TRANSFER GEN ANTIVIRUS PADA EMBRIO UDANG WINDU,
Penaeus monodon DALAM BERBAGAI KONSENTRASI
DEOXYRIBO NUCLEIC ACID
Andi Par enr engi, Andi T enr iulo, Syar if uddin T onnek , dan Sam uel Lant e
Balai Riset Perikanan Budidaya Air Payau
Jl. Makm ur Dg. Sit akka No. 129, Maros 90512, Sulawesi Selat an E- m ail: [email protected]
(Naskah diterima: 29 Juli 2011; Disetujui publikasi: 28 Oktober 2011)
ABST RAK
Tek nol og i t r ansg enesi s k hususnya r ek ayasa g enet i k unt uk m eng hasi l k an ud ang windu resist en penyakit m erupakan salah sat u st rat egi yang dapat dilakukan dalam upaya pem ecahan m asalah penyakit yang m enim pa budidaya udang windu. Teknologi t r ansg enesis k hususnya t r ansf er g en ant i vi r us p ad a ud ang wi nd u t el ah b er hasi l d i l ak u k an m el al u i t ek n i k t r an sf ek si . Mesk i p u n d em i k i an op t i m al i sasi k om p on en teknologi tersebut m asih perlu dilakukan. Konsentrasi DNA gen m erupakan salah satu k om p onen t ek nol og i t r ansg enesi s yang har us d i op t i m al k an unt uk m end ap at k an efisiensi dalam transfer gen. Penelitian bertujuan untuk m engetahui konsentrasi DNA gen ant ivir us yang opt im al sebagai bahan t r ansf er gen k e em br io m enggunak an m et ode t ransfeksi. Em brio udang windu yang diperoleh dari hasil pem ijahan induk asal Aceh, dikoleksi 5- 10 m enit setelah m em ijah dengan kepadatan 625 telur/ 2 m L. Transf eksi dilakukan dengan m enggunakan m edia larut an t ransf eksi jet PEI dengan konsentrasi DNA gen antivirus sebagai perlakuan, yakni: 5, 10, dan 15 µg serta kontrol positif (tanpa plasm id DNA) dan negatif (tanpa plasm id DNA dan larutan transfeksi), m asing- m asing 3 ulangan. Em brio hasil transfeksi ditetaskan pada stoples berisi air laut sebanyak 2 L yang dilet ak k an pada waterbath. Hasil penelit ian m enunj uk k an bahwa gen antivirus telah berhasil diintroduksi ke em brio udang windu. Hasil analisis ragam m enunjukkan bahwa perbedaan konsentrasi DNA (5- 15 µg) tidak berpengaruh nyata (P> 0,05) terhadap daya tetas em brio udang windu. Analisis ekspresi gen pada larva udang windu juga m enunjukkan adanya akt ivit as ekspresi gen ant ivirus pada sem ua perlakuan konsentrasi DNA, di m ana ekspresi gen antivirus pada larva transgenik lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol (tanpa transfeksi). Sintasan pasca- larva PL- 1 yang didapat kan pada penelit ian ini adalah 12,0%; 10,0%; 10,6%; 12,3%; dan 14,2% m asing- m asing untuk perlakuan konsentrasi plasm id DNA 5 µg, 10 µg, 15 µg, kontrol posit if dan negat if , di m ana konsent rasi DNA yang berbeda t idak m em perlihat kan pengaruh nyata (P> 0,05) terhadap sintasan larva PL- 1. Hasil penelitian ini berim plikasi bahwa unt uk alasan ef isiensi, k onsent rasi DNA 5 µg disarank an unt uk digunak an dalam transfer gen pada em brio udang windu.
KATA KUNCI: t ransf er gen, gen ant ivirus, udang w indu, k onsent rasi D NA
ABST RACT : T r ansf er of ant ivir al gene w it h dif f er ent D NA concent r at ions to tiger shrim p Penaeus monodon em bryo. By: Andi Parenrengi, Andi T enr iulo, Syar if uddin T onnek , and Sam uel Lant e
preliminarily successful on tiger shrimp. However, the optimization on the technology components is needed to be undertaken. The concentration of DNA is one of the important parameters that determines the efficiency of a transgenic proccess. The experiment was aimed to determine the optimal DNA concentration of antiviral gene as the material in gene transfer procedure to tiger shrimp embryo through transfection method. Tiger shrimp embryos produced from Aceh broodstocks were collected 5-10 mins after spawning with density of 625 eggs/2 mL. Gene transfer was conducted by using transfection reagent jetPEI with different DNA concentrations as the treatments which were 15 µg, 10 µg, 5 µg, positive control (without DNA plasmid) and negative control (without DNA plasmid and transfection reagent) with three replicates. Transfected embryos were hatched in plactic cans filled with 2 L of seawater and placed in a water bath container. The results of the experiment showed that the antiviral gene has been successfully transferred to the tiger shrimp embryos. Variance analysis showed that different concentrations of DNA plasmid did not significantly affect (P>0.05) the hatching rate of the embryos. Analysis of transient expression of larvae showed that the expression activity was observed among the treatments, where the transgenic larva showed higher expression compared with the control shrimp. Survival rates of post-larva PL-1 obtained in this experiment were 12.0%, 10.0%, 10.6%, 12.3%, and 14.2% for DNA concentration of 5 µg, 10 µg, 15 ug, positive and negative control, respectively. Different concentration of DNA did not significantly affect (P>0.05) the survival rate of post-larvae PL-1. Based on these results, it is recommended that 5 µg DNA is the optimal concentration of DNA to be used in gene transfer on tiger shrimp embryo.
KEYWORD S: gene transf er, antiviral gene, tiger shrim p, DNA concentration
PENDAHULUAN
Udang windu Penaeus monodon m eru-pakan salah sat u spesies lokal (indigenous species) krust ase Indonesia. Budidaya udang windu sudah berkem bang di t am bak- t am bak ai r p ayau d an t el ah m eng hasi l k an d evi sa negara yang cukup signifikan. Meskipun demi-kian, sejak t ahun 1990- an, budidaya udang windu mengalami berbagai kendala, baik akibat lingkungan perairan yang kurang mendukung m aupun adanya serangan penyakit bakt eri m aupun virus. Kasus ini tidak hanya terjadi di Indonesia (At m om arsono, 2004), t et api juga t erjadi di negara lain sepert i India (Sat hish et al., 2004; Rout et al., 2005), Korea (Kim et al., 2004), China (Zhan et al., 2004), dan Am erika (Galavis- Silva et al., 2004; Guevara & Meyer, 2006). Sedik it nya 20 j enis virus penyebab p enyak it p ad a b ud i d aya ud ang t elah d i-laporkan (Zhang et al., 2004). Virus bintik putih m er u p ak an j en i s vi r u s p en yeb ab u t am a berbagai kasus kem at ian udang windu at au dikenal sebagai penyakit white spot syndrome virus (WSSV) yang hingga kini belum dapat diat asi secara t unt as.
Berbagai upaya penanggulangan penyakit pada budidaya udang windu t elah dilakukan, t et ap i b el u m m em p er l i h at k an h asi l yan g opt im al. Sebuah m et ode baru yang dikenal
ud ang m el al ui vak si nasi t el ah d i l ap or k an d en g an p en g g u n aan r ek om b i n an p r ot ei n WSSV pada udang P. chinensis (Kim et al., 2004), ant ivirus m enggunakan unt ai ganda RNA (double-stranded RNA, dsRNA) pada udang L. vannamei (Robalino et al., 2004). Teknologi t r an sf er g en hemocyanin p eng k od e ant i -m ikroba pada udang windu baru di-m ulai oleh Zhang et al. (2004). Selanjut nya t ransf er gen ant ivir us m elalui int r oduk si gen penyandi TSV- CP (taura syndrome virus-coat protein) ke d al am em b r i o u d an g L. vannamei t el ah dilaporkan oleh Sun et al. (2005) dan Lu & Sun (2 0 0 5 ). Pen el i t i an t er seb u t m em b u k t i k an bahwa int roduksi gen pengont rol ant ivirus dapat m eningkat an resist ensi udang vanam e t erhadap serangan penyakit TSV.
Ber d asar k an ur aian t er seb ut , p enang-gulangan penyakit WSSV pada udang windu m em ungk ink an dilak uk an m elalui t ransf er gen pengkode ant ivirus. Prom ot er dan gen ant ivirus dapat diisolasi dari udang windu khususnya udang yang lolos (survivor) dari serangan penyakit WSSV (Luo et al., 2003; 2007). Keberhasilan t ransf eksi gen ant ivirus pada udang windu akan m em berikan m anfaat dalam upaya peningk at an sint asan udang windu yang dibudidayak an, yang ak hirnya produksi udang windu dapat meningkat. Hasil dari penelitian diharapkan dapat m em berikan dampak dalam peningkatan produksi perikanan ak uak ult ur Indonesia, k hususnya produk si udang windu di t am bak. Keberhasilan isolasi, karakterisasi, kloning promoter/ gen antivirus, dan pem buatan konstruksi gen (Parenrengi et al., 2009a: 2009b), serta transfer gen antivirus pada em brio udang windu (Parenrengi, 2010) merupakan langkah awal dalam upaya produksi udang windu t ahan penyakit . Opt im asi para-m et er ut apara-m a dalapara-m pengepara-m bangan t eknik t ransf er gen k hususnya m et ode t ransf ek si menggunakan larutan jetPEI sangatlah penting dilakukan unt uk m endapat kan t eknik yang efisien. Konsent rasi DNA plasm id m erupakan salah sat u param et er yang berperan dalam efisiensi transfer gen ke em brio udang windu. Oleh karena it u, penent uan konsent rasi DNA plasmid yang optimal untuk diaplikasikan pada t ransf er gen ant ivirus pada em brio udang windu merupakan upaya yang harus dilakukan dalam perakitan komponen teknologi transfer gen antivirus untuk menghasilkan udang tahan p en yak i t . Pen el i t i an i n i b er t u j u an u n t u k m endapat kan konsent rasi plasm id DNA yang efisien unt uk diaplikasikan pada t ransfer gen antivirus pada em brio udang windu.
BAHAN DAN METODE
Pematangan dan Pemijahan Induk
Induk udang windu yang berasal dari Aceh diadaptasikan di bak karantina untuk keperluan d et ek si b eb as p enyak it at au SPF (specific pathogen free) khususnya WSSV dan IHHNV. Induk SPF selanjut nya dipelihara dalam bak bet on berukuran 3 m3 sist em air m engalir d en g an k ep ad at an 1 0 ek or d en g an r asi o jant an:bet ina adalah 1:1. Pakan induk berupa cum i- cum i dan cacing laut diberikan 2 kali sehari yakni pagi dan sore hari sebanyak 15% dari bobot badan. Untuk mempercepat pema-t angan gonad dilakukan ablasi m apema-t a, yaipema-t u dengan m em ot ong t angkai bola m at a induk udang. Dalam wakt u 3–4 hari set elah ablasi, induk udang menunjukkan kematangan gonad. Udang yang t elah m at ang gonad (TKG- IV) dipindahkan ke bak pemijahan yang berbentuk kerucut dengan volum e 200 L yang didesain khusus dengan pem buat an lubang di kedua sisi bak dan dilengkapi dengan lam pu pijar 5 wat t unt uk m em udahkan pem ant auan wakt u pem ijahan t erjadi. Pem ijahan pada um um nya t erjadi pada m alam hari. Sekit ar 5- 10 m enit set elah pem ij ahan dilak uk an k olek si t elur unt uk keperluan t ransfeksi.
Transfer Gen Antivirus ke Embrio
telur yang sudah disiapkan dalam cawan petri. Sebagai k ont r ol per lak uan dilak uk an j uga t ransf eksi pada em brio t anpa m enggunakan p l asm i d DNA (k o n t r o l p o si t i f ) d an t an p a m en g g u n ak an p l asm i d DNA d an l ar u t an transfeksi (kontrol negatif). Campuran tersebut selanjut nya diink ubasi pada suhu ruangan selam a 50 m enit sebelum dipindahk an k e dalam st oples 2,5 L yang diisi dengan air laut st eril dan dilengk api dengan aerasi unt uk p r o s es p en et as an . Un t u k m en g u r an g i f luakt uasi suhu, st oples- st oples dilet akkan d alam wad ah/ b ak (waterbath) yang t el ah dilengkapi dengan pem anas (heater). Set elah penet asan sek it ar 24- 36 jam , naupli yang dihasilkan dihit ung unt uk m endapat kan daya t et as em brio dan pengam bilan sam pel naupli sebanyak 50 individu (pooled sample) unt uk keperluan analsis genom DNA dan cDNA untuk ekspresi gen ant ivirus. Naupli yang berhasil menetas selanjutnya dipelihara sampai dengan PL- 1 u n t u k m el i h at p en g ar u h p er l ak u an terhadap sintasan pasca- larva udang windu.
Analisis DNA Genom dan Ekspresi Gen Antivirus
DNA genom dan RNA yang dilanjut kan dengan sint esis cDNA (complementary-DNA) diek st rak si dari 50 naupli (pooled sample) unt uk uji konf irm asi m asuknya gen ant ivirus PmAV pada em brio dan larva udang windu. Ekst raksi DNA genom m enggunakan m et ode f enol- k lorof orm yang t elah dik em bangk an pada ikan kerapu (Parenrengi et al., 2000), sedangkan isolasi RNA dilanjut kan dengan sint esis cDNA m enggunakan kit Ready-To-Go You-Pime First Strand Beads (GE Healt hcare). Analisis ekspresi gen antivirus PmAV dilakukan dengan m enggunakan t eknik RT- PCR. Gen ant ivirus dan ekspresinya didet eksi dengan t eknik sem i kuant it at if PCR, di m ana sam pel t el ur t an p a t r an sf ek si d i g u n ak an seb ag ai k ont r ol d alam p enelit ian ini. Pr im er yang digunakan adalah ORFPmAV- F 5’ - t ag t gc at g cat atg ggt cat aca atc cta- 3’ dan ORFPmAV- R 5’ - ct g t ct cga gct at g t gt cct gct t t c aca-3’ ,dengan m enggunak an DNA genom dan cDNA sebagai templat PCR. Proses amplifikasi dijalankan pada m esin PCR GenAm p AB- 7200 (Applied Biosyst em ) dengan program pre-denaturasi 94oC selama 3 menit; 35 siklus untuk denat urasi 94oC selam a 30 det ik, annealing 58oC selam a 3 0 d et ik , d an ek st ensi 7 2oC selam a 45 det ik ; sert a f inal ek st ensi 72oC selam a 3 m enit . Ekspresi gen β- akt in udang
windu digunak an sebagai k ont r ol int er nal sep er t i yan g t el ah d i k em b an g k an o l eh Sriphaijit & Senapin (2007). Unt uk m elihat keberhasilan am plifikasi fragm en DNA target, hasil PCR dielekt rof oresis pada gel agarose 2% pada tegangan 50 Volt selama 1- 2 jam dan didok um ent asi dengan Gel Documentation System (Biom et ra). Unt uk m enent ukan berat m olekul f ragm en DNA digunakan m arker VC 100bp Plus DNA Ladder (Vivant is).
Analisis Data
Der aj at p en et asan em b r i o / t el u r d an sintasan pasca- larva PL- 1 dihitung berdasarkan jumlah telur yang menetas menjadi naupli dan larva PL- 1 dibandingkan dengan jum lah t elur yang diinkubasi. Untuk m engetahui pengaruh konsent rasi DNA plasm id t erhadap derajat penetasan dan sintasan PL- 1 dilakukan analisis ragam dengan menggunakan program Statistix Ver si 3 . 0 (NH Analytical Software) d an dilanjut kan dengan uji beda nyat a t erkecil pada t araf 5%. Uji konf irm asi m asuknya gen ant ivirus dilakukan dengan t eknik PCR dan ek sp r esi sem en t ar an ya d i an al i si s m el al u i t eknik RT- PCR dim ana dat a yang dihasilkan disajikan secara deskript if.
HASIL DAN BAHASAN
Daya Tetas Embrio dan Sintasan Pasca- Larva PL- 1
Tabel 1. Daya tetas embrio dan deteksi genom udang windu P. monodon hasil transfeksi konstruksi gen antivirus pada berbagai konsentrasi DNA
Table 1. Hatching rate of embryo and genome DNA detection of tiger shrimp P. monodon transfected by antiviral gene construct with different DNA concentrations
Ko nsent rasi p lasmid DNA DNA pla sm id con cen t r a t ion
D aya t et as Ha t ch in g r a t e
( %)
D et eksi g eno m D NA p ad a naup li Gen om e DNA d et ect ion of
la r va e*)
15 µg 21.7±5.03a +
10 µg 20.3±3.21a +
5 µg 22.3±3.51a +
Kontrol positif
Positive control 28.0±5.29
a
-Kontrol negatif
Negative control 29.0±6.93
a
-Ket erangan (Notes):
Angka pada kolom yang sam a dan diikut i oleh huruf yang sam a m enunjukkan t idak berbeda nyat a (P> 0,05), angk a dit ulis dalam rat aan ± SD; * ) = analisis dilak uk an t erhadap 50 naupli (pooled
sample), di m ana gen ant ivirus posit if (+ ) at au negat if (- ) t erdet eksi pada genom DNA
The values in same column followed by the same superscript are not statistically significantly different (P>0.05), number in average ± SD; *) = analysis performed by 50 larvae (pooled sample),
where the antiviral gene positively (+) and negatively (-) detected on the DNA genome
m em bahayak an bagi em brio udang windu dengan melihat indikator daya tetas perlakuan kontrol positif yang diberi larutan jetPEI tetapi t anpa plasm id DNA. Hasil penelit ian t ersebut
berimplikasi bahwa penggunaan larutan jetPEI sebagai m edia t ransf er gen ant ivirus t idak m em berikan ef ek berbahaya bagi perkem -bangan em br io udang windu. Pem buk t ian Gambar 1. Sint asan pasca- larva PL- 1 hasil t ransfeksi gen ant ivirus berbagai
konsentrasi DNA (Perlakuan 1 = 5 µg; 2 = 10 µg; 3 = 15 µg; 4 = kontrol positif; dan 5 = kontrol negatif, serta garis bar = SD)
Figure 1. Survival rate of post-larvae PL-1 transfected with antiviral gene at different DNA concentrations (Treatment 1 = 5 µg; 2 = 10 µg; 3 = µg; 4 = positive control, and 5 = negative control, bar line = SD)
Perlakuan (Treatment)
S
in
ta
s
a
n
p
a
s
c
a
-la
rv
a
P
L
-1
Survival rate of post-larvae PL-1
(%
)
1 1 9
5 1 7 1 5 1 3 1 1 9 7
tersebut dilakukan dari hasil pengamatan daya t et as em brio udang windu pada perlakuan transfeksi dengan menggunakan kontrol positif (t anpa konst ruksi gen) dan kont rol negat if (t anpa larut an t ranf eksi dan konst ruksi gen), di m ana der aj at penet asan em br io ant ar a p er lak uan t er seb ut t id ak m em p er lihat k an perbedaan yang nyat a (P> 0,05). Toksisit as larutan tersebut juga dilaporkan sangat rendah (Horbinski et al., 2001) dan mudah mengalami degredasi secara alam i (Ahn et al., 2002). Hal ini m enunjukkan bahwa dosis jet PEI dan DNA yang digunakan t idak m em pengaruhi daya t et as em br io udang windu. Hasil t er sebut m em berikan peluang besar dalam pengem -bangan t eknologi t ransgenesis pada udang d en g an m en g g u n ak an m et o d e l ar u t an transfeksi karena tidak membahayakan embrio udang windu. Pada penelit ian ini digunakan plasm id yang m engandung konst ruksi gen proAV-PmAV yang diisolasi dari udang windu (Parenrengi, 2010). Beberapa st udi m enun-jukkan bahwa plasm id konst ruksi gen t idak m em berikan pengaruh negat if pada sint asan em b r i o s et el ah t r an s f ek s i . I n t r o d u k s i k o n st r u k si g en (p r o m o t er d an g en β -galakt osidase) m elalui t eknik elekt roporasi kepada em brio ikan zebra t idak m em berikan dam pak negat if yang dit andai dengan daya tetas 72% dibandingkan dengan kontrol yakni 85% (Sheela et al., 1998). Di lain pihak, dengan jetPEI, vektor ekspresi pβactP2- TSV- CP dapat dit ransf er ke em brio udang vanam e dengan l aj u t r an sf er yan g t i n g g i , b ai k seb el u m terbentuknya lapisan jeli pada bagian luar telur (72%), maupun setelah jeli terbentuk (50%) (Sun et al., 2005). Daya t et as yang relat if rendah (1 7 ,6 %- 2 0 ,1 %) p ad a em b r io ud ang wind u dilaporkan oleh Yasawa et al. (2005) dengan menggunakan metode mikroinjeksi konstruksi gen pJEF-GFP.
Rend ahnya d aya t et as t er seb ut d ip er -kirakan karena inkubasi dilakukan pada wadah stoples (volume air 2 L dengan kepadatan telur yang relat if t inggi yakni 625 t elur/ st oples). Selain it u, daya t et as em brio yang rendah t ersebut diduga ak ibat k ualit as t elur yang digunak an relat if rendah. Hal t ersebut di-bukt ikan dengan rendahnya pula daya t et as embrio pada perlakuan kontrol negatif. Seperti halnya dengan penelit ian sebelum nya bahwa p en et as an em b r i o u d an g w i n d u h as i l t ransf eksi dan kont rol m encapai daya t et as 38,1%- 43,1% dengan kepadat an 370 t elur/ st oples (Parenrengi, 2010). Dari jum lah t elur d an d aya t et as yan g d i g u n ak an , m et o d e
t ransfeksi m em iliki pot ensi yang besar unt uk diaplikasikan dalam transfer gen pada udang. Yasawa et al. (2 0 0 5 ) m el ap o r k an b ah wa t r an sf er g en p ad a u d an g m en g g u n ak an m et od e particle gun bombardment d ap at dilakukan dalam jumlah telur yang relatif lebih banyak yakni 8.300- 13.480 telur dengan daya tetas sekitar 29,8%- 60,3%, sedangkan dengan metode mikroinjeksi hanya sekitar sekitar 204-5 8 0 t el u r d en g an d aya t et as yan g r el at i f rendah (17,6%- 20,1%).
mikroinjeksi (3- 5%) dan elektroporasi (25%- 35%). Dem ikian halnya dengan jum lah t elur yang bisa diberi perlakuan adalah mencapai 50.000 t elur unt uk m et ode t ransf ek si, sedangk an metode elektroporasi hanya mencapai 15.000 t elur dan m ikroinjeksi 50 t elur. Berdasarkan pert im bangan t ersebut , m et ode t ransf er gen yang dapat dikembangkan pada embrio udang windu adalah metode transfeksi menggunakan l ar u t an j et PEI. Ber d asar k an p en g am at an perkembangan sel pada embrio udang windu, f orm asi t erbent uknya dua sel m ulai t erlihat pada pengamatan 60 menit setelah pemijahan, p ad a su h u 2 7oC- 2 9oC. Ol eh k ar en a i t u , pelaksanaan t ransf eksi sebaiknya dilakukan sebelum t erbent uknya dua sel at au sebelum 60 m enit set elah pem ijahan. Hal yang relat if sam a disarankan juga pada udang vanam e, dim ana pem bent ukan dua sel pada em brio m ulai t er j ad i 5 5 m enit set elah p em ij ahan sehingga t ransfeksi gen sebaiknya dilakukan sebelum wakt u t ersebut at au lebih baik lagi jika dilakukan sebelum t erbent uknya lapisan jeli pada permukaan telur vaname yang terjadi 13 menit setelah pemijahan (Sun et al., 2005).
Deteksi DNA Genom dan Ekspresi Gen Antivirus
Uji konf irm asi keberadaan gen ant ivirus pada em brio udang windu dilakukan dengan m enggunakan DNA genom sebagai cet akan PCR. Hasil analisis PCR m enunjukkan bahwa
em brio udang windu yang dit ransf eksi t elah p o si t i f m em b aw a g en an t i v i r u s d al am t u b u h n y a d en g an i n d i k asi k eb er ad aan fragmen DNA pada posisi sekitar 520 bp, yang tidak didapatkan pada embrio udang yang tidak dit ransfeksi konst ruksi gen ant ivirus, kont rol posit if dan negat if (Tabel 1 dan Gam bar 2A). Keberhasilan m asuknya gen t arget ke em brio u d an g m el al u i m et o d e t r an sf ek si m en g -gunakan larut an jet PEI juga t elah dilaporkan oleh peneliti sebelumnya. Meskipun demikian, beberapa larut an t ransfeksi dapat digunakan sebagai m edia int roduksi vekt or ekspresi ke dalam em brio udang, m isalnya Effectene dan SuperFect dari Qiagen, sert a Lipofectamine 2 0 0 0 d ar i Gi b co BRL. Su n et al. (2 0 0 5 ) m el ap o r k an b ah w a m et o d e t r an s f ek s i m en g g u n ak an j et PEI p ad a u d an g van am e m en u n j u k k an l aj u ef i si en si t r an sf er g en m en cap ai 4 0 %- 6 0 %, sed an g k an d en g an metode mikroinjeksi dan elektroporasi masing-masing adalah 10%- 20% dan 10%- 15%.
Metode RT- PCR semi- kuantitatif dilakukan untuk mengetahui tingkat ekspresi sementara (transient gene expression) g en an t i vi r u s p ad a b er b ag ai k on sen t r asi p l asm i d DNA. Elekt roforesis hasil analisis RT- PCR t erhadap ek sp r esi sem en t ar a g en an t i vi r u s p ad a berbagai konsent rasi plasm id disajikan pada Gam bar 2B, dengan m enggunakan kont rol internal dari ekspresi gen β- aktin udang windu (Gambar 2C).
Gambar 2. Analisis genom DNA dan ekspresi gen ant ivirus larva udang windu pada berbagai konsent rasi DNA. A = larva udang windu posit if m em bawa gen ant ivirus; B = ekspresi gen ant ivirus; C = kont rol int ernal ekspresi gen
β- aktin udang windu, dimana konsentrasi DNA plasmid 5 µg (1); 10 µg (2); 15 µg (3); dan kontrol (K)
Figure 2. Analysis of DNA genome and gene antiviral expression on tiger shrimp larvae transfected with different DNA concentrations. A = tiger shrimp positively carrying antiviral gene; B = expression of antiviral gene; C = internal control of β-actin gene expression of tiger shrimp, where plasmid DNA concentration of 5 µg (1); 10 µg (2); 15 µg (3); and control (K)
K 1 2 3
A
B
Hasil analisis DNA genom pada naupli u d an g w i n d u m en u n j u k k an ad an ya g en ant ivirus yang posit if t erdapat pada sem ua perlakuan t ransfeksi baik pada konsent rasi 5 µg m apun pada konsent rasi 10 dan 15 µg (Tabel 1 dan Gam bar 2). Walaupun pengam -b i l an sam p el d i l ak u k an secar a g a-b u n g an individu (pooled sample) dari berapa ek or naupli, tetapi Gambar 2 telah memperlihatkan keberadaan f ragm en DNA pada posisi yang sam a d en g an g en an t i vi r u s (t ar g et ) d i -b an d i n g k an d en g an k on t r ol u d an g t an p a t ransf ek si. Mesk ipun pada perlakuan 5 µg m em perlihat kan ekspresi relat if lebih t inggi, t et api secara um um t idak berbeda signif ikan d engan p er lak uan lainnya. Hal ini d id uga disebabkan karena penggunaan konsent rasi yang berbeda t idak diiringi dengan pening-k at an pening-k onsent r asi lar ut an j et PEI dan NaCl (l ar u t an g ar am ), s eh i n g g a ef ek t i v i t as pengikat an DNA plasm id oleh larut an garam dan larutan transfeksi pada konsentrasi 10 µg dan 15 µg lebih rendah dibandingkan dengan k o n sen t r asi 5 µ g . Keb er h asi l an t er seb u t m em bukt ikan bahwa larut an t ransfeksi jet PEI dapat digunakan sebagai media introduksi gen asing ke embrio udang windu. Hasil yang sama juga dilaporkan oleh Parenrengi et al. (2010) bahwa penggunaan larut an t ransf eksi jet PEI t el ah d i g u n ak an u n t u k m em asu k k an g en berpendar EGFP (enhanced green fluorescent protein). Penggunaan larut an t ersebut t idak t erbat as pada udang windu, Sun et al. (2005) juga telah berhasil m elakukan transfer gen ke em brio udang vanam e, L. vannamei, bahkan dengan penggunaan konsent rasi DNA yang leb ih r end ah sek it ar 1 µg yang d icam p ur dengan 1,2 µL larut an jet PEI dalam 2 m L air l au t st er i l . Hasi l p en el i t i an t er seb u t j u g a m el ap o r k an b ah w a p en g g u n aan m et o d e t ransf ek si dapat dilak uk an dengan m eng-gunak an em b r io yang leb ih b anyak yak ni dapat m encapai 20.000- 50.000 em brio, di m ana jauh lebih t inggi dibandingkan m et ode elekt roporasi (10.000- 15.000 em brio) dan mikroinjeksi (20- 50 embrio). Sedangkan pada analisis ekspresi t ransgen (Gam bar 2) pada larva udang windu juga m enunjukkan adanya akt ivit as ekspresi gen yang dit andai dengan ad an ya f r ag m en DNA p ad a p o si si yan g dit arget kan. Hasil penelit ian t ersebut m em -p er lihat k an b ahwa d engan t r ansf ek si gen ant ivir us, ek spr esi gen r elat if lebih t inggi d i b an d i n g k an d en g an k o n t r o l (t an p a transfeksi). Berdasarkan uraian tersebut, untuk
t ujuan ef isiensi penggunaan 5 µg DNA plas-m i d seb ag ai b ah an u n t u k t r an sf er g en ant ivirus pada em brio udang windu sudah cuk up m em adai unt uk digunak an. Seper t i h al n ya d en g an r ek om en d asi p en g g u n aan larutan jetPEI dalam m anual yang dikeluarkan adalah sekit ar 6 µg unt uk t ransf er gen ke sel pada umumnya.
KESIMPULAN DAN SARAN
Tr an sf er g en an t i vi r u s m en g g u n ak an m et ode t ransf eksi dapat dilakukan sebagai m edia/ larut an t ransf er gen ke em brio udang windu. Penggunaan konsentrasi DNA plasm id DNA yan g m en g an d u n g k o n st r u k si g en ant ivirus dari 5- 15 µg t idak m em pengaruhi daya t et as em brio bahkan t idak berdam pak negatif pada sintasan pasca- larva PL- 1 udang windu. Hasil penelit ian t ersebut , berim plikasi bahwa unt uk alasan ef esiensi, k onsent rasi DNA 5 µg disarankan untuk digunakan dalam transfer gen pada embrio udang windu. Untuk m enget ahui secara kuant it at if ekspresi gen antivirus, maka disarankan untuk mengguna-kan anailsis m enggunamengguna-kan real-time PCR. DAFTAR ACUAN
Ahn, C.H., Chae, S.Y., Bae, Y.H., & Kim, S.W. 2002. Biodegradable poly(ethylenimine) for plas-m id DNA delivery [abstract]. J. Contr. Rel., 80: 273- 282.
Atmomarsono, M. 2004. Pengelolaan kesehatan udang windu, Penaeus monodon di tambak. Akua. Indonesiana, 5: 73- 78.
Beaum ont , A.R. & Hoare K. 2003. Biotechnol-ogy and genetics in fisheries and Aquacul-ture. Blackwell Science, 158 pp.
Destoumieux, D., Bulet, P., Loew, D., Dorsselaer, A.V., Rodriguez, J., & Bachere, E. 1997. Penaeidins, a new fam ily of ant im icrobial peptide isolated from the shrim p Penaeus vannmaei (Decap od a). J. Biol. Chem., 272(45): 28398- 28496.
Galaviz- Silva, L., Molina- Graza, Z.J., Alcocor-Gonzalez, J.M., Rosales- Encinas, J.L., & Ibarra- Gam ez, C. 2004. Whit e spot syn-drom e virus variant s det ect ed in Mex ico by a new m ult iplex PCR m et hod. Aquacul-ture, 242: 53- 68.
Horbinski, C., Stachowiak, M.K., Higgins, D., & Finnegan, S.G. 2001. Polyt hyleneim ine-m ed i at ed t r an sf ect i o n o f cu l t u r ed postm itotic neurons from rat sym pathetic g ang l i a and ad ul t hum an r et i na. BMC Neurosci, 2: 1471- 2202.
Khoo, H.W. 2000. Transgenesis and it s appli-cat ions in aquacult ure. Asian Fish Sci., 8: 1- 25.
Kim, D.K., Jang, I.K., Seo, H.C., Shin, S.O., Yang, S.Y., & Kim, J.W. 2004. Shrimp protected from WSSV disease by t reat m ent wit h egg yolk antibodies (IgY) against a truncated fusion protein derivated from WSSV. Aquaculture, 237: 21- 30.
Lu, Y. & Sun, P.S. 2005. Viral resistant in shrimp that ex press an antisense Taura syndrome virus coat prot ein gene. Antivir Res, 67: 141- 146.
Luo, T., Zhang, X., Shao, Z., & Xu, X. 2003. PmAV, a novel gene involved in virus resist ance of shrimp Penaeus monodon. FEBS Lett, 551: 53- 57.
Luo, T., Fang, L., Kaiyu, L., & Xu, X. 2007. Ge-nomic organization, promoter characteriza-t ion, and ex pression profiles of an ancharacteriza-t ivi-ral gene PmAV from t he shrim p Penaeus monodon. Mol Immunol, 44: 1516- 1523. Parenrengi, A., Shamsudin, L., Ismail, P., & Amin,
N.M. 2000. Preliminary study on DNA level marker of grouper at different buffer pres-ervat ion and DNA ex t ract ion m et hod. In Saad MS, Faridah QZ, Kadir MA., Khalid MZZ, Mohamad O, Saleh GB, Panandam JM (Edi-tors). Genetic Manipulation: Challenges and Advantages. Proceeding of the 4th National Congress on Genet ics, 26- 28 Sept .2000, Genting Highlands, Malaysia, p. 194- 208. Par en r en g i , A . , A l i m u d d i n , Su k en d a,
Sumantadinata, K., Yamin, M., & Tenriulo, A. 2009a. Cloning of ProAV promoter isolated from t iger prawn Penaeus monodon. Indo-nesian Aqua J., 4: 1- 7.
Par en r en g i , A . , A l i m u d d i n , Su k en d a, Sum ant adinat a, K., & Tenriulo, A. 2009b. Karakteristik Sekuens cDNA Pengkode Gen An t i vi r u s d ar i Ud an g Wi n d u , Penaeus monodon. J. Ris. Akuakultur, 4: 1- 13. Par en r en g i , A . , A l i m u d d i n , Su k en d a,
Sumantadinata, K., & Tenriulo, A. 2010. Uji
akt ivit as prom ot er ant ivirus pada udang windu penaeus monodon m enggunakan g en egfp seb ag ai p en an d a. Mak al ah d i p r esen t asi k an p ad a Fo r u m In o vasi Teknologi Akuakultur (FITA) di Lampung, 18 hlm.
Robalino, J., Browdy, C.L., Prior, S., Met z, A., Parnell, P., Gross, P., & Warr, G. 2004. Induc-t ion of anInduc-t ivir al im m uniInduc-t y b y d oub le-st randed RNA in a m arine invert ebrat a. J. Virol, 78: 10442- 10448.
Rout, N., Citarasu, T., Ravindran, R., & Murugan, V. 2005. Transcript ional and t ranslat ion ex pression profile of a whit e spot syn-drome viral (WSSV) gene in different organs of infected shrim p. Aquaculture, 245: 31-38.
Sathish, S., Selvakkumar, C., Hameed, A.S.S., & Narayanan, R.B. 2004. 18- kd prot ein as a m ar k er t o d et ect WSSV i n f ect i o n i n shrimps. Aquaculture, 238: 39- 50.
Sheela, S.G., Chen, J.D., Mathavan, S., & Pandian, T.J. 1998. Const ruct ion, elect roporat ic t ransfer and ex pression of ZpβypGH and ZpβrtGH in zebrafish. J Biosci, 23: 565- 576. Sriphaijit, T. & Senapin, S. 2007. High ex pres-sion of a novel leucine- rich repeat protein in hem ocyt e and lym phoid organ of t he black tiger shrim p Penaeus monodon. Fish & Shellfish Immunol, 22: 264- 271. Sun, P.S., Venzon, N.C., Calderon, F.R.O., & Esaki,
D.M. 2005. Evaluation of methods for DNA delivery int o shrim p zygot es of Penaeus (Litopenaeus) vannamei. Aquaculture, 243: 19- 26.
Yasaw a, R. , Wat an ab e, K. , Ko yam a, T. , Ruangapan, L., Tassanakajon, A., Hirono, I., & Aoki, T. 2005. Developm ent of gene transfer technology for black tiger shrimp, Penaeus monodon. J. Exp Zoo, 303: 1104-1109.
Zhan, W., Wang, X., Chen, J., Xing, J., & Fukuda, H. 2004. Elimination of shrimp endogenous alkaline phosphatase immunoassays for the det ect ion of whit e spot syndrom e virus (WSSV). Aquaculture, 239: 15- 21.
