pemberian 6 mM Glutathione P3 = Pemberian 8 mM Glutathione P4 = Pemberian 10 mM Glutathione
Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh menunjukan bahwa rataan nilai P3 yaitu sebesar 46,18%, P2 sebesar 44,36%, P1 sebesar 40,49%, P4 sebesar 36,88%, dan P0 sebesar 34,68%. Penambahan glutathione sebesar 6 mM menunjukan rataan hasil persentase motilitas yang tinggi dan penambahan glutathione sebesar 0 mM menunjukan rataan hasil persentase motilitas yang paling rendah. Hasil analisis sidik ragam terhadap motilitas spermatozoa menunjukan perbedaan nyata (P<0,05) antar perlakuan. Hal ini menunjukan bahwa penambahan level glutathione dalam pengencer tris-sitrat kuning telur berpengaruh nyata (P<0,05) terhadap motilitas spermatozoa kambing PE post thawing. Hasil yang didapat setelah dilakukan uji jarak berganda Duncan bahwa P2 dengan level glutathione 6 mM berbeda nyata (P<0,05) dibandingkan dengan P0, P1, dan P4.
Perlakuan P2 dengan penambahan glutathione sebesar 6 mM memberikan hasil yang baik dalam mempertahankan motilitas spermatozoa kambing PE post thawing yaitu 44,36±2%. Perlakuan P0 dengan penambahan glutathione sebesar 0 mM menunjukan hasil persentase motilitas yang nyata lebih rendah (P<0,05) dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Hasil uji jarak berganda Duncan menunjukkan bahwa level glutathione 6 mM memberikan perlakuan yang nyata lebih tinggi (P<0,05) terhadap level 0 mM, 4 mM, dan 10 mM. Hal ini sesuai dengan pernyataan dari hasil penelitian Mishra, dkk. (2010). Menurut Suryohudoyo, (2000), Tuminah (2000), Glutathione merupakan senyawa antioksidan yang dapat membersihkan radikal bebas yang sangat reaktif dan menyebabkan terjadinya peroksidase lipid pada membran plasma sel dan dapat melindungi sel dari kerusakan oksidatif. Menurut hasil penelitian Mishra, dkk (2010) yang menunjukan bahwa penambahan glutathione sebanyak 8 mM pada semen kambing Black Bengal Bucks dapat mempertahankan persentase motilitas spermatozoa sebanyak 50 % selama 4 hari dibandingkan dengan penggunaan level 4 mM glutathione yang hanya dapat mempertahankan motilitas spermatozoa selama 3 hari. Menurut Amalia, dkk (2013), menunjukan bahwa penggunaan level 6 mM glutathione pada semen kambing Boer memberikan hasil tertinggi yaitu 29,5% dibandingkan dengan penggunaan level 13 mM dan 19 mM glutathione.
Level glutathione yang terlalu tinggi dapat berdampak negatif seperti pada perlakuan P4 dengan level 10 mM glutathione. Hal ini terjadi akibat penambahan glutathione yang berlebihan akan menyebabkan toksik pada sperma. Menurut Uysal dan Bucak (2007), penambahan konsentrasi glutathione yang berlebih dapat menimbulkan efek negatif atau efek toksik dari glutathione yang dapat menyebabkan kematian spermatozoa.
3. Pengaruh Level Glutathione dalam Pengencer Tris-Sitrat Kuning Telur terhadap Abnormalitas Sperma Kambing PE Post Thawing
Berdasarkan hasil penelitian mengenai pengaruh level glutathione dalam pengencer Tris-Sitrat kuning telur terhadap abnormalitas sperma kambing PE post thawing didapatkan data yang dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Data Hasil Penelitian Abnormalitas Post Thawing
Kelompok Perlakuan
P0 P1 P2 P3 P4
...%...
1 3,0 2,5 2,0 2,0 4,0
2 3,5 3,0 3,5 3,0 3,0
3 3,0 3,0 3,0 2,5 3,0
4 4,0 3,0 3,0 2,5 3,0
5 3,0 3,5 3,0 3,0 3,0
Rataan 3,3±0,2 3,0±0,2 2,9±1,0 2,6±0,4 3,2±0,4
Keterangan :
P0 = Pemberian 0 mM Glutathione P1 = Pemberian 4 mM Glutathione P2 = Pemberian 6 mM Glutathione P3 = Pemberian 8 mM Glutathione P4 = Pemberian 10 mM Glutathione
Berdasarkan hasil penelitian pada Tabel 3 menunjukan bahwa rataan persentase abnormalitas pada setiap perlakuan menunjukan hasil rataan yang berbeda Hasil penelitian didapatkan bahwa dengan penambahan level glutathione memberikan hasil persentase yang tidak berbeda nyata terhadap abnormalitas spermatozoa kambing PE post thawing atau dengan kata lain level glutathione memberikan pengaruh yang sama pada abnormalitas sperma kambing PE.
Penambahan glutathione dalam pengencer tris-sitrat kuning telur tidak berpengaruh nyata terhadap persentase abnormalitas sperma kambing PE post thawing. Hal ini disebabkan oleh pengaruh pemberian yang tidak optimal dan berlebihan menyebabkan kurang efektifnya penambahan glutathione dan dapat menyebabkan sifat toksik bagi sperma. Abnormalitas dapat terjadi saat prosesing semen dan juga karena peroksidase lipid. Peroksidase lipid akan menyebabkan kerusakan struktur dan terganggunya metabolisme spermatozoa. Menurut pernyataan Suyadi, dkk (2015) bahwa peningkatan abnormalitas yang disebabkan karena adanya proses peroksidase lipid, perubahan tekanan osmotik akibat radikal bebas dan asam laktat hasil dari proses metabolik, sehingga merusak membran plasma dan menyebabkan peningkatan abnormalitas spermatozoa. Selain itu, Yani dkk (2001), menyatakan bahwa semakin lama waktu penyimpanan maka semakin tinggi persentase abnormalitas yang disebabkan oleh stres dingin dan ketidakseimbangan tekanan osmotik akibat dari proses metabolik yang terus berlangsung. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Amalia, dkk (2013) bahwa penambahan glutathione tidak dapat menurunkan abnormalitas pada kambing Boer,
karena abnormalitas pada spermatozoa disebabkan oleh perkembangan spermatozoa secara morfologik serta akibat penanganan semen pada proses penampungan.
Penambahan level yang tidak optimal dapat menyebabkan kurang efektifnya pengaruh glutathione. Sedangkan penambahan level glutathione yang berlebihan akan menyebabkan toksik atau keracunan bagi spermatozoa. Sifat toksik disebabkan oleh pemberian antioksidan yang berlebihan sehingga menyebabkan meningkatnya tekanan osmosis dan menyebabkan kerusakan membran spermatozoa yang berdampak pada putusnya ekor spermatozoa (Wilandari dkk, 2013).
Berdasarkan hasil pengamatan, abnormalitas yang paling banyak ditemukan yaitu abnormalitas sekunder seperti, ekor patah, kepala dan ekor terpisah, dan ekor tergulung.
Menurut Toelihere (1993), Selama abnormalitas belum mencapai 20% dari contoh semen maka semen tersebut dapat dipakai untuk inseminasi.
KESIMPULAN
Level glutathione berpengaruh terhadap motilitas dan memberikan pengaruh yang sama untuk abnormalitas sperma kambing PE post thawing. Level glutathione 6 mM merupakan dosis optimal dalam menghasilkan motilitas sperma kambing PE post thawing yang baik.
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dr. agr. Ir. Siti Darodjah, MS. selaku pembimbing utama, juga kepada Rangga Setiawan, S.Pt., M.Sc. selaku pembimbing anggota yang telah meluangkan waktu, tenaga dan pikiran dalam membimbing serta memberikan
arahan, masukan, dan bimbingan yang sangat bermanfaat serta kepada Prof. Dr. Soeparna, MS. Selaku Ketua Peneliti Hibah Penelitian Penugasan Unggulan
Academic Leadership Grand (ALG) 1-1-6 Laboratorium Reproduksi Ternak dan Inseminasi Buatan, yang telah memfasilitasi sarana penelitian.
DAFTAR PUSTAKA
Afiati. F. Yulnawati., M. Riyadi., R.I. Arifiantini. 2015. Abnormalitas Spermatozoa Domba Dengan Frekuensi Penampungan Berbeda. Seminar Nasional Masyarakat Biodiv Indonesia 1: 930-934.
Amalia. F. R., Suyadi. dan A. Rachmawati. 2013. Pengaruh Gluthathione Terhadap Kualitas Semen Kambing Boer Post Thawing Dalam Pengencer yang Mengandung Dimetylsulfoxyde (DMSO).Universitas Brawijaya. Malang.
Delgadillo, J. A., B. Leboeuf and P. Chemineau. 1992. Abolition of Seasonal Variations in Semen Quality and Maintanance of Sperm Fertilizing Ability by Photoperiodic Cycles in Goat Bucks. Small Ruminant Research 9: 44-59
Evans, G. and W. M. C. Maxwell. 1987. Salmon’s Artificial Insemination of Sheep and Goat. Butterworth’s, London.
Feradis. 2010. Bioteknologi Reproduksi Pada Ternak. Alfabeta. Bandung
Garner, D. L. and Hafez. 2000. Spermatozoa and Seminal Plasma. In: E.S.E. Hafez and B. Hafez, ed. Reproduction in Farm Animals. 7th Ed. Baltimore: Lippincott Williams &
Wilkins. USA. 96-109.
Gaspersz, V. 2006. Teknis Analisis Dalam Penelitian Percobaan. Tarsito. Bandung. Hal 62-84 Herdis, M. Surachman, Yulnawati, M. Rizal, dan H. Maheswari. 2008. Viabilitas dan Keutuhan Membran Plasma Spermatozoa Epididimis Kerbau Belang Pada Penambahan Maltosa Dalam Pengencer Andromeid. Jurnal Indonesia Tropis Animal Agriculture, Vol. 33. No. 2.
Maxwell, W. M. C. and P. F. Watson. 1996. Recent Progress In The Preservation of Ram Semen. Anim. Reprod.
Mishra, B., M. G. S. Alam, M. A. M. Y. Khandokar, S. Mazumder and M. N. Munsi. 2010.
Qualities of Goat Semen in Tris-Citrate-Glucose Extender Containing Glutathione.
Departments of Surgery and Obstetrics, Faculty of Veterinary Science, Bangladesh Agricultural University. Bangladesh.
Nurcholidah, S. R, Idi, R. Setiawan, I.Y. Asmara, B.I. Sujana. 2006. Pengaruh Lama Penyimpanan Semen Cair Ayam Buras pada Suhu 50 C terhadap Periode Fertil dan Fertilitas Sperma. Jurnal ilmu ternak, juni 2006, vol. 6 no.1, 7 – 11.
Rizal, M. dan Herdis. 2005. Daya Hidup Spermatozoa Epididimis Domba Garut yang Dikriopreservasi Menggunakan Modifikasi Pengencer Tris. Jurnal Hayati, Vol. 12.
No. 2.
Rizal, M. dan Herdis. 2010. Peranan Antioksidan dalam Meningkatkan Kualitas Semen Beku.
Wartazoa, Vol. 20 No. 3 th 2010.
Rizal, M., M. R. Toelihere, T. L. Yusuf, B. Purwantara, P. Situmorang. 2003. Kriopreservasi Semen Domba Garut dalam Pengencer Tris dengan Konsentrasi Laktosa yang Berbeda. Media Kedokteran Hewan 19:78-83.
Suryohudoyo, P. 2000. Oksidan, Antioksidan, dan Radikal Bebas. Dalam: Kapita Selekta Ilmu Kedokteran Molekuler. CV. Sagung Seto, Jakarta. hlm 31 – 47.
Suwarso. 1999. Peranan Rafinosa Dalam Pengencer Tris-Sitrat Kuning Telur Terhadap Semen Beku Kambing PE. Institut Pertanian Bogor. Bogor
Suyadi, T. E, Susilorini dan L. Amalta. 2015. Kualitas Semen Kambing Peranakan Etawah dalam Pengencer dengan Penambahan Ekstrak Bawang Merah (Allium Cepa L) selama Penyimpanan Suhu Dingin. Fakultas Peternakan Universitas Brawijaya, Malang.
Tambing, S. N., M. R. Toelihere., T. L. Yusuf., dan I-K.Sutama.2000. Pengaruh Gliserol dalam Pengencer Tris terhadap Kualitas Semen Beku Kambing Peranakan Etawah.Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner. Bogor
Toelihere. M. R. 1985. Fisiologi Reproduksi Pada Ternak: Angkasa.
Toelihere. M. R. 1993. Inseminasi Buatan Pada Ternak. Bandung: Angkasa.
Toelihere M. R. 1997. Peranan Bioteknologi Reproduksi Dalam Pembinaan Produksi Peternakan di Indonesia. Disampaikan Pada Pertemuan Teknis dan Koordinasi Produksi (PERTEKSI) Peternak Nasional T.A. 1997, Ditjennak Cisarua-Bogor.
Triwulaningsih E, P. Situmorang, T. Sugiarti, R.G. Sianturi, dan D.A. Kusumaningrum. 2003.
Pengaruh Penambahan Glutathione pada Medium Pengencer Sperma terhadap Kualitas Semen Cair. JITV vol.9. No. 2. Th. 2003.
Tuminah S. 2000. Radikal Bebas dan Antioksidan : Kaitannya dengan Nutrisi dan Penyakit.
Cermin Dunia Kedokteran 128 : 49-50
Uysal, O. dan M. N. Bucak. 2007. Effects of Oxidized Glutathione, Bovine Serum Albumin, Cysteine and Lycopen and The Quality of Frozen-Thawed Ram Semen. Acta Vet. Brno.
76: 383-390.
Winarsi, H. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Yogyakarta : Penerbit Kanisius
