Metaboromu kaiseki o mochiita bitaminC no kogan sayo ni okeru bunshi kiko no kaimei

Title Sub Title Author Publisher Publication year Jtitle Abstract. Notes Genre URL. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org). メ夕ボローム解析を用いたビタミンCの抗がん作用における分子機構の解明 上瀧, 萌 慶應義塾大学湘南藤沢学会 2014 生命と情報 No.21 (2014. ) ,p.12- 22 ビタミンCは, 生理濃度において抗酸化作用を有する補酵素として広く知られているが, その一方で 高濃度においては活性酸素種(ROS)を発生させる酸化促進作用を発揮することが明らかとされてい る。抗酸化能の低いがん細胞では, このビタミンCにより産生されるROSを消去しきれずに酸化ス トレスが生じ細胞死が誘導されることが報告されている。しかしながら, ビタミンCによる抗がん 効果における詳細な作用機序については未だ不明な点が多い。本研究ではメ夕ボロミクスの観点 からビタミンCによる抗がん作用の分子機構について検討を行った。まず始めに, 我々はMCF7細胞 (ヒト乳がん細胞)を用いてビタミンCによる殺細胞作用について調べた。その結果, 高濃度のビタミ ンC(1mM以上)を添加することによって細胞死が誘導された。また抗酸化物質であるN-acetylcystei ne(NAC)および還元型グル夕チオン(GSH)はそのビタミンCによる細胞死を顕著に抑制したことから , ビタミンCはROSの産生を介して細胞死を誘導することが確認できた。ROSは細胞の酸化還元状 態をはじめ様々な代謝プロファイルに大きく影響を与えることが予想される。そこで我々は, キャピラリー電気泳動飛行時間型質量分析装置(CE-TOFMS)を用いて, ビタミンCによる代謝変化に ついて網羅的に解析を行った。MCF7細胞をビタミンCで処理した結果, 解糖系上流およびTCA回路上流に位置する物質濃度の増加が見られ, ATPレベルの顕著な低下も認められた。また, これらのビタミンCによる代謝変化はNACを共処理す ることよって抑制することができた。さらにビタミンC処理によりNADの低下が明らかとなり, NA Dの低下に起因するエネルギー代謝全体の停滞が考察された。さらにMCF7細胞においてビタミン Cによる殺細胞効果がNAD濃度依存的に抑制された。すなわち, これらの結果から, MCF7細胞においてビタミンCはROSを産生し, NADを減少させることで, 解糖系を阻害しATP産生を抑制し殺細胞効果を誘導することが示唆された。 慶應義塾大学湘南藤沢キャンパス先端生命科学研究会 2014年度学生論文集 修士論文ダイジェスト Technical Report http://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/detail.php?koara_id=KO92001004-00000021 -0012.

2014年 度 修 士 論 文 ダ イ ジ ェ ス ト メ夕ボローム解析を用いたビタミンC の 杭がん作用における分子機構の解明 慶應義塾大学大学院政 策 •メ デ ィ ア 研 究 科 上瀧萌 要旨 ビタミンc は，生理濃度において抗酸化作用を有する補酵素として広く知られているが， その一 方で高濃度においては活性酸素種（ ROS) を発生させる酸化促進作用を発揮することが明らかとさ れている.抗酸化能の低いがん細胞では， このビタミンC により産生されるROSを消去しきれずに 酸化ストレスが生じ細胞死が誘導されることが報告されている.しかしながら， ビタミンCによる 抗がん効果における詳細な作用機序については未だ不明な点が多い.本研究ではメ夕ボロミクス の観点からビタミンCによる抗がん作用の分子機構について検討を行った.まず始めに，我々は MCF7細 胞 （ヒト乳がん細胞）を用いてビタミンCによる殺細胞作用について調べた.その結果，高 濃度のビタミンC ( 1 mM以上）を添加することによって細胞死が誘導された.また抗酸化物質であ るN-acetylcysteine(NAC) および還元型グル夕チオン（ GSH) はそのビタミンCによる細胞死を顕著に 抑制したことから， ビタミンCはROSの産生を介して細胞死を誘導することが確認できた.ROSは 細胞の酸化還元状態をはじめ様々な代謝プロファイルに大きく影響を与えることが予想される. そこで我々は，キャピラリー電気泳動飛行時間型質量分析装置（ CE-TOFMS) を用いて， ビタミンC による代謝変化について網羅的に解析を行った.MCF7細胞をビタミンCで処理した結果，解糖系 上流およびTCA回路上流に位置する物質濃度の増加が見られ，ATPレベルの顕著な低下も認められ た .ま た ， これらのビタミンCによる代謝変化はNACを共処理することよって抑制することができ た.さらにビタミンC処理によりNADの低下が明らかとなり，NADの低下に起因するエネルギー 代謝全体の停滞が考察された.さらにMCF7細胞においてビタミンCによる殺細胞効果が'NAD濃度 依存的に抑制された.すなわち， これらの結果から，MCF7細胞においてビタミンCはROSを産生 し，NADを減少させることで，解糖系を阻害しATP産生を抑制し殺細胞効果を誘導することが示 唆された.. Keywords :ビタミンC，がん，メ夕ボロミクス，酸化ストレス，エネルギー代謝. 12.

第1章序論 1.1高濃度ビタミンC点滴療法とは 近年， ビタミンC を大量に投与する“ 高濃度ビタミンC点滴療法”が，がん治療法の一つとして注目されて いる（ Hoffer以从， 2008; Ohno以fl/.， 2009) . この治療法は，米国では既に臨床試験が行われており， 日本国内 においても一部の医療機閨などで臨床的に用いられている（ 生田哲，2010) . 適応可能ながん種としては，乳 がん，前立腺がん，胃がん，腎臓がんなどが報告されており，婦 人 科 悪 性 腫 瘍 （ 卵巣がん，子宮がん，子宮 頸がんなど） や塍臓がん，再発悪性リンパ腫，非小細胞性肺がんなどでは化学療法と併用することで抗腫瘍 作用の増強効果が見られ， さらに進行固形がんにおいても有効であるという臨床試験結果が得られている (ClinicalTrials.gov).—般的な治療方法としては， ビタミンC を点滴して効果を発揮する血中ビタミンC濃度 (400mg/dL以上. 健 常 者 （ 約 1.2 m g/dL)の300倍以上に相当）へと上げていき，その後は血中のビタミンC濃度 をモニタリングしながらがん患者ごとに病状によって投与量や頻度を決定していく（ 生田哲,2010).. 1.2ビタミンC の酸化促進作用 ビタミンC は補酵素としての機能のほか抗酸化物質の一つとして知られ，スーパーオキシドラジカル（ 02—) ， ヒドロキシラジカル（ O H )，過酸化水素（ H 2 0 2 ) といった活性酸素種（ R O S )を除去することで，がん化 など細胞障害の原因となる酸化ストレスを防ぐ優れた性質を持っている（ A hm ad以ポ.，2005) . —方で，生体 内でビタミンC濃度を高めると意外にも酸化促進作用を持つことも知られている. 血液中のビタミンCが高濃 度で維持されると，モノデヒドロアスコルビン酸レダクターゼ（ NADH) の働きでモノデヒドロアスコルビン 酸ラジカル（ A A ') に酸化され，それに伴って放出された電子が金属タンパク質中のFe3+などを還元する.反 応に閨与する金属タンパク質は同定されていないが，10-30 kDaのタンパク質であると推定されている. （ Q.. 2005; LevineがaZ.， 2 0 1 1 ).続いて，還元されたFe2+ などが酸素へと電子を受け渡しスーパ一オキシ. Chen以. ドラジカル（ 0 2 •—）を生成する. この0 2 .—は，スーパーオキシドジスム夕ーゼ（ S O D )によりH2 0 2 に変換さ れる. この反応が血液中で起こった場合，H2 0 2 は力夕ラーゼやグル夕チオンペルオキシダーゼなどの抗酸化 酵素により安全な水と酸素に分解される. 細胞外の間質液でも同様にビタミンCからH 202が作られ，その一 部は細胞膜を透過して細胞内へ移動する（Antunes & Cadenas，2000) . がんの発生および増殖にH202 を含むROSが関与していることが示唆されてい る. がん細胞においてROSが及似およびc-Afjcな どの発がん性シグナルを介して代謝を亢進させ (Irani 以 aZ” 1997; Vafa d a/_，2002)，細胞増殖 (Behrend e? a/., 2003; Hu ef a/., 2005)，遺伝的不安 定 性 （Radisky e f が.，2005) および細胞老化の回避 (Z. Chen w. 2005) を引き起こすと報告されてい. る. 一方で過剰なR O Sがプロテインキナーゼ5 (PKC 5) の活性化を介し細胞老化を誘導することや. 阌 1. 高濃度ビタミンr の酸化促推作用のメカニズム. iC h e n e ta L . 2007改編、. (Takahashi e? a/.，2006) , ミトコンドリアからシトクロムc を放出することによりアポトーシスの誘導すると いった細胞へのダメージが示唆されている. さらにROSが解糖系を阻害することも示唆されている（Colussi 以. 2000) . したがって，ビタミンC により産生されるROSが，がん細胞の代謝にどのような影響を及ぼす. のか，大変興味深い. 正常細胞に入ったH 2 0 2 は血液中と同様に分解される一方，多くのがん細胞では抗酸. 13.

化酵素（ SODとカタラーゼ）の発現量が少ないことから（ Oberley & Buettner, 1979; Ahmad以a/.，2005)，高濃度 のビタミンCを投与するとROSを消去しきれずに酸化ストレスが生じると考えられている（ C h e n d a /.,2007). 高濃度ビタミンCの酸化促進作用のメカニズムを図1に示す.. 1.3ビタミンC による抗がん効果の先行研究 Chen氏とMichael Graham Espey氏らのf r った実験は以下の通りである. ヒト•ラット•マウスなど43種の がん細胞株および5種の正常細胞に対しビタミンCを処理したところ，正常細胞では20 mM以上でも毒性が見 られなかったが，がん細胞株の75% (33種）に対しては10 mM以下で顕著な毒性が確認された（ C h e n 以 a/., 2008) . 続いてマウスの腹腔内に子宮がん，滕臓がん，脳腫瘍の細胞をそれぞれ移植し，高濃度のビタミンC を腹腔内投与したところ， 12-30日後には対照群と比べ腫瘍が41-53%抑 制 されたと報告した（ C h e n 以 a/.， 2008).. 1.4研究意義 上記の項で述べたように，. v/か0およびm V/WにおいてもビタミンCの抗腫瘍効果は証明されてきている. (Takemura以敁 ，2010; Du d a ，” 2 0 1 2 ) .しかしながら，前述の通り，Chen氏らの提唱したビタミンCの酸化促 進作用によってROSが産生されることで細胞毒性が引き起こされるという説が現在有力ではあるが，上述の メカニズム以外にも， ビタミンCがトランスフヱリンレセプ夕一の発現量を抑制して鉄イオン不足を導き細 胞死を誘導する（ C a ro sio d a /.,2007) といった説もあり， この治療法の詳細な作用機序は解明されていない. また， この高濃度ビタミンC点滴療法の臨床的な効果は，現在までのところ大腸がんや肺がん，脖臓がん， 乳がんなど様々ながん種に対して利用され，その効果が報告されているが， ビタミンC に対する感受性は一 様ではなく，同じがん種由来の細胞株に対しても，その細胞毒性には株間で顕著な差があることも明らかと なっており（C hen以 a/.，2008)， ビタミンC による抗がん効果における詳細な作用機序については不明な点が 多い. また，高濃度のビタミンC より産出されるROSは様々な酸化還元反応に関与することから，がん細胞 の代謝機構に対して影響を及ぼすことが考えられるが， ビタミンCが解糖系を含む代謝に対する影響はよく 分かっておらず，その代謝変化による生物学的影響も不明である.本研究ではメタボロミクスの観点からビ 夕ミンCの杭がん作用における分子機構を解明することを目指す.. 第2章対象と手法 2.1対象 がん細胞におけるビタミンCの感受性比較を行った実験においては，Chen氏らのビタミンCの感受性に間 する実験結果に基づいて， ヒト扁平上皮がん細胞（ A431)， ヒト脖臓がん細胞（ Panc-1)， ヒト子宮頸がん細胞 (HeLa)， ヒト結腸がん細胞(HT29)およびヒト乳がん細胞(M CF7)を用いた.. 2.2手法 2.2.1細胞培養 細胞はDMEM (Sigma-Aldrich C o .)に1%の抗生物質（Nacalai Tesque)および10% のウシ胎児血清を添加した 培養液を使用し，37°Cおよび5%C02条件下で培養した. 継代はPBS. 14. (Phosphate-buffered saline) にて細胞を.

洗浄した後，0.25% トリプシン一0.02%EDTAを添加して細胞を剥離し，培地にて中和後，その細胞浮遊溶液 が適切な濃度になるように， さらに培地で希釈して培養した. 適宜培地交換を行った.. 2 . 2 . 2 細胞生存率の測定 がん細胞におけるビタミンCの感受性比較を行った実験（ 図2 ) においては，先行研究に基づいて( C h e n 以 a/.，2008)，A431，Panc-1，HeLa, HT29およびMCF7細胞の5種のがん細胞株を用いて， ビタミンC処理時の細 胞生存率を調べた. 各細胞株を5xl〇 4 cells/mLの濃度で1 5 0 叫/wellずつ96穴プレートに播種し，DMEM培地 にて24時間前培養を行った. 次に， ビタミンC添加1時間前に培地交換を行った.抗酸化剤を共処理した実験 (図3 ) においては，MCF7細胞を用いGSH (3および10 m M )およびNAC (N-acetylcysteine ; 3および10 m M )を， NADを共処理して生存率を調べた実験（ 図6 D )においては，MCF7およびHT29細胞を用いNAD (0 .5 ,1，3およ び10 m M ) をこの時点で培地中に処理した. その後ビタミンCを各wellに10%の濃度で添加した.生存率が 50% となるビタミンC濃 度 （ IC 5 0 ;5 0 % 阻害濃度）を調べる目的で，先行研究を參考に，処理するビタミンC 濃度を0 ,0 .3 ,1 ,3 および10 m M とした. また，ビタミンCが非常に分解しやすい物質であることから，ビ夕ミ ンC は添加する直前に用時調製した. ビタミンC を添カ卩し2時間後に培地交換を行い， ビタミンC不含培地で さらに46時間培養を行った. 実験は各条件毎にN=3で行った. 細胞生存率はMTTアツセイにより算出した. MTTアツセイでは， 100 (iL/wellの培養液に対し2 mg/mLのMTT (Sigma-Aldrich C o .)を5 0 叫を添加し3時間イ ンキュベートする. その後培地を吸引し， DMSO (Dimethyl sulfoxide)で細胞を溶解し， 570 nmの吸光度をマ イクロプレートリーダーにて測定した.. 2.2.3. メ夕ボローム実験手法. 2.2.3.1サンプルの調製 メ夕ボローム解析（ 図4 ) においては，6穴プレートにMCF7細胞を2 x 1〇5 cells/mLで1 wellに対して2 mLず つ播種し，DMEM培地にて24時間前培養を行った. 次に， ビタミンC添加1時間前に培地交換を行った.そ の後，ビタミンC または1 mMのH2 0 2 を1 wel侮 に 10%添加した. 処理するビタミンC濃度を0, 0.2, 1および10 mM とした. ビタミンC添加1 時間後に全サンプルを採取した. サンプル数は1条件につき，N =3とした. ま た，メタボローム解析で細胞内代謝物質濃度を細胞数で正規化する必要があるため，細胞数算出用に各条件 N=1でサンプルを作製した. 細胞数の測定にはトリパンブルー染色を用いた. サンプルを回収し，培地を吸 引後PBSで洗浄し0.25% トリプシン一0.02%EDTAを添加して細胞を剥離し，培地にて中和後，その細胞浮遊 溶液に0.2% トリパンブルー色素で染色し，血球計算盤にて各濃度条件時における染色されていない生細胞数 を調べた. 抗酸化剤を共処理したメ夕ボローム解析実験（ 図5 ) においては，MCF7細胞を用いビタミンC添加1時間前に 10 mMのビタミンC を処理するサンプルにのみ10 mM NACを抗酸化剤として培地中に添加した.その後ビ夕 ミンC を添加し1時間後に全サンプルを回収した.. 2.2.3.2サンプルの前処理 培養液除去後，5%マンニトール溶液（ Wako)を1 wellに対してlm L 添加し2度洗浄した. 25. の濃度補正'. 標 準 物 質 （IS ; L-methionine sulfone，2-morpholinoethanesulfonic acid (M E S)およびD-camphor-10-sulfonic acid (CSA))を含むメタノールを，1 wellに対し6 0 0 叫添加した. その後，4°Cにて10分間静置後， 400 pLのサンプ ル溶液に対し400 n L のクロ ロホルムと200 pLのMilli-Qを加え十分に攪拌し，9,000 xめ 4°Cにて15分間遠心 を行った後，水層360 1xLをMillipore製限外ろ過フイルター（ M illioore)に移し，再度9,000 xg，4°Cにて2時間. 15.

以上遠心分離を行った. その後， ろ液を遠心濃縮器にて40てで240分間遠心乾固させ，時間補正ISである100 |iM の3-Aminopyrrolidine ( A l d r i c h ) およびTrimesate ( W a k o ) を含む25 pL のMilli-Q水により可溶化し，CETOFMSによるメ夕ボローム測定を行った.. 2.2J . 3 キヤピラリー電気泳動一飛行時間型質量分析装置(CE-TOFMS) に上る測定および 解析 CE-TOFMSの測定条件は他論文で発表されている設定に準じた（ Soga以aし 2009) . 本研究ではCE-TOFMS により計測された力チオンおよびアニオン性物質全てのサンプルデ一夕を用いてメ夕ボローム解析を行っ た. CE-TOFMSにより得られた全デ一夕における解析にはMasterHands2を 用 い て 行 っ た （ Sugimoto. et. al.,. 2010) . ピーク面積を内部標準物質の面積値で補正し，各物質は回収した細胞数で正規化を行った.各物質 の精密質量や，標準物質の濃度を元に各代謝物の同定および濃度計算を行った.. 2 . 2 . 4 統計解析 GraphPad Prism v5.0 (Grap/iPafi? Software) を用いて一兀配置分散分析(ANOVA法）を行った.デ一夕は平均 値土標準偏差で示し，尸<0.05を統計的に有意とした. ヒートマップはM eV (SaeedefaZ .,2003) を用いて作成 した.. 第3章結果 3.1ビタミンCの 抗 が ん 効 果 5種の が ん 細胞株（ A431細胞，Panc-l細胞，HeLa細胞，HT29細胞およびMCF7細胞）におけるビタミンC濃 度と細胞生存率の関係を調べた（ 図2 A ) . また各細胞株におけるIC50を算出した. その結果，MCF7細胞が最 も高感受性を示し，HT29細胞が最も低感受性を示した（ 図2 B ) . 各がん細胞においてそれぞれビタミンC に対 する感受性に差があるものの， ビタミンCの抗がん効果が確認された（ 図2).. ----- * - ■ 為 ！ ！％.. 阌. 2. ビ夕ミン r 処理 4 8 時間後における 5 蒱のがん細胞株の牛存案. A) 縦軸は各条件におけるビタミンC無添加時の細胞数に対する生細胞の割合. （ ％)，横軸はビタミンC濃度. (mM) を示す.各がん細胞株におけるそれぞれのビタミンC濃度条件での細胞生存率を示した.エラーパーは 試行数3回の標準偏差を示す. B) ビタミンC処理時の各細胞株におけるIC50. 16.

3.2抗酸化剤処理によるビタミンC誘導性の細胞死の抑制 ビタミンC により誘導される細胞死が，先行研究で報告されている通りROSによるものか確認すべく， MCF7細胞に対し抗酸化物質をビタミンC と共添加することにより，毒性濃度域において見られた細胞死が 顕著に回避されるか調査した. その結果，抗酸化物質（ GSHおよびN A C )の共添加によりビタミンC誘導性の 細胞死が顕著に回避された（ 図3 ) . すなわちビタミンCがROSを発生させることで細胞死が引き起こされるこ とが明らかとなった.. -♦-Control ♦N A C 3 m M ♦ N A C 10mM -M-6SH3mM 1〇 mM. 陵i 3 堤なるビ々ミン r 濃麻条件において杭 8 1 化 物 暂. r N A r および G S B h を共添加し 4 8 時盟培善した M C F 7 細. 朐 の牛存率. 縦軸は各条件における全細胞数に対する生細胞の割合（ ％)，横軸はビタミンC濃 度 （ mM)を示す•エラーバー は試行数3回の標準偏差を示す.. 3.3ビタミンC添加によるがん細胞の代謝応答 ビタミンc を各濃度で添加した条件において， ビタミンc 無添加時に対して細胞内代謝がどのように変動 するか検討した. MCF7細胞において，0 , 0 . 2 , 1および10 mMのビタミンC を添加し，それぞれの細胞での1時 間後の細胞内代謝変動を調べた（ 図4 ) . その結果，MCF7細胞において10 mMのビタミンCを添加した条件時 では解糖系上流およびTCA回路上流に位置する物質濃度が増加し，一方それらの代謝経路上の下流に位置す る物質濃度は減少していた（ 図4 A ) . またATPやGTPの顕著な低下と共に，ADP，GDP, AMPおよびGMPの増 加が確認された. さらにはATP, ADPおよびAMPから算出されるエネルギーチャージの値についても低下が 見られた（ 図4B).. 17.

A) 咖ppn版 ^^輪識^. t .i l f ^ i l l l. へ. m. こ. ! し 、 靡 w. ， ‘. ^ ^. 5. 。 パ. il I l i l. h i. l i , 1 ;i i. >•••• -^m. 4. ?. 1、』. Ik J. v-..s.....v..vJfc».v^. > '.■'■«■私^ m. 1 - l i l i l h r l ；l l i l. 1. A ....... 阌 4. MCF7細胸におけるビタミンf ： 処理時の代謝変動. A) MCF7細胞に対し10 mMビタミンCを1 h処理した時の代謝変動マップおよび各ビタミンC濃度条件時にお けるマップに記載した解糖系，TCA回路およびペントースリン酸経路上の代謝物質の変動グラフ.マッピン グはビタミンC無添加条件における定量値に対する各濃度条件時における定量値の比率を算出し左上の力 ラ ー コ ー ド に 従 い 色 付 け し た .B) MCF7細胞に対し各ビタミンC濃度を1 h処理した時のATP, ADP, AMP, GTP, GDPおよびGMPの相対値とエネルギーチャージを示した.エネルギーチャージは以下の式より算出し た.エネルギーチャージ： （ATP + 0.5 x ADP) / (ATP + ADP + AMP) . エラーバーは試行数3回の標準偏差を示 す.. 3.6ビタミンC に よ る 代 謝 変 化 に 対 す る 抗 酸 化 剤 の 効 果 MCF7細胞においてビタミンC特異的な代謝が見られたことから，次にビタミンC による代謝変化に対する 抗酸化剤の効果について調べた（ 図5). MCF7細胞において10 mMのビタミンC を処理した結果， コントロー ルに対して解糖系の上流，TCAの一部，ペントースリン酸経路の亢進が見られる一方， これに抗酸化剤を共 処理した場合では， その変動が抑制された. またビタミンC により濃度の減少が見られた物質についても， 同様に抗酸化剤共処理条件時には増加が見られた（ 図5 A ) . また抗酸化剤はビタミンCによるATPおよびエネ ルギーチャージの変化においても抑制した（ 図5 B ) . さらにMCF7細胞においてH 202を単独で処理した結果， 高濃度のビタミンC単独処理時と比べプロファイルの変動が類似していた（ 図5A).. 18.

B). 1： Jii. Irilii !i. j j 灘. 繼 言： ?:.;：. J M ■!. x. iii. # ：. i i i . I n lii L J j. !：;. 鑛^%. 阌 S MCF7細胞におけるビタミンC f e よびNAC： 共添加 時の代謝変動 A ) 解糖系，T C A 回路およびペントースリン酸経路 T復. c p te. ._p.. ( P P P ) におけるビタミンC無添加時の代謝物濃度の定量 値に対する各条件での代謝物濃度の定量値の比率によ る ヒ ー ト マ ッ プ B) MCF7細胞に対し各条件でのATP， ADR AMP. GTP. GDPおよびGMPの相対値とエネル. 3.7ビタミンC による細胞内N A D レベルの減少 メ夕ボローム解析の結果よりビタミンCがATPを減少させていたことから，そのメカニズムとして我々は 解糖系に着目した. ビタミンCの代謝プロファイルでは，解糖系の上流が亢進している一方，解糖系下流の 代謝物質が抑制された（ 図6 A ) . また，先行研究においてROSがNADの枯渴を介してGAPDHの酵素活性を不 活性化させることが報告されている（ Colussi以《/•，2000). MCF7細胞をビタミンCで処理したところ，ビ夕ミ ンC はNADレベルを減少させた（ 図6B ) . さらにNACはビタミンC によるNADレベルの減少を回復させた（ 図 6 C ) . またMCF7およびHT29細胞においてビタミンC とNADを共処理し生存率を調べた結果，生存率が回復 した（ 図6 D ) . 上記の結果より，ビタミンCのROSの産生はNADの枯渴させることで解糖系を阻害し，殺細胞 効果を示すことが示唆された.. 阌 6 がん細胞におけるビ夕ミンCのNADに対する影響 A ) 図9A より解糖系上の代謝変動箇所を抜粋. B ) ビタミンC濃度依存的なNADレベルの変動. C) MCF 7 細胞 におけるビタミンC とNACの共処理によるNADレベルの変動. D) MCF7細胞およびHT29細胞におけるビタ ミンC とNACの共処理による細胞生存率.. エラーバーは試行数3回の標準偏差を示す.. 19.

第4章議論 5種の細胞株におけるビタミンC に対する感受性の比較を行った. 先行研究と同様に，細胞株によってビ 夕ミンC に対する感受性に顕著な差があることが本実験から明らかとなったものの， ビタミンCの抗がん効 果が確認された（ 図2) . —般にビタミンCは抗酸化能を有していることで知られているが，低濃度のビタミン C投与時においてはビタミンCの抗酸化作用が働いている一方で，高濃度になるにつれて酸化促進作用が作用 し細胞毒性が生じているのではないかと考えられる. 細胞株ごとに感受性が異なる原因としては，発生する ROS量，ROSの除去能およびビタミンCの取り込み能の違いなどが考えられるため，今後ビタミンC処理した 細胞内におけるROSの定量およびビタミンCのトランスポーターの発現量を明らかにする必要がある.さら に，培養細胞レベルだけでなく， よりビタミンCの生体内動態を反映した三次元培養や動物実験といった手 法により検討していく必要があると思われる. 続いてMCF7細胞に対し抗酸化物質をビタミンC と共添加することにより，毒性濃度域において見られた 細胞死が回避されるか調査した. その結果，抗酸化物質の共添加により細胞死が顕著に軽減し， ビタミンC による細胞毒性が低下したことから，ROSの発生によってビタミンCの毒性が発揮されていることが強く示 唆された. （ 図3 ) . 今後， ビタミンC投与により発生するROSが先行研究の通りにH202であるのかについて. も，H2 0 2 を特異的に検出する蛍光試薬を用いた実験により検証していく必要がある. 次に， ビタミンC により細胞内代謝がどのように変動するか調べるため，MCF7細胞に対し0.2，1 および 10 mMのビタミンC を添加した1時間後のメタボロームプロファイルを比較した.主なエネルギー代謝経路に 属する物質の濃度変化を， コントロール条件（ ビタミンC無添加条件の代謝物濃度）に対する10 mMビタミン C添加時の代謝物濃度比に基づいて色付けを行った（ 図4 ) . その結果，MCF7細胞において10 mMのビタミンC を添加した条件では，解糖系上流およびTCA回路上流に位置する物質濃度が増加した（ 図4 A ) . また，ATPお よびGTPの顕著な低下と共に，ADP，GDP，AMPおよびGMPの増加が確認されたことから，高濃度のビ夕 ミンC添加！ によりエネルギー生成の低下が示唆された（ 図4 B ) . ゆえに高濃度のビタミンCは，がん細胞のエ ネルギー代謝全般に負の影響を及ぼし細胞死を誘導することが推察された（ 図4). MCF7細胞においてビタミンC により特異的代謝変動が讓導されたことより， このビタミンC特異的代謝変 動に対する抗酸化剤の効果を調べた. その結果，高濃度のビタミンC処理によって解糖系およびTCA回路上 の代謝物質の増減が見られていたが，抗酸化剤の共処理によってその変動が抑制されたことから， ビタミン C により産生されたROSが解糖系およびTCA回路を阻害していることが示唆された（ 図5A) . さらに高濃度の ビタミンC により減少していたATPおよびエネルギーチャージのレベルについても抗酸化剤処理により抑制 されたことから（ 図5B)，高濃度のビタミンCによるROSがエネルギー産生に支障をきたしていることが推察 された. したがって，MCF7細胞においてビタミンC により発生したROSがエネルギー代謝を停滞させ，エネ ルギ一産生に障害を及ぼすことが示された. 解糖系に着目した結果， ビタミンCの代謝プロファイルでは，解糖系の上流が亢進している一方，解糖系 のGAP以降の代謝物質が抑制された（ 図6A ) . また，先行研究においてROSがDNAにダメージを与えることで PARP (Poly (ADP-ribosyl) polymerase)が活性化され，その基質であるNADの枯渴を介してGAPDHの酵素活性 を不活性化させることが報告されていたため（Colussi d a/.，2000)，MCF7細胞においてビタミンCで処理した 時のNAD レベルを調べたところ， ビタミンC によってNADが減少することが確認された.さらに抗酸化剤共 処理によって生存率が回復することから， ビタミンC によりROSが産生されることでNAD レベルが減少する ことが 明 ら かとなった（ 図6BおよびC ) . この結果を受けて，MCF7細胞およびHT29細胞においてビタミンC. 20.

とNADを共処理し生存率を調べた結果，生存率が回復したことから，NADの減少がビタミンC由来の細胞死 を引き起こす引き金となりうることが考えられる（ 図6D). ゆえに，高濃度のビタミンC はROSを産生することでNADを減少させ，それに伴い解糖系の上流物質の濃 度が増加させることでエネルギー代謝が停滞させ，ATP産生にも支障をきたすことが示唆された. IPIM ：. 阌 7. がん細朐 におけるビ夕ミンCの杭がん作用機構. 第5章結論 本研究において，A431，Panc-l，HeLa，HT29およびMCF7細胞を用いてビタミンC を処理した結果，先行 研究と同様にビタミンCの抗がん効果が確認された. さらに]VICF7細胞において抗酸化物質をビタミンC と共 添加することによりビタミンC誘導性の細胞死が顕著に回避され， ビタミンC による毒性が緩和されたこと から， ビタミンC誘導性の細胞死が主にROSの発生を介することが示唆された. よりビタミンCの抗がん作用 機序に迫るべく， ビタミンC に対し高感受性を示したMCF7細胞におけるビタミンC処理時の細胞内代謝変動 をCE-TOFMSを用いて調べた結果，解糖系およびTCA回路の上流に位置する物質が充進したことから，エネ ルギ一代謝の停滞が示され，エネルギー生成の低下も明らかとなった. また高濃度のビタミンC処理による NADレベルの顕著な低下が見られ， このNADの低下は抗酸化剤であるNACの共処理により抑制された.さ らにはNADをビタミンC と共処理することでビタミンC誘導性の細胞死が回避されることも明らかとなっ た. すなわち，高濃度のビタミンC により産生されたROSが引き起こすNADレベルの減少に伴いエネルギー 代謝の停滞が生じ，ATP産生が阻害され細胞死が誘導されることが示唆された.. 謝辞 修士論文の執筆において，お世話になった多くの方々に心からお礼申し上げます.本研究を行うにあた り， アドバイザーである田畑祥博士には感謝してもしきれないほどお世話になりました.アドバイザーを快 く引き受けて下さり，締め切り間近には御迷惑をたくさんお掛けしたにもかかわらず： 多くの時間を割いて 丁寧なご指導ならびに多くの貴重なご助言を頂きました.また研究者への道を選ぶにあたっても親身になっ て相談に乗っていただきました. 心より深く感謝を申し上げたいと思います. CE-TOFMSの開発者である曽 我朋義教授には，私の研究に有益な情報などがあると丁寧に詳細を教えて下さるなど，親身になって本研究 に対するディスカッションをして下さいました. 深く感謝致します. 最後になりますが，冨田勝教授にはこ のテーマについて相談した際に多くのアイデアを頂きました. またオックスフォード大学への2 力月間のイ ンターンシップを勧めてくださったおかげで， これまで経験したことのない素晴らしい機会に恵まれまし た. 5年半もの間，研究を行うにあたり素晴らしい環境を与えて下さり，冨田研究会でしか体験できないで あろう経験を数えきれないほどさせて頂き，魅力的な方々に出会うこともでき，本当に恵まれた研究生活を 送ることができました. ご指導， ご鞭撻を賜りました冨田勝さんに厚く御礼申し上げます.ありがとうござ いました.. 21.

参考文献 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •. •. Ahmad, I. M., Aykin-Burns, N., Sim, J. E., Walsh, S. A., Higashikubo, R., Buettner, G. R., et al. (2005) Mitochondrial 02*- and H202 mediate glucose deprivation-induced stress in human cancer cells. JBiol Chem, 280, 4254-4263. Antunes, F. & Cadenas, E. (2000) Estimation of H202 gradients across biomembranes. FEBS Lett, 475, 121-126. Behrend, L., Henderson, G. & Zwacka, R. M. (2003) Reactive oxygen species in oncogenic transformation. Biochem Soc Trans, 31,1441-1444. Carosio, R., Zuccari, G., Orienti, 1., Mangraviti, S. & Montaldo, P. G. (2007) Sodium ascorbate induces apoptosis in neuroblastoma cell lines by interfering with iron uptake. Mo/ Cawm; 6, 55. Chen, Q., Espey, M. G., Krishna, M. C., Mitchell, J. B., Corpe, C. P., Buettner, G. R., et al. (2005) Pharmacologic ascorbic acid concentrations selectively kill cancer cells: action as a pro-drug to deliver hydrogen peroxide to tissues. Proc Natl Acad Sci USA, 102, 13604-13609. Chen, Q., Espey, M. G., Sun, A. Y., Lee, J. H., Krishna, M. C., Shacter, E., et al. (2007) Ascorbate in pharmacologic concentrations selectively generates ascorbate radical and hydrogen peroxide in extracellular fluid in vivo. Proc Natl Acad Sci USA, 104, 8749-8754. Chen, Q., Espey, M. G., Sun, A. Y., Pooput, C., Kirk, K. L., Krishna, M. C., et al (2008) Pharmacologic doses of ascorbate act as a prooxidant and decrease growth of aggressive tumor xenografts in mice. Proc Natl Acad Sci USA, 105, 11105-11109. Chen, Z., Trotman, L. C., Shaffer, D., Lin, H. K., Dotan, Z. A., Niki, M., et al. (2005) Crucial role of p53dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis. Nature, 436, 725-730. ClmicalTrials.gov. CumcalTrials.gov. Colussi，C.， Albertini, M. C” Coppola, S., Rovidati，S” Galli, F. & Ghibelli, L. (2000) H202-induced block of glycolysis as an active ADP-ribosylation reaction protecting cells from apoptosis. FASEBJ,14,2266-2276. Du, J., Cullen, J. J. & Buettner, G. R. (2012) Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer. Biochim Biophys Acta, 1826, 443-457. Hoffer, L. J., Levine, M., Assouline, S., Melnychuk, D., Padayatty, S. J., Rosadiuk, K., et al. (2008) Phase I clinical trial of i.v. ascorbic acid in advanced malignancy. Ann Oncol,19,1969-1974. Hu, Y., Rosen, D. G., Zhou, Y., Feng, L., Yang, G., Liu, J., et al. (2005) Mitochondrial manganese-superoxide dismutase expression in ovarian cancer: role in cell proliferation and response to oxidative stress. J Biol Chem, 280, 39485-39492. Irani, K., Xia, Y., Zweier, J. L., Sollott, S. J., Der, C. J., Fearon, E. R., et al. (1997) Mitogenic signaling mediated by oxidants in Ras-transformed fibroblasts. Science, 275, 1649-1652. Levine, M., Padayatty, S. J. & Espey, M. G. (2011) Vitamin C: a concentration-function approach yields pharmacology and therapeutic discoveries. Adv Nutr, 2, 78-88. Oberley, L. W. & Buettner, G. R .(1979) Role of superoxide dismutase in cancer: a review. Cancer Res, 39, 1141-1149. Ohno, S., Ohno, Y., Suzuki, N., Soma, G. & Inoue, M. (2009) High-dose vitamin C (ascorbic acid) therapy in the treatment of patients with advanced cancer. Anticancer Res, 29, 809-815. Radisky, D. C., Levy, D. D., Littlepage, L. E., Liu, H., Nelson, C. M., Fata, J. E., et al. (2005) Raclb and reactive oxygen species mediate MlClP-3-induced EMT and genomic instability. Atowre, 436, 123-i 27. Saeed, A. 1., Sharov, V., White, J., Li, J., Liang, W., Bhagabati, N., et al. (2003) TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques, 34, 374-378. Soga, T., Igarashi, K., Ito, C., Mizobuchi, K., Zimmermann, H. P. & Tomita, M. (2009) Metabolomic profiling of anionic metabolites by capillary electrophoresis mass spectrometry. Anal Chem, 81,6165-6174. Sugimoto, M” Wong, T., Hirayama，A” Soga, T. & Tomita, 1^1. (2010) Capillary electrophoresis mass spectrometiy-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics, 6, 78-95. Takahashi, A., Ohtani, N., Yamakoshi, K., Iida, S., Tahara, H., Nakayama, K., et al. (2006) Mitogenic signalling and the pl6INK4a-Rb pathway cooperate to enforce irreversible cellular senescence. Nat Cell Biol, 8,1291-1297. Takemura, Y., Satoh, M., Satoh, K., Hamada, H., Sekido, Y. & Kubota, S. (2010) High dose of ascorbic acid induces cell death in mesothelioma cells. Biochem Biophys Res Commun, 394, 249-253. Vafa, 0., Wade, M., Kern, S., Beeche, M., Panditei, T. K., Hampton, G. M., et al. (2002) c-Myc can induce DNA damage, increase reactive oxygen species, and mitigate p53 fiinction: a mechanism for oncogeneinduced genetic instability. Mol Cell, 9 , 1031-1044. 生田哲• （ 2010)ビタミンC の大量摂取がカゼを防ぎ、がんに効く. 講談社.. 22.