I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Pati adalah salah satu karbohidrat yang dapat ditemukan dengan mudah di Indonesia karena keberadaannya yang melimpah. Singkong, kentang, sagu, jagung dan umbi jalar merupakan beberapa sumber yang dapat digunakan untuk memperoleh pati. Selain dimanfaatkan dalam industri makanan maupun sebagai sumber energi terbarukan, pati juga dapat diolah menjadi bentuk pati termodifikasi yang memiliki nilai ekonomi lebih tinggi (Howeler dan Hershey, 2002).
Mikroorganisme merupakan suatu istilah yang digunakan dalam menyebutkan organisme berukuran mikroskopis seperti bakteri, protozoa, dan lain-lain. Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangbiakkan pada suatu substrat yang disebut medium. Untuk dapat menumbuhkan dan mengembangbiakkan suatu mikroorganisme tertentu, komposisi dari suatu medium harus sesuai dengan kebutuhan yang diperlukan oleh mikrooganisme tersebut (Volk dan Wheeler, 1993).
Siklodekstrin dikenal sebagai sikloamilosa dengan struktur berbentuk silinder dengan cincin luar bersifat hidrofilik, sedangkan bagian dalam rongga bersifat hidrofobik. Bentuk dan sifat seperti itulah yang membuat siklodekstrin banyak diaplikasikan dalam industri makanan, kosmetik, serta farmasi (Szejtli, 1982; Vassilevaet al., 2005).
Pada penelitian sebelumnya telah berhasil diisolasi bakteri amilolitik isolat lokal penghasil enzim CGT-ase dari limbah pabrik pengolahan singkong di Lampung Timur. Isolat terbaik yaitu LTi-3-A2.4 menghasilkan enzim CGT-ase dengan aktivitas yang cukup tinggi (Wiyana, 2011).
B. Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah:
1. Memperoleh kondisi optimum bagi isolat LTi-3-A2.4 untuk dapat menghasilkan enzim CGT-ase dengan aktivitas spesifik tinggi.
2. Melihat dan mempelajari apakah dengan dilakukan variasi komposisi sumber karbon, nitrogen, ion logam dan pH pada medium kultur mampu meningkatkan produksi enzim CGT-ase dari isolat LTi-3-A2.4
C. Manfaat Penelitian
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Bakteri
Bakteri merupakan mikrobia uniseluler yang pada umumnya tidak mempunyai klorofil. Bakteri tersebar luas di alam, di dalam tanah, di dalam air, pada sumber air panas, dalam tubuh hewan, manusia dan tumbuhan. Bakteri umumnya berukuran kecil dengan karakteristik dimensi 1 µm. Beberapa kelompok memiliki flagelladan dapat bergerak aktif.
Bakteri memiliki berat jenis 1.05 - 1.1 g cm-3 dan berat sekitar 10-12 g. Ukuran aktual tergantung dari laju pertumbuhan, media tumbuh dan sebagainya. Ada tiga bentuk dasar bakteri, yaitu bentuk bulat atau kokus, bentuk batang silindris, bentuk lengkung atau vibri. Bentuk bulat atau kokus dapat dibedakan dalam : mikrokokus, diplokokus, streptokokus, tetrakokus, sarsina dan stafilo kokus. Bakteri berbentuk batang dapat dibedakan ke dalam bentuk batang panjang dan batang pendek dengan ujung datar atau lengkung. Bakteri berbentuk lengkung dapat dibagi menjadi bentuk koma (vibrio), jika lengkungnya kurang dari setengah lingkaran. Bentuk bakteri dipengaruhi oleh umur dan syarat pertumbuhan tertentu (Hidayat dkk., 2006).
Untuk mendapatkan bakteri yang potensial dilakukan dengan penapisan mikroorganisme dari lingkungan. Umumnya isolat bakteri yang diperoleh sesuai dengan lingkungan tempat hidupnya. Hal ini dikarenakan kondisi lingkungan tersebut biasanya digunakan bakteri sebagai substrat utamanya. Misalnya, bakteri amilolitik dapat diisolasi dari sampel yang berasal dari limbah pengolahan singkong, limbah sayur (Chakrabarty and Sen, 1984), rumen (Freer, 1993), serta hasil fermentasi ikan dan bahan makanan dari beras (Olympia et al.,
1. Nutrien untuk Pertumbuhan Bakteri
Suatu Organisme hidup memerlukan nutrisi untuk pertumbuhannya. Substansi kimia organik dan anorganik diperoleh dari lingkungan dalam berbagai macam bentuk. Nutrien diambil dari lingkungan kemudian ditransformasikan melalui membran plasma menuju sel. Di sel, beberapa nutrisi diolah menghasilkan energi yang digunakan dalam proses seluler (Lim, 1998).
Jasad renik heterotrof membutuhkan nutrien untuk kehidupan dan pertumbuhannya, yakni sebagai: sumber karbon, sumber nitrogen, sumber energi, dan faktor pertumbuhan, yakni mineral dan vitamin. Nutrien tersebut dibutuhkan untuk membentuk energi dan menyusun komponen-komponen sel. Setiap jasad renik bervariasi dalam kebutuhannya akan zat-zat nutrien tersebut (Suhartono, 1989).
Kebutuhan nutrien harus meliputi unsur makro esensial dan mikro esensial yang terlibat baik dalam proses metabolisme sel juga untuk mengaktifkan enzim, mensintesis vitamin dan berperan dalam sporulasi. Nutrien dasar bagi mikroorganisme harus mengandung sumber energi untuk tumbuh seperti unsur karbon, nitrogen, dan logam. Nutrien yang tergolong sumber energi adalah senyawa hasil oksidasi dari lemak, protein, amonium, karbohidrat, dan gula sederhana. Kebutuhan sumber karbon dapat dipenuhi dengan adanya CO2atau senyawa
seperti gula, pati, dan karbohidrat lain. Kebutuhan akan nitrogen dapat dipenuhi oleh NH4+
atau senyawa nitrat organik/anorganik. Untuk pertumbuhan normal mikroorganisme membutuhkan ion logam yang berfungsi sebagai kofaktor (Suhartono, 1989).
mikronutrien organik yaitu pada beberapa asam amino (triptofan) dan pada beberapa komponen-komponen DNA dan RNA (purin dan pirimidin). Beberapa unsur logam yang termasuk dalam mikronutrien anorganik adalah Co, Mo, Cu, Zn. Unsur logam ini sangat diperlukan untuk kehidupan sel meskipun jumlahnya sangat sedikit (Irianto, 2006).
2. Fase Pertumbuhan Bakteri
Suatu mikroorganisme mempunyai siklus pertumbuhan tertentu tergantung produk yang akan dihasilkan. Fase pertumbuhan bakteri dapat dibagi menjadi 4 fase, yaitu fase lag, fase logaritma (eksponensial), fase stasioner dan fase kematian. Fase lag merupakan fase penyesuaian bakteri dengan lingkungan yang baru. Lama fase lag pada bakteri sangat bervariasi, tergantung pada komposisi media, pH, suhu, aerasi, jumlah sel pada inokulum awal dan sifat fisiologis mikroorganisme pada media sebelumnya. Ketika sel telah menyesuaikan diri dengan lingkungan yang baru maka sel mulai membelah hingga mencapai populasi yang maksimum. Fase ini disebut fase logaritma atau fase eksponensial yang ditandai dengan terjadinya periode pertumbuhan yang cepat. Variasi derajat pertumbuhan bakteri pada fase eksponensial ini sangat dipengaruhi oleh sifat genetik yang diturunkannya. Selain itu, derajat pertumbuhan juga dipengaruhi oleh kadar nutrien dalam media, suhu inkubasi, kondisi pH dan aerasi. Ketika derajat pertumbuhan bakteri telah menghasilkan populasi yang maksimum, maka akan terjadi keseimbangan antara jumlah sel yang mati dan jumlah sel yang hidup (Volk dan Wheeler, 1993).
peningkatan laju kematian yang melampaui laju pertumbuhan, sehingga secara keseluruhan terjadi penurunan populasi bakteri (Volk dan Wheeler, 1993).
B. Pati
Pati atau amilum merupakan karbohidrat yang tersebar dalam tanaman terutama tanaman berklorofil. Bagi tanaman, pati merupakan cadangan makanan yang terdapat pada biji, batang dan pada bagian umbi tanaman. Banyaknya kandungan pati pada tanaman tergantung dari asal pati tersebut, misalnya pati yang berasal dari biji beras mengandung pati 50-60% dan pati yang berasal dari umbi singkong mengandung pati 80% (Winarno, 1986). Pati apabila diamati dengan mikroskop ternyata berbentuk granula-granula kecil yang bentuk dan ukurannya berbeda-beda tergantung dari tumbuhan apa pati tersebut diperoleh (Poedjiadi, 1994). Pati terdiri dari dua fraksi yang dapat dipisahkan dengan air panas. Fraksi terlarut disebut amilosa dan fraksi tidak larut disebut amilopektin (Winarno, 1986). Amilosa (15-20%) merupakan rantai panjang tidak bercabang yang terdiri dari molekul-molekul α-glukopiranosa yang bersambungan dengan ikatan α-1,4. Amilosa terdiri atas 250-300 unit D-glukosa yang terikat dengan ikatan α-1,4-glikosidik, jadi molekulnya merupakan rantai terbuka sedangkan amilopektin (80-85%) merupakan rantai bercabang sebanyak 20-30 molekul α-D-glukopiranosa yang bersambungan dengan ikatan α-1,4 dan α-1,6. Adanya
ikatan α-1,6-glikosidik ini menyebabkan terjadinya cabang, sehingga molekul amilopektin
Gambar 1. Struktur amilosa
Gambar 2. Struktur amilopektin
Amilum dalam kehidupan manusia dapat berperan sebagai sumber makanan penghasil energi utama dari golongan karbohidrat, di samping itu amilum juga dapat berperan sebagai bahan aditif pada proses pengolahan makanan, misalnya sebagai penstabil dalam proses pembuatan puding. Amilum juga berperan dalam pembuatan sirup dan pemanis buatan seperti sakarin. Dalam bidang non makanan, amilum digunakan untuk bahan baku dalam proses pembuatan kertas, pakaian dari katun, industri cat, maupun untuk produksi hidrogen (Liu, 2005).
dengan nama dekstrin. Jadi dekstrin adalah hasil antara pada proses hidrolisis amilum sebelum terbentuk maltosa (Poedjiadi, 1994). Untuk mengetahui adanya pati maka dilakukan pengujian dengan menggunakan larutan iodium (I2 dalam KI). Bila terdapat amilosa,
polimer-polimer glukosa yang lebih besar dari 20 maka akan menghasilkan warna biru. Bila polimer-polimer glukosa kurang dari 20 maka akan menghasilkan warna merah. Dekstrin dengan polimer enam, tujuh, dan delapan akan memberikan warna coklat. Polimer yang lebih kecil dari lima tidak memberikan warna dengan iodium (Winarno, 1986).
C. Enzim
Enzim adalah suatu atau beberapa gugus polipeptida (protein) yang berfungsi sebagai katalis yaitu senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi dalam suatu reaksi kimia (Maton et al., 1993). Berdasarkan cara menghasilkannya, enzim dibagi menjadi dua, yaitu
enzim ekstraseluler dan enzim intraseluler. Enzim ekstraseluler dapat diperoleh dalam keadaan murni pada biakan cair dengan cara pemisahan dan pemurnian yang tidak begitu rumit (Smith, 1990). Sedangkan enzim intraseluler memiliki peran dalam mensintesis bahan seluler dan menguraikan nutrien untuk menyediakan energi yang dibutuhkan oleh sel (Wirahadikusumah, 1989).
Enzim mempunyai peranan sebagai katalis dalam menurunkan aktivitas dari reaksi energi. Aktivasi dapat diartikan sebagai sejumlah energi atau kalori yang diturunkan oleh suatu mol zat pada temperatur tertentu untuk membawa molekul kedalam aktifnya atau keadaan aktifnya, menurunkan energi aktivasi, mempercepat reaksi pada suhu dan tekanan tetap tanpa mengubah besarnya tetapan seimbangnya, dan mengendalikan reaksi (Wirahadikusumah, 1989).
semakin meningkatkan aktivitas enzim. Aktivitas enzim meningkat pada kecepatan ini hingga mencapai kondisi optimum. Peningkatan suhu yang melebihi suhu optimumnya menyebabkan lemahnya ikatan di dalam enzim secara struktural (Pratiwi, 2008). Pada suhu maksimum enzim akan terdenaturasi karena struktur protein terbuka dan gugus non polar yang berada di dalam molekul menjadi terbuka keluar, kelarutan protein di dalam air yang polar menjadi turun, sehingga aktivitas enzim juga akan turun (Lehninger, 1982).
Aktivitas enzim juga dipengaruhi oleh konsentrasi substrat. Pada konsentrasi substrat rendah, enzim tidak mencapai konversi maksimum akibat sulitnya enzim menemukan substrat yang akan direaksikan. Seiring dengan meningkatnya konsentrasi substrat, kecepatan reaksi juga akan meningkat akibat makin cepatnya substrat terikat pada enzim. Peningkatan konsentrasi substrat pada titik jenuh tidak lagi dapat meningkatkan kecepatan laju reaksi (Pratiwi, 2008). pH lingkungan juga berpengaruh terhadap kecepatan aktivitas enzim dalam mengkatalisis suatu reaksi. Hal ini disebabkan konsentrasi ion hidrogen mempengaruhi struktur tiga dimensi enzim dan aktivitasnya. Setiap enzim memiliki pH optimum di mana pada pH tersebut struktur tiga dimensinya paling kondusif untuk mengikat substrat. Bila konsentrasi ion hidrogen berubah dari konsentrasi optimal, aktivas enzim secara progesif hilang sampai pada akhirnya enzim menjadi tidak fungsional (Lehninger, 1982).
Selain suhu, pH dan konsentrasi substrat, aktivitas enzim juga dipengaruhi oleh ada tidaknya inhibitor. Jika terdapat pengurangan laju reaksi oleh suatu senyawa, senyawa tersebut dinamakan inhibitor. Inhibitor dapat bersaing dengan substrat dalam berikatan dengan enzim, sehingga menghalangi substrat terikat pada tapak aktif enzim (Poedjiadi dan Supriyanti, 1994).
1. Oksidoreduktase, mengkatalisis berbagai macam reaksi oksidasi reduksi serta sering menggunakan koenzim seperti NAD, NADP, FAD, atau lipoleat sebagai akseptor hidrogen.
2. Transferase, mengkatalisis berbagai jenis reaksi transfer kelompok seperti aminotransferase, karnitin asil transferase, dan transkarboksilase.
3. Hidrolase, mengkatalisis reaksi pembelahan ikatan antara karbon dan beberapa atom lain dengan adanya penambahan air.
4. Liase, mengkatalisis reaksi pemecahan ikatan karbon-karbon, karbon sulfur dan karbon nitrogen tertentu.
5. Isomerase, mengkatalisis reaksi isomer optik dan geometrik dan oksidasi reduksi intramolekuler tertentu.
6. Ligase, mengkatalisis reaksi pembentukan ikatan antara karbon dan oksigen (Lehninger, 1982).
D. Enzim CGT-ase dan Produk Siklodekstrin
Siklodekstrin Glukanotransferase (CGT-ase) merupakan enzim golongan transferase yang digunakan untuk menghasilkan oligosakarida siklik berikatan α-1-4 yang disebut siklodekstrin (CD) dari pati serta dapat juga digunakan untuk menghasilkan oligosakarida lain dengan sifat yang beragam (Weijers et al., 2008). CGT-ase diproduksi oleh beberapa
bakteri, umumnya diproduksi oleh bakteri dengan genus Bacillus, dan kebanyakan CGT-ase
yang berasal dari Bacillus sp. merupakan enzim ekstraseluler kecuali CGT-ase yang berasal
dariBacillus maceransATCC8514 (Nogradyet al.,1996). CGT-ase merupakan anggota dari
keluarga enzim α-amilase (Leemhuis et al., 2003 ; Gawande et al., 2003). Meskipun
mengkatalisis reaksi transglikosilasi dimana residu glukosil digunakan sebagai akseptor dalam membentuk siklodekstrin sebagai produk utama (Nakamura et al., 1992). CGT-ase
memiliki berat molekul yang bervariasi dari 60-110 kDa dan terdiri dari 700 asam amino. Sebagian memerlukan kalsium sebagai agen pelindung terhadap denaturasi panas (Bovetto et al.,
1992).
Secara umum CGT-ase merupakan enzim induktif, memerlukan pati sebagai proses induksi, kecuali CGT-ase yang berasal dari Bacillus cereus RJ-30 (Jamuna et al., 1993). CGT-ase
alkalofilik optimum pada pH 9-10 (Tao, 1991). Suhu maksimal bagi kebanyakan bakteri CGT-ase antara 40ºC sampai 80ºC dan sebagian besar CGT-ase diinhibisi kuat oleh Zn2+, Cu2+dan Fe2+ (Tonkova, 1998).
Gambar 3.Strukturα-, β-dan γ-siklodekstrin (van der Veenet al.,2000)
Penggunaan siklodekstrin telah dilakukan di berbagai industri. Dalam industri pangan, siklodekstrin digunakan sebagai bahan enkapsulasi untuk beberapa bahan yang beraroma, vitamin C, dan pewarna alami (Reineccius, 1986). Dalam industri kosmetika digunakan untuk meningkatkan stabilitas minyak parfum terhadap oksidasi dan bau, sedangkan di industri farmasi siklodekstrin digunakan sebagai bahan pengomplek dengan vitamin A, E dan K agar stabil terhadap oksidasi (Dziezak, 1988). Selain itu siklodekstrin digunakan di industri untuk penstabil emulsi, menutup bau dan rasa dari bahan makanan serta dapat mengurangi kadar kolesterol (Yen dan Tsui, 1995; Smithet al.,1995).
Produksi siklodekstrin tidak lepas dari penggunaan enzim CGT-ase, sebab hanya enzim CGT-ase yang mampu mengkonversi pati menjadi siklodekstrin. CGT-ase dihasilkan oleh mikroorganisme biasanya adalah adalah Bacillus sp. Perbedaan jenis Bacillus akan
menghasilkan perbandingan jenis siklodekstrin yang berbeda (Akimaru et al., 1991).
Adapun sifat dariα-CD, β-CD dan γ-CD dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1.Sifat-sifat siklodekstrin (van der Veenet al.,2000)
III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan April 2012 sampai dengan bulan Juni 2012 di Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, neraca analitik, pemanas bunsen, kasa, kapas, spatula, rak tabung reaksi, jarum ose, autoklaf (model S-90N),
laminar air flow (CURMA model 9005-FL), shaker, sentrifuga, tabung sentrifuga,
mikropipet, waterbath, spektrofotometer UV-VIS, pH indikator, pH meter dan inkubator.
Sedangkan bahan yang digunakan adalah pati singkong, pati jagung, pati sagu, pati ubi jalar,
soluble strach, maltosa, urea, NH4Cl, pepton, yeast extract, CuSO4, ZnSO4, FeSO4,CaCl2
K2HPO4, MgSO4.7H2O, fenolftalein (PP), metil jingga, agar, Na2CO3, NaCl, isolat
LTi-3-A2.4, Na(K)-tartarat, CuSO4.5H2O, reagen folin ciocelteau, buffer asetat 0.1 M pH 5.5,
fenolftalein 1 mM, pereaksi C, pereaksi D, spirtus, alkohol, akuades.
C. Prosedur Penelitian
Bakteri isolat lokal LTi-3-A2.4 diremajakan dalam medium agar miringHorikoshi’s II (Park
et al., 1989) termodifikasi dengan komposisi 1% (w/v) pati singkong, 0.5% (w/v) pepton,
0.5% (w/v) yeast extract, 0.1% (w/v) K2HPO4, 0.02% (w/v) MgSO4.7H2O, 0.03% (w/v)
fenolftalein, 0.01% (w/v) metil jingga dan 1.5% (w/v) agar. Dalam penelitian ini volume medium yang digunakan untuk meremajakan dan untuk fermentasi yaitu 100 mL. Untuk meremajakan bakteri, dari komposisi yang telah disebutkan di atas kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan dilarutkan dengan akuades sebanyak 80 mL disebut larutan I. Selanjutnya membuat larutan Na2CO31% dengan cara menimbang 0.25 g Na2CO3dilarutkan
dalam 25 ml akuades dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer disebut larutan II. Sejumlah akuades disiapkan dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer disebut larutan III. Larutan I, larutan II dan larutan III disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 1 atm selama 30 menit. Setelah semua larutan steril selanjutnya sebanyak 80 mL larutan (1), 17 mL larutan (2) dan 3 mL larutan (3) dicampurkan dalam satu erlenmeyer di dalam
Laminar Air Flow. Setelah itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak ± 5 mL,
dimiringkan dan didiamkan pada suhu kamar. Setelah medium memadat dilakukan inokulasi bakteri isolat lokal LTi-3-A2.4 ke dalam medium agar miring. Kemudian diinkubasi selama 3 hari dalam inkubator.
2. Pembuatan Medium
a. Pembuatan Medium Inokulum Nutrient Broth (NB)
b. Pembuatan Medium Kultur
Medium kultur menggunakan medium cair Horikoshi’s II termodifikasi tanpa fenolftalein, metil jingga dan agar yang disiapkan dengan cara menimbang pati singkong sebanyak 1 gram, pepton 0.5 gram, yeast extract 0.5 gram, K2HPO40.1 gram,MgSO4.7H2O 0.02 gram,
kemudian semua bahan tersebut dimasukan ke dalam erlenmeyer, dilarutkan dengan akuades sebanyak 80 mL dan dipanaskan disebut sebagai larutan (1). Selanjutnya, sebanyak 0.25 gram Na2CO3 dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan dilarutkan dengan akuades sebanyak 25
mL disebut sebagai larutan (2) , disiapkan juga akuades sebanyak 5 mL dalam erlenmeyer dan disebut sebagai larutan (3) dan kemudian disterilkan dalam autoklaf. Setelah semua
larutan steril selanjutnya sebanyak 80 mL larutan (1), 17 mL larutan (2) dan 3 mL larutan (3) dicampurkan di dalamlaminar air flowsampai menunjukkan pH 10.
3. Pembuatan Pereaksi
Pereaksi yang akan digunakan pada penelitian ini yaitu: pereaksi CGT-ase (Kaneko et al.,
1987; Alves-Pradoet al.,2008), dan pereaksi Lowry (Lowryet al., 1951). Pereaksi CGT-ase
digunakan untuk menguji aktivitas ekstrak kasar enzim CGT-ase, sedangkan pereaksi Lowry digunakan untuk menguji kadar protein ekstrak kasar enzim CGT-ase.
a. Pembuatan Substrat untuk Uji Aktivitas Enzim CGT-ase
Substrat yaitu larutan soluble starch 1% (w/v) disiapkan dengan cara melarutkan 1 gram soluble starch ke dalam 100 mL buffer asetat 0.1M pH 5.5 kemudian dipanaskan hingga
b. Pembuatan Pereaksi Lowry
Pereaksi Lowry terdiri atas 4 macam, yang meliputi Pereaksi A, B, C, dan D. Masing-masing pereaksi tersebut disiapkan sebagai berikut: Pereaksi A: 2 g Na2CO3 dilarutkan dalam 100
mL NaOH 0,1N; Pereaksi B: 5 mL larutan CuSO4.5H2O 1% (w/v) ditambahkan 5 mL larutan
Na(K)-tartarat 1% (w/v); Pereaksi C: 2 mL pereaksi B ditambah 100 mL pereaksi A; dan Pereaksi D: reagenFolin-Ciocelteau diencerkan dengan akuades 1:1. Larutan standar protein
digunakan BSA (Bovine Serum Albumine) dengan konsentrasi 500-5000 ppm.
4. Pengaruh Beberapa Faktor Terhadap Pertumbuhan Bakteri LTi-3-A2.4 dan Produksi Enzim CGT-ase
a. Pengaruh Sumber C
Sumber karbon yang digunakan dalam penelitian ini adalahsoluble starch, pati singkong, pati
jagung, pati sagu, pati ubi jalar, dan maltosa. Variasi sumber karbon pada medium kultur dengan mengganti pati singkong pada medium kultur Horikoshi’s II termodifikasi dengan sumber karbon dari jenis pati lain yang telah disebutkan. Starter diinokulasikan ke dalam medium kultur dan dilakukan sampling setiap 12 jam selama 72 jam seperti pada prosedur 5, kemudian diukur nilai OD, aktivitas enzim CGT-ase, dan kadar protein seperti pada prosedur 6.
Dari hasil variasi sumber C terbaik, dilakukan variasi sumber N pada medium kultur dengan cara mengganti pepton menjadi urea, NH4Cl, dan yeast extract. Selanjutnya dilakukan
perlakuan yang sama dengan prosedur 5 dan 6.
c. Pengaruh Sumber Ion Logam
Dari hasil variasi sumber N terbaik, dilakukan variasi sumber ion logam pada medium kultur dengan cara mengganti MgSO4.7H2O 0.02% (w/v) dengan CuSO4.7H2O 0.02% (w/v) ,
FeSO4.7H2O 0.02% (w/v), ZnSO4.7H2O 0.02% (w/v), dan CaCl2.2H2O 10 mM. Selanjutnya
dilakukan perlakuan yang sama dengan prosedur 5 dan 6.
d. Pengaruh pH
Medium kultur dengan komposisi sumber C, sumber N, dan sumber ion logam terbaik, dilakukan variasi pH dari pH 7 – 11. Selanjutnya dilakukan perlakuan yang sama dengan prosedur 5 dan prosedur 6.
5. Ekstrak Kasar Enzim CGT-ase
Untuk mendapatkan ekstrak kasar enzim CGT-ase yaitu dengan menyiapkan medium inokulum dan medium kultur yang akan digunakan. Inokulum disiapkan dengan menginokulasikan 1 ose biakan isolat ke dalam Erlenmeyer 250 mL yang berisi larutan NB, kemudian diinkubasi pada shaker dengan kecepatan 105 rpm pada suhu 37ºC selama 1
malam (overnight: 16-20 jam). Inokulum ini selanjutnya akan digunakan untuk
Medium kultur yang telah diinokulasikan sebanyak 1% inokulum : kultur kemudian diinkubasi pada shaker dengan kecepatan 105 rpm dengan suhu 37ºC selama 3 hari dan di-sampling secara berkala setiap 12 jam selama 72 jam. Ekstrak kasar enzim CGT-ase
diperoleh melalui proses sentrifugasi.
6. Penentuan Pertumbuhan Sel, Uji Aktivitas dan Uji Kadar Protein Enzim
a. Penentuan Pertumbuhan Sel
Penentuan pertumbuhan sel ini dilakukan untuk mengetahui pertumbuhan dari sel bakteri. Sebanyak 0,3 mL kultur dimasukan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 2,7 mL akuades lalu diukur serapannya menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 600 nm.
b. Penentuan Aktivitas Enzim CGT-ase
Aktivitas enzim CGT-ase dilakukan dengan menyiapkan ekstrak kasar enzim dari sampel kultur. Sampel kultur disentrifugasi dan supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim CGT-ase. Ekstrak kasar ini kemudian diuji aktivitas dan ditentukan kadar proteinnya.
Aktivitas enzim CGT-ase diukur berdasarkan metode Kaneko et al. (1987) dan dimodifikasi
oleh Alves-Pradoet al.(2008). Sebanyak 100 µL larutan enzim ditambahkan 800 µLsoluble starch 1% yang disiapkan dalam buffer asetat 0.1 M dan diinkubasi pada suhu 55ºC selama
10 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 4 mL Na2CO3 0.25 M kemudian
ditambahkan 0.1 mL larutan fenolftalein 1 mM. Absorbansi diukur pada λmaks 550 nm.
c. Penentuan Kadar Protein Enzim
Penentuan kadar protein dilakukan dengan cara sebanyak 0,1 mL larutan enzim ditambahkan 0,9 mL akuades lalu direaksikan dengan 5 mL pereaksi C. Campuran diaduk secara merata dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Kemudian ditambahkan dengan cepat 0,5 mL pereaksi D dan diaduk dengan sempurna. Setelah itu didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Sebagai kontrol, larutan enzim diganti dengan akuades. Kontrol diperlakukan
sama dengan perlakuan pada sampel. Pengukuran serapan dilakukan pada λmaks 600 nm.
Konsentrasi protein dihitung dengan mengekstrapolasi nilai absorban sampel terhadap kurva standar BSA.
Pati singkong pada Medium
Kultur Horikoshi’s II
-Diganti dengan Pati soluble, pati jagung, pati ubi jalar, pati sagu, dan maltosa+pati singkong
Medium Kultur Variasi
Sumber C
-Diinokulasikan NB yang telah diinkubasi overnight
-Disampling setiap 12 jam selama 72 jam -Dilakukan penentuan pertumbuhan sel,
-Digunakan kembali pada medium kultur untuk variasi selanjutnya
-Diganti dengan yeast extract, urea, dan NH4Cl
Medium Kultur Variasi
Sumber N
-Dilakukan perlakuan yang sama seperti perlakuan pada medium kultur variasi C
Sumber N terbaik
1
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Berdasarkan hasil yang diperoleh dari penelitian yang telah dilakukan maka dapat ditarik simpulan sebagai berikut :
1. Waktu inkubasi optimum produksi enzim CGT-ase dari isolat LTi-3-A2.4 pada semua variasi komposisi terbaik yaitu pada 36 jam.
2. Pada variasi komposisi medium kultur Horikoshi’s II termodifikasi yang telah dilakukan, diperoleh sumber karbon, sumber nitrogen, sumber ion logam, dan pH terbaik yaitu pati singkong, NH4Cl, MgSO4.7H2O dan pH 7.
3. Pada medium kultur dengan komposisi terbaik tersebut dihasilkan aktivitas spesifik 3 kali lipat lebih besar daripada medium kultur awal. Aktivitas spesifik yang dihasilkan 639.42 U/mg.
4. Efek NH4Cl sebagai sumber nitrogen pada medium kultur yaitu
2
B. Saran
PENGARUH BEBERAPA FAKTOR PADA MEDIUM KULTUR TERHADAP PERTUMBUHAN DAN PRODUKSI ENZIM CGT-ASE
DARI BAKTERI AMILOLITIK ISOLAT LOKAL LTI-3-A2.4
(Skripsi)
Oleh
MUHAMAD RAMDHAN NUGRAHA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG
ABSTRAK
PENGARUH BEBERAPA FAKTOR PADA MEDIUM KULTUR TERHADAP PERTUMBUHAN DAN PRODUKSI ENZIM CGT-ase
DARI BAKTERI AMILOLITIK ISOLAT LOKAL LTI-3-A2.4
Oleh
Muhamad Ramdhan Nugraha
Bakteri amilolitik merupakan bakteri yang dapat mendegradasi pati menjadi glukosa dengan menghasilkan enzim amilase. Akan tetapi bakteri tersebut memiliki peluang dalam menghasilkan enzim ekstraseluler lainnya seperti enzim CGT-ase yang dapat mengubah pati menjadi siklodektrin. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh kondisi optimum untuk menghasilkan enzim CGT-ase dengan aktivitas spesifik tinggi.
Pada penelitian ini, digunakan bakteri amilolitik isolat lokal LTi-3-A2.4 yang telah berhasil diisolasi oleh peneliti sebelumnya, yang merupakan bakteri penghasil enzim CGT-ase. Dalam penelitian ini, dilakukan optimasi produksi enzim CGT-ase dengan cara memvariasikan sumber karbon (pati singkong,
soluble starch, pati jagung, pati ubi jalar, pati sagu, dan campuran maltosa dan
pati singkong), sumber nitrogen (pepton, yeast extract, urea, NH4Cl), sumber ion
logam (MgSO4, CuSO4, ZnSO4, FeSO4, CaCl2) dan variasi pH (7-11) pada
medium kultur Horikoshi’s IItermodifikasi.
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan diperoleh kondisi optimum untuk produksi enzim CGT-ase dari isolat LTi-3-A2.4 yaitu pada medium kultur variasi terbaik dengan komposisi : pati singkong, NH4Cl, MgSO4 pada pH 7. Pada
ABSTRACT
EFFECT OF SEVERAL FACTORS ON CULTURE MEDIUM TOWARD GROWTH AND PRODUCTION OF CGT-ASE FROM LOCAL
AMYLOLYTIC BACTERIA LTI-3-A2.4
By
Muhamad Ramdhan Nugraha
Commonly, amylolytic bacteria degrading starch into glucose by it amylase. Another extracellular enzyme such as CGT-ase that enable to convert starch into cyclodextrins is produced by these class of bacteria. This research was aimed to obtain optimum conditions for producing high specific activity CGT-ase. A local isolate named as strain LTi-3-A2.4 which has been isolated by previously researcher was used. In this research, the optimization of CGT-ase production was conducted by varying of carbon’s source (cassava starch, soluble starch, corn starch, sweet potato stach, sago starch, and a mixture of maltose and cassava starch), nitrogen’s source (pepton, yeast extract, urea, NH4Cl), metal ions
(MgSO4, CuSO4, ZnSO4, FeSO4, CaCl2) and the pH (from pH 7 to 11) on
modified Horikoshi’s II culture medium.Based on results, the optimum condition for producing the CGT-ase of strain LTi-3-A2.4 showed the best in culture medium composed with cassava starch, NH4Cl, MgSO4, and on pH 7. In this
condition, activity and specific activity of the enzyme are 472.72 U/mL dan 639.42 U/mg, respectively. Compared to the control medium, the specific activity of the enzyme increased three fold.
PENGARUH BEBERAPA FAKTOR PADA MEDIUM KULTUR TERHADAP PERTUMBUHAN DAN PRODUKSI ENZIM CGT-ASE
DARI BAKTERI AMILOLITIK ISOLAT LOKAL LTI-3-A2.4
Oleh
Muhamad Ramdhan Nugraha
Skripsi
Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mencapai Gelar SARJANA SAINS
Pada Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG
Judul Skripsi : PENGARUH BEBERAPA FAKTOR PADA MEDIUM KULTUR TERHADAP
PERTUMBUHAN DAN PRODUKSI ENZIM CGT-ASE DARI BAKTERI AMILOLITIK ISOLAT LOKAL LTI-3-A2.4
Nama Mahasiswa : Muhamad Ramdhan Nugraha Nomor Pokok Mahasiswa : 0817011042
Jurusan : Kimia
Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
MENYETUJUI 1. Komisi Pembimbing
Pembimbing I Pembimbing II
Mulyono, Ph.D. Dian Herasari, M.Si.
NIP. 197406112000031002 NIP. 197108062000032001
2. Ketua Jurusan
MENGESAHKAN
1. Tim Penguji
Ketua :Mulyono, Ph.D. …………....
Sekretaris :Dian Herasari, M.Si. …………....
Penguji
Bukan Pembimbing :Dr. Ir. Yandri A.S., M.S. …………....
2. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Prof. Suharso, Ph.D. NIP 196905301995121001
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bandung, Jawa Barat pada tanggal 23 April 1990, sebagai anak pertama dari tiga bersaudara, putra dari Drs. Dadang Syarif Hidayat dan Anah Aminah, S.Pd. Jenjang pendidikan diawali dari Sekolah Dasar (SD) di SD Negeri Dwi Dharma Subang diselesaikan pada tahun 2002. Sekolah Menengah Pertama (SMP) di SMP Negeri 1 Subang selama 1 tahun kemudian diselesaikan di SMP Negeri 2 Pagaden pada tahun 2005, dan Sekolah Menengah Atas (SMA) di SMA Negeri 1 Subang diselesaikan pada tahun 2008. Tahun 2008, penulis terdaftar sebagai Mahasiswa Jurusan Kimia FMIPA Unila melalui jalur SNMPTN (Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Nasional).
Motto
Bacalah dengan nama Tuhanmu yang menciptakan.
Dia telah menciptakan manusia dari segumpal
darah. Bacalah, dan Tuhanmulah Yang Maha
Pemurah. Yang mengajar dengan Qalam. Dialah
yang mengajar manusia segala yang belum
diketahui
(QS. Al Alaq : 1-5)
Bukan harta kekayaanlah, tetapi ilmu dan budi
pekerti yang harus ditinggalkan sebagai pusaka
untuk anak-anak kita.
Tidak ada kekayaan yang melebihi akal, dan tidak
ada kemelaratan yang melebihi kebodohan
Pengalaman adalah guru yang terbaik akan tetapi
buanglah pengalaman buruk yang hanya
merugikan
Terlambat memang lebih baik daripada tidak sama
sekali, tetapi apabila berkali-kali adalah suatu
kecerobohan
Manusia tidak merancang untuk gagal, mereka
gagal untuk merancang
PERSEMBAHAN
Kupersembahkan karya sederhana ini kepada :
Ayahanda Drs. Dadang Syarif Hidayat dan Ibunda Anah Aminah, S.Pd. tercinta dan tersayang,
Adik-adikku tersayang
Muhamad Yusuf dan Dini Ishmatu Amri
Segenap Keluarga besarku yang selalu mendoakan keberhasilanku,
Sahabat dan teman-temanku yang selalu berbagi kebahagiaan,
Seseorang yang kelak akan mendampingiku,
SANWACANA
Segala puji dan syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT, karena atas segala rahmat dan karunia-Nya skripsi ini dapat diselesaikan.
Skripsi dengan judul "Pengaruh Beberapa Faktor Pada Medium Kultur
Terhadap Pertumbuhan dan Produksi Enzim CGT-ase dari Bakteri Amilolitik Isolat Lokal LTi-3-A2.4" adalah salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.
Dalam pelaksanaan dan penulisan skripsi ini tidak lepas dari kesulitan dan rintangan, namun itu semua dapat penulis lalui berkat rahmat dan ridha Allah SWT serta bantuan dan dorongan semangat dari orang-orang yang hadir dikehidupan penulis. Dalam kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih setulus-tulusnya kepada :
2. Ibu Dian Herasari, M.Si. selaku pembimbing kedua yang telah memberikan kritik, saran, arahan yang diberikan kepada penulis sehingga skripsi ini terselesaikan dengan baik.
3. Bapak Dr. Ir. Yandri A.S., M.S., selaku pembahas yang telah memberikan semangat, kritik, saran dan arahan kepada penulis sehingga skripsi ini terselesaikan dengan baik.
4. Ibu Dra. Fifi Martasih M.Sc. selaku Pembimbing Akademik atas kesediaannya utuk memberikan bimbingan, bantuan, nasehat dan informasi yang bermanfaat kepada penulis.
5. Seluruh dosen FMIPA Unila yang telah mendidik dan memberikan ilmu pengetahuan yang sangat berguna kepada penulis selama kuliah.
6. Bapak Andi Setiawan, Ph.D., selaku ketua Jurusan Kimia FMIPA Unila. 7. Bapak Prof. Suharso, Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
9. Yang selalu menyemangati dan menemaniku selama menyelesaikan skripsi ini Reni Febriyanti, S.Si. serta adik-adikku tersayang Muhamad Yusuf dan Dini Ishmatu Amri yang selalu membuat senyum dihatiku
10. Keluarga besarku yang selalu memberikan motivasi, dukungan dan doa untuk keberhasilanku.
11. Sahabat-sahabatku angkatan 2008 : TB, Ruzki, Subari, Idrus, Eko, Majid, Rudi, Robi, Mychel, Riki, Raffel, Richardo, Arif, Albert, S.Si., Puji, S.Si., Ramli, S.Si., Miftasani, Putri, Novi, Dewa, Ayu, Nanda, Chandra, Nuro, Retno, Qie, Evi, Wanti, Dewi, Nita, Leni, S.Si., Eni, S.Si., Sri, S.Si., Siti, S.Si., Shoffa, S.Si., Eli, S.Si., Ani, S.Si. terima kasih untuk kebersamaan dan keceriaan selama ini, tetaplah semangat dan jangan menyerah dimanapun kapanpun.☺
13. Teman-teman Kimia 2005, 2006, 2007, 2009, 2010, 2011 dan 2012 FMIPA Unila yang tidak bisa disebut satu persatu, terima kasih atas segala dukungannya.
14. Terimakasih untuk Mba Nora, Mba Karlina, Bunda, Mas Nomo, Mas Udin atas bantuannya selama ini
15. Semua pihak yang telah membantu dan mendukung penulis dalam penyusunan skripsi ini.
Akhir kata, Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Penulis berharap semoga skripsi yang sederhana ini dapat berguna dan bermanfaat bagi kita semua. Amin.
Bandar Lampung, 9 November 2012 Penulis
