Aktivitas fagositosis pada tikus wistar yang diinokulasi
Candida albicans
dan
diberi mimba (
Azadirachta indica
)
Phagocytosis activity on wistar rats were inoculated by Candida albicans and fed
with neem (Azadirachta indica)
I Dewa Ayu Ratna Dewanti Bagian Biomedis
Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Jember Jember, Indonesia
ABSTRACT
Neem is one of the traditional medicine known by society as immunomodulator. On the other hand, 80% of oral infection diseases is caused by C. albicans. This research is aimed to explain the phagocytosis activities on wistar rats which were inoculated with C. albicans and fed with neem leaves. There are 5 groups, namely control group (KO) with no treatment, the other treatment groups were classified into 4 groups. First group (KP1) was inoculated with C. albicans only. KP2 was fed with 50 mg/day/kg BW aqueous extracts from neem leaves, then inoculated with C. albicans start from day 8-21. KP3 was fed with 100 mg/day/kg BW aqueous extract from neem leaves, then inoculated with C. albicans start from day 8-21. KP4 was fed with 200 mg/day/kg BW aqueous extract from neem leaves, then inoculated with C. albicans start from day 8-21. On day 22, the tongue was swabbed for each group, then cut for immunohistochemistry preparation. The study that there was significant difference showed that there were different results computed using anova, HSD test, and linier regression. The conclusion was neem leaves increased the phagocytosis activity of wistar rats, inoculated with C.albicans.
Key words: Azadirachta Indica juss, macrophage; phagocytosis, innate immune, Candida albicans
ABSTRAK
Mimba adalah salah satu tanaman tradisional yang dikenal masyarakat dan berfungsi sebagai imunomodulator. Di sisi lain, 80% infeksi di mulut adalah kandidiasis dengan penyebabC. albicans. Penelitian ini bertujuan mengetahui aktivitas fagositosis pada tikus wistar yang diinokulasi C. albicansdan diberi daun mimba. Terdapat 5 kelompok, kelompok kontrol (KO) tidak diberi perlakuan. Kelompok perlakuan 1 diinokulasiC. albicans(KP1). KP2 diberi 50 mg/hari/kg BB ekstrak cair daun mimba, kemudian diinokulasi C. albicans dari hari 8-21. KP3 diberi 100 mg/hari/kg BB ekstrak cair daun mimba, kemudian diinokulasi C. albicansdari hari 8-21. Sedangkan KP4 diberi 200 mg/hari/kg BB ekstrak cair daun mimba, kemudian diinokulasi C. albicans dari hari 8-21. Semua kelompok pada hari ke-22 dilakukanswablidah, kemudian lidah dipotong untuk dibuat sediaan dengan imunohistokimia. Hasil penelitian menunjukkan terdapat perbedaan bermakna baik dengan Anova, uji HSD, dan regresi linier. Sebagai simpulan, daun mimba meningkatkan aktivitas fagositosis pada tikus wistar yang diinokulasiC. albicans.
Kata kunci: Azadirachta Indica juss,makrofag,fagositosis,innate immune,Candida albicans
Koresponden: I Dewa Ayu Ratna Dewanti, Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember, Jl. Kalimantan 37 Jember, Telp.0331-333536, Faks.0331-331991, E-mail: dewadewanti@yahoo.com
PENDAHULUAN
Mimba (Azadirachta Indica) telah dikenal dan dimanfaatkan masyarakat untuk mengatasi berbagai macam penyakit, seperti cacingan, kudis, malaria, infeksi jamur, tumor dan alergi.1-2 Beberapa penelitian membuktikan mimba memodulasi imunitas alami dan adaptif,3-6 sedangkan imunitas alami (fagositosis) terutama makrofag berperan penting melawan C. albicans
yang merupakan penyebab utama kandidiasis mulut.7-8 Penelitian sebelumnya membuktikan perasan daun mimba dapat menghambat pertumbuhan C. albicans secara in vitro.9 Daun mimba mempunyai khasiat antimikroba dan sebagai imunomodulator. Makrofag sebagai
fagosit mengenali dan menghancurkan patogen melalui beberapa reseptor merangsang produksi substansi mikrobial melalui CD14 yang diekspresikan ke permukaan sel, akan mengaktifkantoll-like receptors(TLRs) serta
NF-κB.9-10 Stimulasi sitokin proinflamatori dan aktivasi innate immunity tergantung keakuratan pengenalan dari invasi patogen. Oksidatif antara lain dengan cara menghasilkan superoksid dan NO yang dihasilkan sistem iNOS, aktivitas keduanya dapat diinduksi TNF-α, sedangkan aktivitas fagositosis meliputi fungsi penelanan (fungicidal
uptake) dan pembunuhan intrasel (fungisidal).
aktivitas fagositosis.10-12 Penelitian lain membuktikan ekstrak cair daun mimba dapat meningkatkan jumlah makrofag, sehingga diduga dapat mempengaruhi TNF-α yang merupakan
sitokin yang berperan mengaktivasi fagositosis.13 Untuk itu penelitian ini ditujukan untuk mengetahui aktivitas fagositosis pada tikus wistar yang diinokulasi C. albicans dan diberi daun mimba. Harapannya, di masa depan dapat dihasilkan obat yang berasal dari tanaman dan dapat bersifat imunomodulator maupun antijamur.
BAHAN DAN METODE
Penelitian ini menggunakan sampel 25 ekor tikus wistar jantan, yang memenuhi deklarasi Helsinki, dengan berat 100-200 gr, usia 2-3 bulan yang dilakukan adaptasi 1 minggu. Terdapat 5 kelompok yang terbagi menjadi kelompok kontrol (KO), yaitu tikus yang tidak diberi konsumsi ekstrak cair daun mimba dan tidak diinokulasi C.
albicans, KP1 yaitu tikus yang diinokulasi C.
albicans, KP2 yaitu tikus yang diberi konsumsi
ekstrak cair daun mimba dosis 50 mg/hari/kg BB, kemudian mulai hari ke-8 sampai 21 diinokulasi
C. albicans. Selanjutnya, tikus yang diberi
konsumsi ekstrak cair daun mimba dosis 100 mg/hari/kg BB, kemudian mulai hari ke-8 sampai 21 diinokulasiC. albicans(KP3).Sedangkan KP4 adalah tikus yang diberi konsumsi ekstrak cair daun mimba dosis 200 mg/hari/kg BB, kemudian
mulai hari ke-8 sampai 21 diinokulasiC. albicans. Pada hari ke-22 masing-masing kelompok coba diamati dengan cara swab ringan tanpa tekanan dengancotton budpada dorsum lidah tikus wistar dan ditanam padaSaburoud’s agar,dan setelah 48 jam dilakukan penghitungan koloniC. albicans.
Aktivitas fagositosis makrofag dilakukan dengan memotong lidah untuk dibuat sediaan dan pengecatan dengan cara imunohistokimia, dengan deparanisasi menggunakanxylol.Xyloldihilangkan dengan etanol mulai absolut sampai 70%, air, dan
phosphate buffer saline (PBS) pH 7,4 dan diberi
tripsin 0,0 25%. Preparat digenangi larutan H2O2
3%, dicuci dengan PBS 2x dan dilakukan proses bloking dengan BSA 3%. Anti mouse fagositosis direaksikan, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 40C dalam humidity chamber, lalu direaksikan dengan biotiyilized secondary Ab (anti rabbit). Dicuci 3x dengan PBS, dan ditambahkan streptavidin berlabel peroksidase dan diinkubasi selama 1 jam. Selanjutnya dilakukan pencucian kembali dengan dengan PBS 3x, direaksikan dengan substrat DAB (diamine benzidine),
kemudian ditambahkanMeyer-HE.Data dianalisis dengan Anova dan dilanjutkan uji HSD.
HASIL PENELITIAN
Data penelitian mengenai jumlah sel makrofag yang aktif memfagosit C. albicans
terlihat di tabel 1.
Tabel 1. Data jumlah sel makrofag yang aktif menfagositC. albicans
KO KP1 KP2 KP3 KP4
3 3 3 1 1 1 9 9 9 13 12 13 21 22 21 1 1 1 1 1 1 9 9 9 12 12 13 23 22 23 3 3 3 2 2 2 7 7 7 13 13 13 21 21 21 2 2 2 2 2 2 8 8 8 11 11 11 21 21 21 1 1 1 1 1 1 8 8 8 11 11 11 22 21 21 Gambar 1.Aktivitas fagositosis pada makrofag (pembesaran 400x). Panah hitam menunjukkan aktivitas fagositosis, panah abu-abu menunjukkan tidak ada aktivitas fagositosis. A. Kontrol pengecatan, B. Aktivitas fagositosis makrofag terhadapC. albicans(KO), C. Aktivitas fagositosis makrofag terhadapC. albicans (KP1), D. Aktivitas fagositosis makrofag terhadap C. albicans (KP2), E. Aktivitas fagositosis makrofag terhadapC. albicans(KP3),F. Aktivitas fagositosis makrofag terhadapC. albicans(KP4).
B C
D E
A
Hasil penelitian (gambar 1) menunjukkan aktivitas fagositosis pada makrofag pada kelompok yang diinokulasi C. albicans terjadi penurunan dibanding kontrol, sedangkan kelompok perlakuan dengan ekstrak cair daun mimba terjadi peningkatan, yaitu semakin tinggi dosis ekstrak mimba yang diberikan semakin tinggi aktivitas fagositosis. Gambar 2 menunjukkan aktivitas fagositosis makrofag pada epitel lebih tinggi dibandingkan subepitel. Hal ini menunjukkan bahwa mungkinC. albicans banyak dijumpai di epitel.
Perbedaan bermakna (p<0,01) terbukti dari hasil uji manova dan juga dari uji HSD. Selanjutnya dilakukan uji korelasi dengan regresi linier menggambarkan hubungan positif yang
sangat erat (0,985) (gambar 3), sehingga semakin tinggi dosis ekstrak cair daun mimba, maka semakin tinggi aktivitas fagositosis sel makrofag. Pola kontribusi diskriminan menunjukkan kemampuan ekstrak cair daun mimba, yaitu semakin tinggi dosis yang diberikan, maka aktivitas fagositosis semakin tinggi.
Gambar 4 menunjukkan bahwa aktivitas fagositosis (bulatan) terletak di sekitar garis yang lurus ke kanan dengan posisi naik, artinya bahwa semakin tinggi dosis mimba yang diberikan, maka semakin meningkatkan aktivitas fagositosis.
Penghitungan jumlah C albicans pada lidah tikus dan ditumbuhkan padasaburoud’sagar yang dihitung menggunakancolony counter(gambar 5).
Pada kelompok KO tidak didapatiC.albicans. KoloniC.albicansterbanyak pada kelompok KP1, terkecil pada KP4. Hasil ini membuktikan bahwa makin tinggi dosis ekstrak cair daun mimba, makin sedikit koloniC albicans(gambar 5 dan 6).
Uji manova menunjukkan perbedaan bermakna (p<0,01). Uji HSD terdapat perbedaan bermakna, kecuali antara KP0 dengan KP4, menunjukkan bahwa ekstrak cair daun mimba dengan dosis 200mg/BB/hari dapat menurunkan jumlahC. albicans sampai mendekati normal. Uji korelasi (gambar 7) terdapat hubungan negatif yang sangat erat (-0,973), semakin tinggi dosis ekstrak cair daun mimba, semakin sedikit jumlah koloniC albicans.
A
B
Gambar 2. Aktivitas fagositosis pada makrofag dengan teknik imunohistokimia (pembesaran
Gambar 3. Aktivitas fagositosis makrofag akibat ekstrak cair daun mimba
Gambar 5. Jumlah koloniC albicans.C albicanspadasabouroud’s agartampak sebagai bentukan bulat, putih kekuningan, mengkilat, permukaan halus. InfeksiC albicanstidak mutlak ditentukan oleh jumlah spora, karena satu hifa sudah menunjukkan adanya infeksi.
KO
KP1
KP2
KP3
KP4
PEMBAHASAN
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa daun mimba dengan komponen imunomodulator (diduga galic acid, catechin, epicatechin) membangun keseimbangan baru melalui regulasi sistem imun yang hasilnya dapat mempengaruhi makrofag yang kita kenali dari produk yang dihasilkan sel makrofag, dalam menghadapi stresor. Aktivitas TLR2, TLR4 mempengaruhi fospatidilinositol pada membran sel makrofag dan akan mengaktifkan protein Rac, selanjutnya akan mengaktivasi NF-κB dan AP-1 melalui jun kinase melalui jalur MAPK (mitogen-activated
protein kinase). Termasuk jalur ini ERK
(extracelluler signal-regulated kinase), JNK (
c-jun N-terminal kinase) dan p38. ERK
mempengaruhi aktivitas jun, sedangkan p38 mempengaruhi produksi IL-6, IL-8 dan IL-12. Aktivitas p38 dan ERK dapat mengaktivasi AP-1. Ketiga jalur MAPK dapat diaktivasi dalam waktu yang sama. NF-κB merupakan regulator
dari respons awal terhadap patogen dan sebagai aktivator respons imun. NF-κB adalah p50-p65 dari keluarga protein heterodimer yang mentranskripsi bermacam-macam gen. Aktivasi
NF-κB memerlukan fosforilasi protein IκB,
kemudian terjadi degradasi yang menyebabkan p50-p65 berada dalam nukleus dan mengaktifkan bermacam-macam gen. Setelah terjadi pelepasan I-κB, maka terjadi peningkatan
aktivitas faktor transkripsi NF-κB yang
menstimulasi ekspresi gen yang mempengaruhi produksi TNF-α yang berpengaruh pada aktivitas
fagositosis. Stimulasi ekspresi gen antara lain mempengaruhi produksi TNF-α dalam respons imun terhadap patogen. TNF-α berperan sebagai
imun primer dalam regulasi sistem imun. Khusus pada makrofag sitokin ini meningkatkan aktivitas dalam membunuh patogen, yang menjadi mediator penting pada inflamasi.14-16Ekstrak cair daun mimba dengan komponen galic acid,
epicatechin, catechin, dapat menurunkan jumlah
koloni C albicans, meskipun jumlah ini tidak mutlak menunjukkan adanya infeksi, tetapi dapat digunakan untuk menunjukkan adanya infeksi. Jumlah yang lebih banyak dari kelompok kontrol dapat digunakan sebagai parameter terjadinya infeksi karena satu saja bentuk hifa sudah menunjukkan infeksi. Penelitian ini menunjukkan jumlah koloni C.
albicans yang semakin menurun dengan semakin
tinggi dosis ekstrak daun mimba, karena dosis 200 mg/kg BB terlihat jumlah koloni paling sedikit. Penurunan jumlah koloni C albicans
diduga karena kandungan imunomodulator (galic
acid, epicatechin, catechin) dan kandungan
nimbidin, azadirachtin, gedunin, cyclic
trisulphide, cyclic tetrasulphide yang dapat
berfungsi sebagai antijamur. Kandungan imunomodulator dapat meningkatkan respons K
Gambar 7. Grafik linier jumlah koloniC.albicans 0
imun terhadapC albicans, sedangkan kandungan antijamur dapat membunuh jamur secara langsung dengan cara merusak membran sel jamur. Efek imunomodulator dapat terjadi melalui CD14, TLR2, TLR4, TNF-α, aktivitas fagositosis. Jadi penurunan jumlah koloni C.
albicans dapat melalui dua jalur, yaitu
pembunuhan secara langsung dan efek imunomodulatori.
Pembunuhan secara langsung dapat terjadi karena kandungan antijamur (nimbidin,
azadirachtin, gedunin, trisulphida dan
tetrasulphida) dapat merusak membran sel
jamur dengan merubah permeabilitas membran sel, kemudian terbentuk pori-pori yang menyebabkan membran sel menjadi bocor, yang menyebabkan kematian sel jamur. Selain itu kandungan sulfur pada daun mimba diduga dapat berkompetisi dengan oksigen pada sel jamur, sehingga menyebabkan terjadinya toksisitas pada jamur dan menyebabkan kematian jamur.
Kelompok kontrol pada penelitian ini memperlihatkan adanya sel makrofag yang aktif menfagosit C. albicans. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh karena secara fisiologis aktivitas fagositosis juga terjadi pada tikus wistar atau karena pada saat penelitian sulit didapatkan rongga mulut tikus yang steril terbebas dari C.
albicans, sedangkan pada jumlah koloni C.
albicans kelompok kontrol tidak dijumpai C.
albicans. Hal tersebut mungkin terjadi akibat
sudah dapat direspons oleh sel
imunokompeten, sehingga meskipun terdapat aktivitas fagositosis namun pada saat dilakukan penghitungan jumlah koloni tidak terdapat C albicans.
SIMPULAN
Dari penelitian mengenai aktivitas fagositosis pada tikus wistar yang diinokulasi
Candida albicans dan diberi mimba (Azadirachta
indica), daun mimba meningkatkan aktivitas
fagositosis makrofag pada tikus wistar yang diinokulasiC. albicans.
SARAN
Untuk hasil yang lebih baik diperlukan dosis mimba yang lebih bervariasi serta aplikasi ke manusia.
DAFTAR PUSTAKA
1. Ganguli SJ. Neem: A therapeutic for all seasons. Current Sci 2002; 23: 82-11.
2. Goel RK, Sairam K. Anti ulcer drugs from indigenous source with emphasis on musa sapientum, tamrabhasma, asparagus racemous and zingiber officinale. Indian J Pharmacol 2002; 34: 100-10.
3. Upadhayay D, Garg S, Talwar GP. Immunomodulation effects of neem Azadirachta indica) oil. Int J Immunopharmacol 1992; 14(7): 1187-93.
4. SaiRam K, Sharma SK, Havazhagan G, Kumar D, Selavamurthy W. Immunomodulatory effect of NIM-76, a volatile fraction from neem oil. J Ethnopharmacol 1997; 55(2): 133-9.
5. Sastrodihardjo S. Evaluasi daya insektisida dari ekstrak daun mimba (Azadirachta indica A. juss). Seminar Hasil Penelitian Pangan dan Gizi, Ilmu Hayati, 1988. 17 PAU: Jakarta. Hlm: 18.
6. Sadekar D, Kolte AY, Barnase BS, Desai VF. Immunopotentiating effects of Azadirachta indica (Neem) dry leaves powder in broilers, naturally infected with IBD virus. Indian J Exp Biol 1998; 36(11): 1151-3.
7. Lehner T. Immunologi of oral disease. In: Imunologi pada penyakit mulut. Ed. 3. Alih bahasa: Farida R, Suryadhana NG. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. 1992. Hlm: 112-5.
8. Roeder A, Carsen J, KirChing, Rudolf A, Rupec, Martin S, Gunther W, Hans CK. December toll-like receptors as key mediators in innate antifungal immunity. J Ethnopharmacol 2004; 107: 485-98.
9. Dewanti R. Daya hambat pertumbuhan C. albicans oleh perasan daun mimba (Azadirachta Indica juss). Maj Ked Gigi (Dent J), Edisi khusus Temu Ilmiah Nasional III 6-9 Agustus 2003; Hlm. 342-4.
10. Diamond RD, Caron A, Lyman DR, Wysong. Disparate effects of interferon-γ andtumor necrosis factor-α on early neutrophil respiratory burst and fungicidal responses to Candida albicans hyphae in vitro. J Clin Invest 1991; 87: 711-20.
11. Newman SL, Angela H. Candida albicans is phagocytosed, killed, and processed for antigen presentation by human dendritic cells. Infect Immunity 2001; 69 (11): 6813-22.
12. Ulmann BD, Hadley M, Wiriya C, Anna LL, Qiang Z, Luis AV. Inducible defense mechanism against nitric oxide in Candida albicans. Eukaryotic Cell 2004; 3 (3): 715-23.
13. Ray B, Banerjee BD, Sen PJ. Modulation of humoral and cell-mediated immune responses by Azadirachta indica (Neem) in mice. Indian J Exp Biol 1996; 34 (7): 698-701.
dependent Manner. Mycrobiol Immunol 2002; 46 (7): 503-12.
15. Wang JE, Warris A, Ellingsen EA, Fio T, Espevick T, Solberg S, Verwe PE. Involvement of CD14 and Toll-Like receptors in activation of human
monocyte. Mycrobiology and Immunology, 2001.Vol. 69: No. 4: 2402-6.
