AKTIVITAS INHIBITOR α
-GLUKOSIDASE DAN PROFIL
SENYAWA DARI EKSTRAK ETIL ASETAT METABOLIT
Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 YANG DITUMBUHKAN
PADA MEDIA YS DAN ISP-2
MIRZA ANGGRIAWIN
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Aktivitas Inhibitor α-Glukosidase dan Profil Senyawa dari Ekstrak Etil Asetat Metabolit
Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang ditumbuhkan pada Media YS dan ISP-2 adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, November 2016
Mirza Anggriawin
RINGKASAN
MIRZA ANGGRIAWIN. Aktivitas Inhibitor α-Glukosidase dan Profil Senyawa dari Ekstrak Etil Asetat Metabolit Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang ditumbuhkan pada Media YS dan ISP-2. Dibimbing oleh YULIN LESTARI dan MIN RAHMINIWATI.
Streptomyces merupakan salah satu bakteri endofit yang termasuk ke dalam kelompok aktinomiset yang diketahui menghasilkan senyawa bioaktif dengan beragam fungsi biologi. Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 merupakan salah satu aktinomiset endofit asal Tinospora crispa yang dapat menghasilkan inhibitor α-glukosidase. Aktinomiset endofit ini memiliki potensi sebagai antidiabetik melalui aktivitas inhibisi α-glukosidase. Pertumbuhan dan produksi senyawa bioaktif dapat dipengaruhi oleh jenis media pertumbuhan. Telaah lebih lanjut mengenai potensi, karakteristik dari senyawa aktif, perlu diidentifikasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji aktivitas inhibitor α-glukosidase dan profil senyawa dari ekstrak etil asetat metabolit Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang ditumbuhkan pada media Yeast Soluble Starch (YS) dan
International Streptomyces Project No.2 (ISP-2).
Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 ditumbuhkan pada media Yeast Soluble Starch Agar (YSA) selama 10 hari. Kultur kemudian diinokulasikan pada media YS dan ISP-2 dan ditumbuhkan selama 15 hari pada suhu ruang. Proses ekstraksi dilakukan menggunakan etil asetat. Ekstrak kering etil asetat digunakan
untuk uji inhibisi α-glukosidase dan penentuan profil senyawa. Aktivitas inhibisi α-glukosidase diukur secara in vitro menggunakan spektrofotometer, sedangkan
profil senyawa dinilai menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
Aktivitas inhibisi α-glukosidase dari ekstrak etil asetat Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang ditumbuhkan pada media YS adalah 51.95%, sedikit lebih besar dibandingkan pada ISP-2 (50.36%). Nilai IC50 ekstrak etil asetat dari media YS adalah 6.35 μg mL-1 sedangkan dari media ISP-2 sebesar 11.40 μg mL-1. Sementara itu, nilai IC50 akarbosa yang digunakan sebagai pembanding sebesar 0.88 μg mL-1.Berdasarkan analisis KLT, ekstrak etil asetat mengandung enam pita yang mengindikasikan adanya senyawa pada ekstrak yang memiliki aktivitas inhibisi α-glukosidase. Pita berwarna merah dengan nilai Retardation Factor (Rf) 0.02 yang diperoleh dari ekstrak etil asetat media YS kemungkinan terkait dengan keberadaan senyawa antosianidin. Sementara itu, pita berwarna biru dengan nilai Rf berkisar antara 0.03 sampai 0.98 yang diperoleh dari ekstrak etil asetat media YS dan ISP-2 kemungkinan berkaitan dengan keberadaan senyawa flavon, flavonon, flavonol, dan isoflavon.
SUMMARY
MIRZA ANGGRIAWIN. Inhibitory Activity of α-Glucosidase and Compound Profilling of Ethyl Acetate Extract from Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 Metabolites Grown in YS and ISP-2 Media. Supervised by YULIN LESTARI and MIN RAHMINIWATI.
Streptomyces is one of endophytic bacteria belongs to actinomycetes group, and it is known to produce bioactive compounds wich various biological function.
Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 an endophytic actinomycetes from Tinospora crispa can produce α-glucosidase inhibitors. The endophyte has the potency as an antidiabetics through its α-glucosidase inhibition activity. The growth and production of bioactive compound can be influenced by type of growth media. To further explore its potency, characteristic of the active compound need to be assessed. The work aimed to assess the activity of α-glucosidase inhibitor and compound profilling of ethyl acetate extract metabolites of Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 grown in Yeast Soluble Starch (YS) and International Streptomyces Project No.2 (ISP-2) media.
Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 was grown in Yeast Soluble Starch Agar (YSA) for 10 days. The culture was then innoculated to YS and ISP-2 and grown for 15 days at room temperature. The extraction process has been carried out with ethyl acetate. Dried ethyl acetate extract was used for α-glucosidase inhibition test and compound profilling. Activity of α-glucosidase inhibitor was measured in vitro using spectrophotometry. While compound profilling was assessed using Thin Layer Cromatography (TLC).
The α-glucosidase inhibition activity of ethyl acetate extract from
Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 grown in YS medium was 51.95% which was slightly higher than those grown in ISP-2 (50.36%). The IC50 value of ethyl acetate extract from YS medium was 6.35 μg mL-1 while from ISP-2 medium was 11.40 μg mL-1. Meanwhile, the IC50 value of acarbose as comparator was 0.88 μg mL-1. Based on the TLC analysis, the ethyl acetate extract contained six bands indicating the presence of compounds found in the extract having α-glucosidase inhibitory activity. Red band that has Retardation Factor (Rf) 0.02 of ethyl acetate extract from YS medium might indicated the presence of anthocyanidine. Meanwhile, blue bands which Rf value ranging from 0.03 to 0.98 of ethyl acetate extract from both YS and ISP-2 media might be related to the presence of flavone, flavonone, flavonole, and isoflavone compounds.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Mikrobiologi
AKTIVITAS INHIBITOR α
-GLUKOSIDASE DAN PROFIL
SENYAWA DARI EKSTRAK ETIL ASETAT METABOLIT
Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 YANG DITUMBUHKAN
PADA MEDIA YS DAN ISP-2
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2016
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian ini adalah kemampuan Streptomyces sebagai inhibitor α-glukosidase, dengan judul Aktivitas Inhibitor α-Glukosidase dan Profil Senyawa dari Ekstrak Etil Asetat Metabolit Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang ditumbuhkan pada Media YS dan ISP-2.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Ir Yulin Lestari dan Ibu Drh Min Rahminiwati, MS, PhD selaku pembimbing yang telah memberikan arahan, nasehat, waktu konsultasi, motivasi serta bimbingannya selama penulis melaksanakan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Penulis juga ingin mengucapkan terima kasih kepada penguji luar komisi Ibu Dr Wulan Triwahyuni, MSi dan Bapak Prof Dr Aris Triwahyudi, MSi yang mewakili Ibu Prof Dr Anja Meryandini, MS sebagai Ketua Program Studi Mikrobiologi IPB yang telah memberikan motivasi dan masukan selama ujian tesis. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada para dosen Program Studi Mikrobiologi atas bimbingan dan ilmu yang diberikan kepada penulis selama menempuh studi di Program Studi Mikrobiologi SPs IPB. Departemen Biologi dan Pusat Studi Biofarmaka Tropika atas fasilitas yang disediakan. Bapak Jaka dan Ibu Heni selaku staf Laboratorium Mikrobiologi IPB, Ibu Retno selaku staf Laboratorium Terpadu Biologi IPB, Mas Endi, Mas Nio, Mas Iyus, Mba Ela, Mba Ina, Mba Wiwik, Ibu Nunuk selaku staf Laboratorium PSB – LPPM IPB atas kerjasama yang diberikan. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Mba Sari, Kiki, Wulan, teman-teman di Laboratorium Mikrobiologi IPB dan Laboratorium PSB – LPPM IPB, teman-teman di Pascasarjana Mikrobiologi IPB angkatan 2013, serta seluruh pihak atas kerja sama dan dukungan yang diberikan.
Ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada bapak, mamak, adik, Ria, serta seluruh keluarga atas doa, dukungan dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat dan menambah wawasan bagi pembaca.
Bogor, November 2016
DAFTAR ISI
Aktinomiset Penghasil Inhibitor α-Glukosidase 3
Ekstraksi Senyawa Inhibitor α-Glukosidase 4
Inhibitory Concentration50 (IC50) 4
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) 5
METODE 5
Alur Penelitian 5
Waktu dan Tempat Penelitian 6
Bahan 6
Alat 6
Peremajaan Isolat dan Produksi Senyawa Inhibitor α-Glukosidase 6
Ekstraksi Senyawa Inhibitor α-Glukosidase 6
Uji Aktivitas Senyawa Inhibitor α-Glukosidase 7 Penentuan Nilai IC50 Ekstrak Etil Asetat Senyawa Inhibitor
α-Glukosidase 7
Pemisahan Senyawa Inhibitor α-Glukosidase dengan Metode
DAFTAR TABEL
1 Sistem reaksi uji inhibitor α-glukosidase untuk satu sampel 7
2 Aktivitas inhibisi supernatan Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539Error! Bookmark not defined.
terhadap enzim α-glukosidase 10
3 Aktivitas inhibisi akarbosa dan ekstrak etil asetat Streptomyces sp.
IPBCC.B.15.1539 terhadap enzim α-glukosidase 10
DAFTAR GAMBAR
1 Diagram alir penelitian 5
2 Morfologi Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 umur 10 hari pada media YSA, (A) miselium aerial (B) rantai spora, perbesaran 10x40 8 3 Tampilan fisik media produksi, (A) media YS (B) media ISP-2,
sebelum pertumbuhan Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 9 4 Tampilan fisik media produksi, (A) media YS (B) media ISP-2, setelah
pertumbuhan Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 selama 15 hari pada
suhu 26-28 °C 9
5 Persamaan logaritmik ekstrak etil asetat media YS (A), media ISP-2
(B),ddan akarbosa (C) terhadap nilai inhibisi enzim α-glukosidase 11 6 Visualisasi KLT senyawa inhibitor α-glukosidase dari media produksi
YS (A) cahaya tampak, panjang gelombang 254 nm, panjang gelombang 366 nm (B) densitogram pengolahan ImageJ yang menunjukkan enam pita yang terkandung dalam ekstrak etil asetat 12 7 Visualisasi KLT senyawa inhibitor α-glukosidase dari media produksi
ISP-2 (A) cahaya tampak, panjang gelombang 254 nm, panjang gelombang 366 nm (B) densitogram pengolahan ImageJ yang menunjukkan enam pita yang terkandung dalam ekstrak etil asetat 12
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi media 22
2 Nilai absorbansi uji aktivitas inhibisi akarbosa terhadap enzim
α-glukosidase 22
3 Nilai absorbansi uji aktivitas inhibisi ekstrak etil asetat Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang ditumbuhkan pada media YS terhadap enzim
α-glukosidase 22
4 Nilai absorbansi uji aktivitas inhibisi ekstrak etil asetat Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang ditumbuhkan pada media ISP-2 terhadap enzim
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Streptomyces merupakan salah satu bakteri endofit yang termasuk ke dalam kelompok aktinomiset yang diketahui menghasilkan senyawa yang dapat digunakan sebagai antibiotik, antimikroba, dan inhibitor enzim, diantaranya adalah inhibitor enzim α-glukosidase (Hyun et al. 2005). Alpha-glukosidase merupakan enzim penting dalam proses penyerapan karbohidrat. Enzim ini menghidrolisis ikatan 1.4 glikosida antara karbohidrat yang akan melepaskan glukosa sehingga memicu peningkatan kadar gula darah setelah makan. Inhibitor α-glukosidase yang diisolasi dari ekstrak daun Belamcanda chinensis mampu menunda penyerapan karbohidrat dan memperlambat peningkatan kadar gula darah (Wu et al. 2012). Peningkatan kadar gula darah setelah makan sering dialami oleh penderita diabetes. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan inhibitor α-glukosidase yang secara klinis digunakan sebagai bahan anti hiperglikemia (Frantz et al. 2005).
Pada penelitian sebelumnya, telah dilakukan penapisan bakteri endofit dari bagian akar, batang, dan daun tanaman Tinospora crispa. Hasil penapisan ini diperoleh 10 isolat endofit yang memiliki aktivitas inhibitor α-glukosidase. Selanjutnya, Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang merupakan bakteri endofit pada bagian akar T. crispa memiliki aktivitas inhibitor α-glukosidase tertinggi. Aktivitas ini diperoleh setelah dilakukan proses pengujian dengan p-nitrophenyl-alpha-D-gluco-pyranoside sebagai substrat dan ekstrak kasar dari Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 sebagai bahan uji (Pujiyanto 2012).
Pada penelitian lebih lanjut, telah diketahui aktivitas penghambatan dengan menggunakan ekstrak etil asetat dari Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539terhadap enzim α-glukosidase yang menunjukkan penurunan aktivitas α-glukosidase. Ekstrak etil asetat kemudian dilakukan fraksinasi dan diperoleh sebanyak 201 fraksi dengan fraksi yang menunjukkan hasil tertinggi pada fraksi F6. Lebih lanjut, fraksi F6 dilakukan proses identifikasi senyawa dan diketahui termasuk ke dalam senyawa flavonoid dan diduga dari kelompok auron (Pujiyanto 2012).
Kemampuan ekstrak ini kemudian dicobakan lebih lanjut pada hewan uji mencit yang menunjukkan penurunan kadar glukosa darah mencit berdasarkan uji toleransi glukosa oral dan induksi streptozotosin setelah 15 hari perlakuan (Velina 2012). Kemampuan Streptomyces sp. dalam menghasilkan metabolit sekunder diduga dipengaruhi media pertumbuhan yang digunakan. Media dengan kandungan starch dapat mempengaruhi produksi metabolit sekunder pada kebanyakan Streptomyces sp. (Bundale et al. 2015). Salah satu media yang komposisinya terdiri dari starch adalah media Yeast Soluble Starch (YS).
Pada suatu ekstrak, terkandung berbagai macam senyawa aktif. Senyawa aktif ini dapat diidentifikasi dengan menggunakan berbagai metode, salah satunya dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis (Markham 1988). Pada penelitian ini dilakukan analisis ekstrak etil asetat Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang diproduksi dari media pertumbuhan Yeast Soluble Starch
2
Perumusan Masalah
Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang diekstrak menggunakan etil asetat, diketahui memiliki kemampuan sebagai inhibitor α-glukosidase. Namun, kemampuan isolat ini yang ditumbuhkan pada media pertumbuhan YS dan ISP-2 dalam menghasilkan inhibitor α-glukosidase belum diketahui. Kandungan senyawa yang dihasilkan melalui pola yang terbentuk pada KLT serta nilai IC50 dari ekstrak etil asetat yang mengandung senyawa inhibitor α-glukosidase juga belum diketahui.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis kemampuan inhibitor α-glukosidase ekstrak etil asetat Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang
diproduksi dari media pertumbuhan YS dan ISP-2, kandungan senyawa berdasarkan uji KLT, dan nilai IC50 ekstrak etil asetat dari kedua media.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai media pertumbuhan yang dapat digunakan untuk menghasilkan inhibitor α-glukosidase, aktivitas inhibitor α-glukosidase yang dihasilkan, serta kandungan senyawa yang terdapat dalam ekstrak.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini mencakup kajian tentang pertumbuhan Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 pada media produksi YS dan ISP-2, aktivitas senyawa bioaktif berkhasiat sebagai inhibitor α-glukosidase, ekstraksi senyawa yang dihasilkan menggunakan etil asetat, uji penghambatan terhadap α-glukosidase, nilai IC50 dari ekstrak serta profil senyawa yang terbentuk berdasarkan pola pada KLT.
TINJAUAN PUSTAKA
Inhibitor α-Glukosidase
3 α-amilase pankreatik dihasilkan dalam memperlambat penyerapan karbohidrat menjadi monosakarida yang dapat diserap, sehingga dapat menurunkan hiperglikemia posprandial (Adisakwattana dan Chanathong 2011). Penyerapan karbohidrat yang diperlambat menyebabkan perlambatan dalam peningkatan kadar gula darah, sehingga kadar gula darah tidak terlalu meningkat setelah mengkonsumsi makanan (Bansal 2015).
Inhibitor α-glukosidase dan α-amilase adalah obat yang dirancang untuk dapat dikembangkan dalam pengobatan diabetes, obesitas dan hiperglikemia (Sama et al. 2012). Obat ini berperan dalam memperlambat penyerapan karbohidrat sehingga pelepasan gula yang akan digunakan oleh tubuh berlangsung secara perlahan. Obat ini beperan sebagai inhibitor dengan struktur menyerupai substrat normal enzim, berkompetisi dengan substrat normal untuk berikatan dengan enzim (MHRA 2010). Penggunaan obat antidiabetes yang bekerja sebagai inhibitor α-glukosidase yang secara klinis digunakan sebagai bahan
antihiperglikemia (Frantz et al. 2005) sudah banyak digunakan. Inhibitor α-glukosidase yang diisolasi dari ekstrak daun Belamcanda chinensis mampu
menunda penyerapan karbohidrat dan memperlambat peningkatan kadar gula darah (Wu et al. 2012).
Inhibitor α-glukosidase dapat digunakan untuk mengobati diabetes melitus (DM) tipe II. Pada DM tipe II, insulin yang dihasilkan bekerja kurang sempurna karena gangguan reseptor insulin pada sel target, sehingga terjadi peningkatan kadar glukosa darah. Diabetes melitus tipe II ditandai dengan penurunan sekresi insulin dan penurunan sensitivitas insulin. Penderita DM tipe II kebanyakan memiliki kadar gula darah setelah makan diatas 160 mg dl-1, melewati batas normal yaitu 140 mg dl-1 (IDF 2007). Pendekatan yang dilakukan untuk mengatasi peningkatan kadar gula darah setelah makan dengan cara memperlambat penyerapan karbohidrat setelah makan. Kerja antihiperglikemik dari inhibitor α-glukosidase berasal dari penghambatan enzim hidrolase α-amilase pankreatik dan enzim-enzim pencernaan. Enzim-enzim ini berperan dalam hidrolisis karbohidrat menjadi glukosa. Penghambatan terhadap enzim ini menyebabkan penghambatan penyerapan glukosa sehingga menurunkan keadaan hiperglikemia setelah makan (Adisakwattana dan Chanathong 2011).
Aktinomiset Penghasil Inhibitor α-glukosidase
4
diketahui memiliki aktivitas inhibitor α-glukosidase dengan senyawa aktif yang dihasilkan yaitu NFAT-133 (Almeida et al. 2011).
Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengetahui kemampuan aktinomiset dalam menghasilkan senyawa inhibitor α-glukosidase. Seperti pada inhibitor α-glukosidase yang dihasilkan oleh Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang diisolasi dari tanaman obat Tinospora crispa (Pujiyanto et al. 2012). Ekstrak etil asetat Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 memiliki aktivitas inhibitor α-glukosidase sebesar 96.08% pada konsentrasi 1000 μg mL-1 dan nilai IC50 sebesar 0.047 μg mL-1. Pengujian in vivo dengan menggunakan 30 ekor mencit, menunjukkan ekstrak ini memiliki kemampuan sebesar 26% dalam menurunkan kadar gula darah mencit (Lestari et al. 2015).
Ekstraksi Senyawa Inhibitor α-glukosidase
Ekstraksi merupakan proses pemisahan suatu senyawa tertentu dari campuran (padat, cair, terlarut, suspensi) yang dibagi dalam beberapa jumlah kecil. Pembagian ini didasarkan pada bobot dari tiap fraksi. Fraksi yang lebih berat akan berada paling dasar sedangkan fraksi yang lebih ringan akan berada diatas. Ekstraksi senyawa inhibitor α-glukosidase telah dilakukan seperti pada ekstraksi inhibitor α-glukosidase yang berasal dari Stichopus japonicus yang diekstrak menggunakan pelarut n-heksan (Nguyen dan Kim 2009).
Fraksinasi inhibitor α-glukosidase dari bunga Callistephus chinensis
dilakukan menggunakan pelarut n-heksan (Zhang et al. 2013). Ekstraksi senyawa inhibitor α-glukosidase yang dihasilkan dari daun Psidium guajava dapat dilakukan dengan metode kromatografi kolom silika gel untuk mengetahui senyawa aktifnya (Alagesan et al. 2012). Metode yang sama juga digunakan untuk fraksinasi inhibitor α-glukosidase yang dihasilkan dari kulit pohon raru dengan menggunakan ekstrak etanol (Pasaribu et al. 2011). Ekstrak etil asetat yang diperoleh dari Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 mengandung senyawa inhibitor α-glukosidase. Etil asetat dipilih sebagai pelarut karena menghasilkan rendemen dan nilai inhibisi terbesar. Ekstrak etil asetat juga memiliki nilai IC50 paling rendah dibandingkan dengan pelarut kloroform, metanol, etanol, dan butanol (Pujiyanto 2012).
Inhibitory Concentration50(IC50)
5 Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode untuk analisis suatu campuran dengan memisahkan senyawa yang terdapat dalam suatu campuran. Metode KLT dapat digunakan untuk membantu menentukan jumlah komponen dalam campuran, identitas senyawa dan kemurnian suatu senyawa. KLT merupakan metode yang sensitif, jumlah sampel dalam mikrogram dapat dianalisis menggunakan KLT dan waktu yang dibutuhkan cukup cepat sekitar 5-10 menit. KLT terdiri dari tiga tahapan, yaitu penotolan sampel, proses elusi dan visualisasi. Umumnya sampel yang akan diuji dilarutkan pada pelarut yang mudah menguap. Penotolan sampel menggunakan pipet mikro untuk memindahkan sejumlah kecil sampel ke bagian pelat KLT. Umumnya pelat KLT terbuat dari bubuk silika gel yang tersusun pada lembaran plastik. Proses elusi terdiri dari penempatan bagian pelat KLT pada sebuah bejana yang telah berisi larutan tertentu yang akan memisahkan senyawa melalui proses kapilaritas pada pelat KLT. Proses visualisasi mudah dilakukan pada senyawa yang menghasilkan warna pada pelat KLT. Untuk senyawa yang tidak menghasilkan warna, visualisasi dilakukan menggunakan sinar ultraviolet (UV) dan pereaksi spesifik (Markham 1988).
METODE
Alur Penelitian
Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan. Tahapan penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1 Diagram alir penelitian
Pemisahan Senyawa Inhibitor α-glukosidase dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis
Penentuan Nilai IC50 Ekstrak Etil Asetat Senyawa Inhibitor α-glukosidase
Peremajaan Isolat Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539
Produksi Senyawa Inhibitor α-glukosidase
Ekstraksi Senyawa Inhibitor α-glukosidase
6
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2015 hingga Mei 2016 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Kegiatan penelitian juga dilakukan di Pusat Studi Biofarmaka Tropika, Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat, Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah Isolat Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang diisolasi dari bagian akar tanaman Tinospora crispa, media Yeast Soluble Starch Agar (YSA), Yeast Soluble Starch (YS), International Streptomyces Project No.2 (ISP-2), enzim α-glukosidase (Sigma, USA), Bovin
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Incubator shaker
(Thermoshake GERHARDT Laboshake), sentrifus (HERMLE Labortechnik GmbH Z326K), penguap putar (Büchi Rotavapor R-205 dengan Vacuum Pump V-700), Thin Layer Cromatography Devices (Linomat 5 Camag dan Reprostar 3 Camag) dan spektrofotometer (Hitachi Spectrofotometre UV/Vis U2800).
Peremajaan Isolat dan Produksi Senyawa Inhibitor α-glukosidase
Isolat Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 ditumbuhkan pada media padat YSA. Isolat diinkubasi selama 10 hari pada suhu ruang. Isolat Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang telah diremajakan kemudian diinokulasikan ke dalam 400 mL media cair YS dan ISP-2. Kultur diinkubasi selama 15 hari dengan agitasi 120 rpm dalam incubator shaker pada suhu ruang. Kultur hasil produksi dipanen dengan cara disentrifugasi menggunakan sentrifus selama 30 menit pada suhu 4 ºC dengan kecepatan 1980 x g. Supernatan yang diperoleh digunakan untuk uji aktivitas senyawa inhibitor α-glukosidase dan tahapan ekstraksi senyawa inhibitor α-glukosidase (Pujiyanto 2012).
Ekstraksi Senyawa Inhibitor α-glukosidase
7 Uji Aktivitas Senyawa Inhibitor α-glukosidase
Ekstrak kering dilarutkan menggunakan Dimethyl Sulfoxide (DMSO) hingga konsentrasi 10000 µg mL-1 sebagai larutan stok sampel. Larutan stok enzim dilarutkan pada 100 mM bufer fosfat pH 7 yang berisi BSA. Larutan enzim yang digunakan memiliki konsentrasi 0.015 u mL-1. Larutan substrat terdiri dari 20 mM
p-NPG yang dilarutkan pada 100 mM bufer fosfat pH 7. Campuran reaksi mengandung 20 μL sampel, 100 μL 100 mM bufer fosfat pH 7 dan 100 μL 20 mM p-NPG. Setelah campuran reaksi diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37 ºC, sebanyak 100 μL enzim ditambahkan dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37 ºC. Reaksi dihentikan dengan penambahan 1600 μL 200 mM Na2CO3. Sistem reaksi dapat dilihat pada Tabel 1. Absorban diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm.
Hal yang sama juga dilakukan terhadap supernatan. Akarbosa digunakan sebagai larutan pembanding yang dilarutkan pada 100 mM bufer fosfat pH 7 hingga konsentrasi 1000 µg mL-1. Larutan pembanding diperlakukan sama dengan sampel. Aktivitas inhibisi α-glukosidase ditentukan dengan rumus:
% Inhibisi = [(C-S)/C] x 100%
dengan C adalah selisih absorban kontrol dengan blanko, dan S adalah selisih absorban sampel S1 dengan S0 (Moon et al. 2011).
Penentuan Nilai IC50 Ekstrak Etil Asetat Senyawa Inhibitor α-glukosidase
Penentuan nilai IC50 dilakukan dengan cara menguji aktivitas inhibisi α-glukosidase ekstrak pada berbagai konsentrasi. Sebagai pembanding digunakan larutan akarbosa. Persamaan garis dibuat sebagai fungsi dari konsentrasi ekstrak (x) dan besarnya aktivitas inhibisi (y). Selanjutnya dihitung besarnya konsentrasi yang dapat menghambat 50% aktivitas enzim α-glukosidase(Bachhawat et al.
2011).
Tabel 1 Sistem reaksi uji inhibitor α-glukosidase untuk satu sampel (μL)
8
Pemisahan Senyawa Inhibitor α-glukosidase dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Ekstrak kering dilarutkan menggunakan etil asetat hingga konsentrasi 10000 µg mL-1. Pelat KLT ukuran 10 x 1.5 cm diberi penanda 1 cm dari tepi bawah pelat sebagai garis awal penotolan dan 0.5 cm dari tepi atas pelat sebagai garis akhir penotolan. Pelat KLT dibersihkan dengan cara dielusi menggunakan metanol. Pelat KLT selanjutnya ditotolkan dengan 25 µL fraksi etil asetat konsentrasi 10000 µg mL-1 menggunakan Linomat 5 Camag pada kecepatan 70 nL s-1 dengan panjang titik penotolan 9 mm. Pelat selanjutnya dielusi menggunakan eluen n-heksan:etil asetat (1:4) yang sebelumnya telah dijenuhkan selama 1 jam (Pujiyanto 2012). Proses elusi dihentikan ketika fase gerak telah mencapai garis akhir penotolan. Pelat KLT dikeringkan dan divisualisasi menggunakan Reprostar 3 Camag yang terhubung dengan perangkat lunak WinCATS. Visualisasi dilakukan dengan lampu UV 254 nm dan 366 nm. Selanjutnya ditentukan nilai
Retardation Factor (Rf) menggunakan perangkat lunak WinCATS dengan menggunakan rumus:
Rf = jarak tempuh komponen / jarak tempuh eluen
Foto pelat KLT disimpan dalam format (.jpeg) untuk selanjutnya dianalisis menggunakan perangkat lunak ImageJ.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Karakteristik Isolat dan Produksi Senyawa Inhibitor α-glukosidase
Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang telah ditumbuhkan selama 10 hari pada media YSA menghasilkan miselium aerial berwarna putih seperti ditunjukkan pada Gambar 2A. Pengamatan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x memperlihatkan rantai spora isolat yang berbentuk spiral sederhana (simple spiral) seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2B.
9 Hasil produksi selama 15 hari pada media cair YS dan ISP-2 memperlihatkan kondisi media yang awalnya jernih (Gambar 3), menjadi semakin keruh seiring dengan waktu inkubasi seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4. Media cair YS menghasilkan biomassa sebesar 2.43 mg mL-1 dan pada media ISP-2 sebesar 2.14 mg mL-1.
Ekstrak Etil Asetat Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539
Isolat Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang ditumbuhkan pada media produksi YS, setelah dilakukan proses ekstraksi menggunakan etil asetat menghasilkan rendemen ekstrak etil asetat kering sebesar 1.28 mg mL-1. Isolat yang ditumbuhkan pada media produksi ISP-2 menghasilkan rendemen ekstrak etil asetat kering sebesar 0.33 mg mL-1.
Aktivitas Inhibitor α-glukosidase Supernatan dan Ekstrak Etil Asetat
Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539
Hasil pengujian inhibitor α-glukosidase menunjukkan supernatan dari media produksi YS dan ISP-2 memiliki kemampuan dalam menghambat aktivitas enzim α-glukosidase (Tabel 2). Kemampuan yang sama juga ditunjukkan oleh ekstrak etil asetat kering dan akarbosa yang digunakan sebagai pembanding (Tabel 3). Penambahan konsentrasi sampel yang diuji menyebabkan peningkatan dari inhibisi enzim α-glukosidase yang dihasilkan. Ekstrak etil asetat kering yang diperoleh dari media produksi YS pada konsentrasi 10 µ g ml-1 menghasilkan inhibisi sebesar 51.95%. Ekstrak etil asetat kering yang diperoleh dari media
Gambar 4 Tampilan fisik media produksi, (A) media YS (B) media ISP-2, setelah pertumbuhan Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 selama 15 hari pada suhu 26-28 ºC
10
produksi ISP-2 pada konsentrasi 10 µ g mL-1 menghasilkan inhibisi sebesar 50.36% dan akarbosa pada konsentrasi 10 µg mL-1 menghasilkan inhibisi sebesar 84.19%.
Nilai IC50 Ekstrak Etil Asetat Senyawa Inhibitor α-glukosidase
Nilai inhibisi ekstrak etil asetat kering yang diperoleh dari media produksi YS terhadap enzim α-glukosidase, diperoleh persamaan logaritmik y = 8.223 ln(x) + 34.80 dan nilai koefisien korelasi sebesar 0.975. Dari persamaan ini diperoleh nilai IC50 sebesar 6.35 μg mL-1 (Gambar 5A). Sementara itu, persamaan logaritmik yang didapat dari nilai inhibisi ekstrak etil asetat kering yang diperoleh dari media produksi ISP-2 yaitu y = 7.515 ln(x) + 31.71 dan nilai koefisien korelasi sebesar 0.903. Nilai IC50 yang diperoleh sebesar 11.40 μg mL-1 (Gambar 5B). Akarbosa yang digunakan sebagai pembanding, berdasarkan nilai inhibisi terhadap enzim α-glukosidase diperoleh persamaan logaritmik y = 16.59 ln(x) + 52.03 dan nilai koefisien korelasi sebesar 0.969. Nilai IC50 akarbosa sebesar 0.88 μg mL-1 (Gambar 5C).
11
Profil Senyawa Inhibitor α-glukosidase Ekstrak Etil Asetat Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539
Hasil pemisahan senyawa inhibitor α-glukosidase menggunakan metode KLT yang diperoleh dari isolat yang ditumbuhkan pada media produksi YS menunjukkan pita yang lebih terlihat pada panjang gelombang 366 nm dibandingkan pada panjang gelombang 254 nm seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6A. Pita yang terlihat pada panjang gelombang 366 nm berjumlah enam pita dengan nilai Retardation Factor (Rf) sebesar 0.98, 0.90, 0.81, 0.76, 0.61 dan 0.02. Hasil analisis menggunakan ImageJ dari pita KLT yang terlihat pada panjang gelombang 366 nm menunjukkan enam puncak yang paling dominan (Gambar 6B). Puncak satu sampai puncak ke lima yaitu, dengan nilai Rf sebesar 0.98, 0.90, 0.81, 0.76 dan 0.61 menunjukkan pendaran berwarna biru. Puncak ke enam yaitu pita dengan nilai Rf 0.02 menunjukkan pendaran berwarna merah.
Gambar 5 Persamaan logaritmik ekstrak etil asetat media YS (A), media ISP-2 (B), dan akarbosa (C) terhadap nilai inhibisi enzim α-glukosidase
Konsentrasi µg mL-1
Konsentrasi µg mL-1
Inhibisi
(
%
)
Inhibisi
(
%
12
Isolat yang diproduksi pada media ISP-2 menunjukkan hasil pemisahan senyawa inhibitor α-glukosidase yaitu pita yang lebih terlihat pada panjang gelombang 366 nm dibandingkan pada panjang gelombang 254 nm seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7A. Pada panjang gelombang 366 nm terlihat enam pita yang memiliki nilai Rf masing-masing sebesar 0.96, 0.76, 0.62, 0.52, 0.45 dan 0.03. Hasil analisis menggunakan ImageJ dari pita KLT yang terlihat pada panjang gelombang 366 nm menunjukkan enam puncak dominan seperti yang terlihat pada Gambar 7B. Ke enam puncak yaitu pita dengan nilai Rf berturut-turut sebesar 0.96, 0.76, 0.62, 0.52, 0.45 dan 0.03 menunjukkan pendaran berwarna biru.
A B
Gambar 7 Visualisasi KLT senyawa inhibitor α-glukosidase dari media produksi ISP-2 (A) cahaya tampak, panjang gelombang 254 nm,
13 Pembahasan
Karakter morfologi koloni Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 secara makroskopis pada media YSA sama seperti yang dilaporkan oleh Pujiyanto et al.
(2012) menghasilkan miselium aerial berwarna putih dan miselium substrat berwarna coklat tua. Secara mikroskopis Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 memiliki rantai spora isolat berbentuk spiral sederhana (simple spiral) yang menunjukkan karakteristik Streptomyces (Pujiyanto et al. 2012). Beberapa jenis
Streptomyces seperti S. hygroscopicus, S. melanosporofaciens, S. sporoclivatus,
S. violaceusniger, S. sparsogenes diketahui memiliki rantai spora berbentuk spiral (Goodfellow et al. 2007).
Hasil produksi selama 15 hari pada media cair YS dan ISP-2 menunjukkan kondisi media yang semakin keruh seiring dengan waktu inkubasi, dan perbedaan warna kultur cair (Gambar 4) yang kemungkinan terkait dengan dihasilkannya metabolit sekunder yang dapat bersifat species specific (Procopio et al. 2012). Media cair YS menghasilkan biomassa yang lebih besar dibandingkan media ISP-2. Komposisi media YS yang mengandung mineral berupa K2HPO4 kemungkinan dapat meningkatkan biomassa dan produksi metabolit bioaktif beberapa kelompok Streptomyces (Narayana et al. 2008). Medium D yang mengandung K2HPO4 memberikan pengaruh yang besar terhadap produksi metabolit bioaktif dari S. albolongus MU37 (Uddin et al. 2013). Media YS yang mengandung soluble starch diduga dapat meningkatkan produksi metabolit sekunder, seperti pada produksi neomisin dari S. fradiae NCIM 2418 yang meningkat pada media yang mengandung soluble starch (Vastrad dan Neelagund 2014).
Etil asetat dipilih sebagai pelarut dalam proses ekstraksi senyawa inhibitor α-glukosidase dari isolat Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 karena menghasilkan rendemen ekstrak terbesar dibandingkan dengan menggunakan etanol, kloroform, metanol, dan butanol (Pujiyanto 2012). Ekstrak etil asetat kering juga menghasilkan aktivitas inhibitor α-glukosidase tertinggi pada konsentrasi 1000 µg mL-1 sebesar 96.08% (Lestari et al. 2015).
Enzim α-glukosidase adalah enzim yang menghidrolisis substrat seperti
p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida menjadi produk seperti p-nitrofenol dan glukosa (Moon et al.2011). Inhibitor α-glukosidase berikatan pada substrat membentuk komplek enzim substrat dan menghasilkan p-nitrofenol dan glukosa. Aktivitas enzim diukur melalui absorban dari p-nitrofenol yang menghasilkan warna kuning. Perbedaan nilai absorban dari sampel yang diberi dan yang tidak diberi penambahan enzim dapat menunjukkan persentase aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase (Lestari et al. 2015).
Hasil pengujian menunjukkan supernatan dan ekstrak etil asetat kering yang diperoleh dari media produksi YS menghasilkan persentase inhibisi yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak etil asetat kering yang diperoleh dari media produksi ISP-2. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh kandungan soluble starch pada media YS yang dapat meningkatkan produksi metabolit sekunder. Untuk kebanyakan Streptomyces, starch digunakan sebagai sumber karbon khususnya untuk produksi metabolit sekunder (Bundale et al. 2015).
14
menghambat aktivitas enzim α-glukosidase. Tingginya aktivitas inhibitor α-glukosidase dari akarbosa diduga karena tingkat kemurnian akarbosa yang lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak etil asetat kering Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang dihasilkan dari media produksi YS dan ISP-2 (Lestari et al. 2015). Akarbosa merupakan oligosakarida kompleks yang bekerja sebagai inhibitor kompetitif dari enzim α-glukosidase dengan cara menunda penyerapan karbohidrat. Hal ini mengakibatkan peningkatan konsentrasi gula darah setelah makan yang rendah (MHRA 2010).
Nilai IC50 inhibitor α-glukosidase yang bervariasi dapat diakibatkan dari parameter yang dievaluasi, nilai inhibisi yang diperoleh selama pengujian, persamaan IC50 yang digunakan, konsentrasi ekstrak yang diuji, substrat yang digunakan, jenis ekstrak, dan jenis pelarut yang digunakan (Volpe et al. 2013). Seperti Neptunia oleracea yang diekstrak menggunakan metanol berpotensi dalam menghambat aktivitas α-glukosidase dengan nilai IC50 sebesar 19.09 μg mL-1 (Lee
et al. 2014). Ekstrak dari Aconitum heterophyllum, Cyperus rotundus, Symplocos racemosa dengan nilai IC50 166.5 μg mL-1, 3.98 μg mL-1, dan 8.16 μg mL-1 xanthorriza aksesi Wonogiri, Sukabumi, Ngawi, Karanganyar, Kursina masing-masing memiliki potensi dalam menghambat aktivitas α-glukosidase dengan nilai IC50 sebesar 333.27 μg mL-1, 347.10 μg mL-1, 908.35 μg mL-1, 892.17 μg mL-1, dan 438.04 μg mL-1 (Nucholis et al. 2015). Ekstrak etil asetat Streptomyces sp. VITMSS05 berpotensi sebagai inhibitor α-glukosidase dengan nilai IC50 sebesar 42.89 μg mL-1 (Revathy et al. 2013).
Kromatografi lapis tipis umumnya digunakan sebagai metode untuk mencari pelarut yang akan digunakan pada kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa kimia tertentu, misalnya flavonoid, dan isolasi flavonoid murni (Markham 1988). KLT juga dapat digunakan untuk menentukan jumlah komponen yang terdapat pada suatu senyawa, mengidentifikasi suatu senyawa, memantau proses suatu reaksi, dan melihat keefektifan dari suatu proses pemurnian(Hess 2007).
Hasil KLT senyawa yang dihasilkan dari media YS dan ISP-2 diduga memiliki enam komponen senyawa dilihat dari pita yang terbentuk pada pelat KLT setelah divisualisasi menggunakan panjang gelombang 366 nm. Walaupun kedua media memiliki enam pita, diduga kandungan senyawa aktif dari kedua media tersebut berbeda dilihat dari nilai Rf yang berbeda. Hal ini kemungkinan yang menyebabkan perbedaan aktivitas inhibitor α-glukosidase pada kedua media. Nilai Rf yang berbeda menyatakan perbedaan senyawa yang terdapat dalam bahan yang diuji(Markham 1988).
15 (fluorescence) yang dapat terlihat dalam warna kuning gelap, hijau berpendar, atau biru berpendar(Wagner dan Bladt 1996). Pendaran warna biru yang terlihat pada pelat KLT ketika diamati menggunakan panjang gelombang 366 nm mengindikasikan senyawa flavon, flavonon, flavonol, dan isoflavon. Sementara pendaran warna merah mengindikasikan senyawa antosianidin (Markham 1988). Flavonoid juga dapat terlihat menunjukkan warna biru terang dan biru gelap pada pelat KLT dengan menggunakan pelarut kloroform:etil asetat:asam asetat glasial (60:35:5) (Abraham et al. 2015). Ekstrak yang dilarutkan dengan pelarut etil asetat:etanol:air (5:1:5) diduga mengandung flavonoid dengan memperlihatkan warna biru gelap pada pelat KLT setelah divisualisasi dengan panjang gelombang 366 nm (Sathishkumar et al. 2008). Flavonoid menunjukkan warna biru berpendar pada pengamatan dengan panjang gelombang 366 nm setelah ekstrak dilarutkan pada pelarut etil asetat:asam asetat glasial:asam format:air (12.1:1.3:1.1:2.8) (Mishra et al. 2012).
Pengujian pada KLT didasarkan pada distribusi campuran diantara fase diam dan fase gerak. Pemilihan fase gerak yang sesuai ditandai dengan adanya spot-spot yang terpisah dengan baik pada pelat KLT. Komponen aktif yang dihasilkan isolat Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 dapat terpisah dengan baik menggunakan campuran pelarut n-heksan:etil asetat (1:4)(Pujiyanto 2012). Nilai Rf yang semakin tinggi berkaitan dengan kepolaran senyawa yang terkandung pada bahan yang diuji. Senyawa dengan nilai Rf yang lebih besar bersifat kurang polar karena berinteraksi kurang kuat dengan penjerap polar pada pelat KLT. Nilai Rf yang berbeda menyatakan perbedaan senyawa yang terdapat dalam bahan yang diuji (Kumar et al. 2013). Flavonon memiliki nilai Rf 0.38 menggunakan pelarut n-heksan:etil asetat:asam format (31:14:5) dan 0.75 menggunakan pelarut n-heksan:etil asetat:asam asetat (31:14:5). Flavon memiliki nilai Rf 0.66 menggunakan pelarut n-heksan:etil asetat:asam format (31:14:5) dan 0.91 menggunakan pelarut n-heksan:etil asetat:asam asetat (31:14:5) (Medic-saric et al. 2004).
Berdasarkan uji sebelumnya, diketahui ekstrak etil asetat Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 memiliki kandungan senyawa flavonoid (Pujiyanto 2012). Beberapa senyawa flavonoid yang telah diketahui memiliki kemampuan sebagai inhibitor α-glukosidase seperti flavonol (miresetin, kuersetin, fisetin), flavon (luteolin, apigenin, baisalein), flavonon (naringenin, hesperetin), antosianidin (Tadera et al. 2006). Berdasarkan analisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis, diketahui bahwa kandungan senyawa yang dihasilkan Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 dari fraksi F6 adalah flavonoid dan fraksi F3 adalah terpenoid (Pujiyanto 2012).
16
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Aktivitas senyawa inhibitor α-glukosidase dari ekstrak etil asetat
Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 pada media YS 51.95%, lebih tinggi dari media ISP-2 dengan nilai 50.36%. Pita yang terbentuk pada KLT mengindikasikan enam kandungan senyawa dari ekstrak etil asetat yang dihasilkan dari kedua media. Nilai IC50 media YS sebesar 6.35 μg mL-1 dan ISP-2 sebesar 11.40 μg mL-1.
Saran
17
DAFTAR PUSTAKA
Abraham G, Yadav RK, Kaushik GK. 2015. Identification of flavonoids from the aquatic pteridophyte Azolla microphylla using high performance thin layer chromatography. Ind J Marine Sci. 44:1125-1128.
Adisakwattana S, Chanathong B. 2011. α-glucosidase inhibitory activity and lipid-lowering mechanisms of Moringa oleifera leaf extract. Eur Rev Med Pharm Sci. 15:803-808.
Alagesan K, Thennarasu P, Kumar V, Sankarnarayanan S, Balsamy T. 2012. Identification of alpha glucosidase inhibitors from Psidium guajava
leaves and Syzygium cumini Linn. seeds. Int J Pharm Sci Res. 3:316-322. Almeida AK, Brahma MK, Padmanabhan P, Mishra PD, Parab RR, Gaikwad NV,
Thakkar CS, Tokdar P, Ranadive1 PV, Nair AS, Damre1 AA, Bahirat UA, Deshmukh NJ, Doshi LS, Dixit AV, George SD, Vishwakarma RA, Nemmani KV, Mahajan GB. 2011. Fermentation, isolation, structure, and antidiabetic activity of NFAT-133 produced by Streptomyces strain PM0324667. AMB Exp. 1:1-12.
Bachhawat A, Shihabudeen JMS, Thirumurugan K. 2011. Screening of fifteen indian ayurvedic plants for alpha-glucosidase inhibitory activity and enzyme kinetics. Int J Pharm Pharm Sci. 3:267-274.
Bansal N. 2015. Prediabetes diagnosis and treatment. World J Diabet. 6:296-303. Bish R, Bhattacharya S, Jaliwala YA. 2014. Evaluating the use of Desmodium
gangeticum as alpha glucosidase and DPP-IV inhibitor for type-II diabetes. Am J Phytomed Clin Ther. 2:530-539.
Bothon FTD, Debiton E, Yedomonhan H, Avlessi F, Teulade JC, Sohounhloue DCK. 2012. Alpha-glucosidase inhibition, antioxidant and cytotoxicity activities of semi-ethanolic extracts of Bridellia ferruginea benth. and
Ceiba pentandra L. Gaerth from Benin. Res J Chem Sci. 2:31-36.
Bundale S, Begde D, Nashikkar N, Kadam T, Upadhyay A. 2015. Optimatization of culture conditions for production of bioactive metabolites by
Streptomyces spp. isolated from soil. Adv Microbiol. 5:441-451.
Ferreira T, Rasband W. 2012. ImageJ user guide IJ 1.46r. National Institute of Health [internet]. [diunduh 12 Mei 2016]. Tersedia pada: imagej.nih.gov/ij/docs/guide.
Frantz S, Calvillo L, Tillmanns J, Elbing I, Dienesch C, Bischoff H, Ertl G, Bauersachs J. 2005. Repetitive postprandial hyperglycemia increases cardiac ischemia/reperfusion injury: prevention by the alpha-glucosidase inhibitor acarbose. J Fed Am Soc Exp Biol. 19:591-593.
Ghadyale V, Takalikar S, Haldavnekar V, Arvindekar A. 2012. Effective control of postprandial glucose level through inhibition of intestinal alpha glucosidase by Cymbopogon martini (Roxb). Evi Complement Alternat Med. 12:1-7.
Goodfellow M, Kumar Y, Labeda DP, Sembiring L. 2007. The Streptomyces violaceusniger clade: a home for streptomycetes with rugose ornamented spores. Anton Leeuwenh. 92:173-199.
18
Hyun CG, Jin HH, Myung JS, Joo WS, Soon OK. 2005. Molecular dection of α-glucosidase inhibitor-producing actinomycetes. J Microbiol. 43:313-318.
[IDF] International Diabetes Federation (FR). 2007. Guideline for management of postmeal glucose. Brussel (FR): International Diabetes Federation.
Kumar S, Jyotirmayee, Sarangi M. 2013. Thin layer chromatography: a tool of biotechnology for isolation of bioactive compounds from medical plants.
Int J Pharm Sci Rev Res. 18:126-132.
Lee SY, Mediani A, Ashikin NAH, Azliana ABS, Abas F. 2014. Antioxidant and α-glucosidase inhibitory activities of the leaf and stem of selected traditional medicinal plants. Int Food Res J. 21:165-172.
Lestari Y, Velina Y, Rahminiwati M. 2015. Metabolites activity of endophytic
Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 from Tinospora crispa L. Miers: α-glucosidase inhibitor and anti-hyperglycemic in mice. Int J Pharm Pharm Sci. 7:235-239.
Markham KR. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Bandung (ID): Penerbit ITB.
Medic-Saric M, Jasprica I, Smolcic-Bubalo A, Mornar A. 2004. Optimatization of chromatography conditions in thin layer chromatography of flavonoid and phenolic acids. Cr Chem Acta. 77:361-366.
[MHRA] Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency (GB). 2010.
Acarbose 50 mg and 100 mg Tablets PL 18909/0126-7. London (GB): 2011. Protein tyrosine phosphatase 1B and α-glucosidase inhibitory phlorotannins from edible brown algae, Ecklonia stolonifera and Eisenia bicyclis. Biosci Biotechnol Biochem. 75:1472-1480.
Narayana KJP, Vijayalakshmi M. 2008. Optimatization of antimicrobial metabolite production by Streptomyces albidoflavus. Res J Pharma. 2:4-7.
Nurcholis W, Ambarsari L, Permasku G, Darusman LK, Kurniatin PA. 2015. Analisis kandungan kurkuminoid dan penghambatan α-glukosidase dari ekstrak beberapa aksesi temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.). JIFI. 13:229-234.
Nguyen HT, Kim SM. 2009. Three compounds with potent alpha-glucosidase inhibitory activity purified from sea cucumber Stichopus japonicus. Di dalam: Abdi H, Valentin D, Nguyen DH, editor. Food Consumer Insights In Asia Current Issues & Future. Summer Program In Sensory Evaluation 2009; 2009 August 7-9; Ho Chi Minh City, Vietnam. Ho Chi Minh City (VD): Ho Chi Minh City Publishing House. hlm 112-122. Pasaribu G, Syafii W, Darusman K. 2011. Biological activities afforded by the
extract from raru bark to inhibit action of alpha-glucosidase enzymes. J Forest Res. 8:32-49.
19 Pujiyanto S. 2012. Kajian inhibitor α-glukosidase aktinomiset endofit asal brotowali (Tinospora crispa). [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Pujiyanto S, Lestari Y, Suwanto A, Budiarti S, Darusman LK. 2012. Alpha-Glucosidase inhibitor activity and characterization of endophytic actinomycetes isolated from some Indonesian diabetic medicinal plants.
Int J Pharm Pharm Sci.4:327-333.
Revathy T, Jayasri MA, Suthindhiran K. 2013. Anti-oxidant and enzyme-inhibitory potential of marine Streptomyces. Am J Biochem Biotechnol. 9:282-292.
Sama K, Murugesan K, Sivaraj R. 2012. In vitro alpha amylase and alpha glucosidase inhibition activity of crude ethanol extract of Cissus arnottiana. Asia J Plant Sci Res. 2:550-553.
Sathishkumar T, Baskar R, Shanmugam S, Rajasekaran P, Sadasivam S, Manikandan V. 2008. Optimization of flavonoids extraction from the leaves of Tabernaemontana heyneana Wall using L16 orthogonal design.
Nat Sci. 6:1545-1565.
Sebaugh JL. 2010. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharm Stat. 10:128-134.
Tadera K, Minami Y, Takamatsu K, Matsuoka T. 2006. Inhibition of α-glucosidase and α-amylase by flavonoids. J Nutr Sci Vitaminol.
52:149-153.
Uddin M, Mahmud N, Anwar N, Manchur MA. 2013. Bioactive metabolite production by Streptomyces albolongus in favourable environment.
J Microbiol Infect Dis. 3:75-82.
Van de Laar FA, Lucassen PL, Akkermans RP, van de Lisdonk EH , Rutten GE, van Weel C. 2005. Glucosidase inhibitors for patients with type 2 diabetes.
Diabet Care.28:166-175.
Vastrad BM, Neelagund SE. 2014. Optimization of medium composition for the production of neomycin by Streptomyces fradiae NCIM 2418 in solid state fermentation. Biotechnol Res Int. 14:1-11.
Velina Y. 2012. Deteksi dan klonig gen inhibitor alpha-glukosidase Streptomyces
sp. BWA 65 serta potensinya sebagai anti hiperglikemik pada mencit (Mus musculus) [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Volpe DA, Hamed SS, Zhang LK. 2013. Use of different parameters and equations for calculating of IC50 values in efflux assays: potential sources of variability in IC50 determination. Am Assoc Pharm Sci. 16:172-180. Wagner H, Bladt S. 1996. Plant drug analysis: a thin layer chromatography atlas.
Berlin (GE): Penerbit Springer.
Wang L, Hou Y, Peng J, Qi X, Zhang Q, Bai F, Bai G. 2012. Bioactivity-based hplc tandem q/tof for alpha-glucosidase inhibitors screening, identification, and quantification from actinomycetes. Lat Am J Pharm. 31:693-698. Wehmeier UF, Piepersberg W. 2004. Biotechnology and molecular biology of the
α-glucosidase inhibitor acarbose. Appl Microbiol Biotechnol. 63:613-625. Wei SJ, Cheng X, Huang L, Li KT. 2010. Medium optimization for acarbose
20
Wu C, Shen J, He P, Chen Y, Li L, Zhang L, Li Y, Fu Y, Dai R, Meng W, Deng Y. 2012. The α-glucosidase inhibiting isoflavones isolated from
Belamcanda chinensis leaf extract. Rec Natur Prod. 6:110-120.
21
22
Lampiran 3 Nilai absorbansi uji aktivitas inhibisi ekstrak etil asetat
Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang ditumbuhkan pada media YS terhadap enzim α-glukosidase
Konsentrasi
Media Komposisi Jumlah per liter media
(g)
Yeast Soluble Starch (YS) Yeast extract 2
23 Lampiran 4 Nilai absorbansi uji aktivitas inhibisi ekstrak etil asetat
Streptomyces sp. IPBCC.B.15.1539 yang ditumbuhkan pada media ISP-2 terhadap enzim α-glukosidase
Konsentrasi (μg mL-1)
Absorbansi Inhibisi
(%)
Blanko Kontrol S0 S1
0.1 0.0250 0.2700 0.0270 0.2365 14.49
0.5 0.0250 0.2700 0.0260 0.2170 22.04
1 0.0270 0.3725 0.0340 0.2465 38.49
5 0.0270 0.3725 0.0340 0.2410 40.09
24
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Medan pada tanggal 22 Februari 1989 sebagai anak pertama dari dua bersaudara dari ayah Darwin (alm) dan Ibu Saulina.
Pendidikan sarjana (S1) ditempuh di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara, lulus pada tahun 2012. Tahun 2013 penulis diterima di Program Studi Mikrobiologi (MIK) pada Program Pascasarjana IPB.
