1
Efek Imunostimulator Ekstrak Etanol Kayu Manis(Cinnamomum Burmanii) Terhadap Jumlah CD4, dan Interferon Gamma Pada Mencit BALB/c yang Diinfeksi
Bakteri Salmonella enteritidis
The Effect Of The Immunostimulator Of Cinnamon (Cinnamommum Burmanii)
Ethanol Extract on CD4 and Gamma Interferon in BALB/c Mice Infected By
Salmonella enteritidis
Rr. Dian Anggraini Puspitasari*, Pratiwi Trisunuwati, Sri Murwani
Program Studi Kedokteran Hewan, Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya *diananggrainipuspitasari@ymail.com
ABSTRAK
Ekstrak etanol kayu manis (C. burmanii) memiliki kandungan sinamaldehid, yang mampu meningkatkan sistem imun. Penelitian ini bertujuan untuk melihat efek imunostimulator ekstrak etanol kayu manis (C. burmanii) pada mencit BALB/c yang diinfeksi bakteri S. enteritidis. Penelitian menggunakan true experimental design, post test control design only, dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). Data dianalisis menggunakan one way ANOVA dengan korelasi regresi α=0,05. Mencit BALB/c dibagi menjadi enam kelompok perlakuan yaitu kontrol negatif, kontrol positif dan dosis terapimasing-masing yaitu 50mg/kg BB, 100mg/kg BB, 150mg/kg BB dan 200mg/kg BB, pada hari terakhir pelakuan mencit BALB/c diinfeksi bakteri S.enteritidis dosis 0,25 ml x 108 CFU/ml untuk melihat reaksi sistem imun. Parameter yang diamati adalah jumlah TCD4 dan IFN-γ dengan teknik penghitungan flowcytometry. Hasil pengamatan menunjukkan terdapat peningkatan jumlah sel T CD4 yang mengekspresikan IFN-γ semakin besar dosis ekstrak etanol kayu manis sebagai perlakuan pada penelitian ini semakin tinggi pula peningkatan sel T CD4 dan sel T CD4 yang mengekspresikan IFN-γ. Sehingga dapat disimpulkan bahwa pada penelitian ini membuktikan bahwa ekstrak etanol kayu manis (C. burmanii) memiliki efek imunostimulator.
Kata kunci : C.burmanii, Mencit BALB/c, T CD4, IFN-γ, S.enteritidis.
ABSTRACT
Cinnamon (C. Burmanii) ethanol extract has cynamaldehyde content which had potentially increase against imun respon. The object of the research were to prove the effect of C. burmanii against. S.enteritidis infected mouse (BALB/c). The research was true experimental design,post test control design only, with RAL (Randomized Compleate Design). Data were analyzed using one way ANOVA. Mouse (BALB/c) divided in to treatment groups which are negative control, positive control, and therapy dose. Each group treated with 50 mg/kg body weight,100 mg/kg body weight,150 mg/kg body weight, and 200 mg/kg body weight. The last day treatment, mouse (BALB/c) is infected with S.enteritidis bacterium at dose 0,25 ml x 108CFU/ml per oral. To observe parameters were T CD4 and IFN-γ number with flowcytometry calculation technique. Result indicates that increase the number of T CD4 cells an T CD4 cell express IFN-γ. More heiger dose of treatments would be increase the number of T CD4 cells and ensure the expression of IFN-γ by T CD4 cells. With P (0,05). That was ensure concluded that C. Burmanii has the immunostimulator effect.
2
PENDAHULUAN
Imunomodulator adalah substansi yang mempengaruhi sistem imun. Secara umum ada dua kategori imunomodulator berdasarkan efeknya yaitu imunosupresan dan imunostimulator. Imunomodulator
mempunyai kemampuan untuk
meningkatkan respon imun atau perlindungan terhadap patogen atau tumor. Imunostimulator adalah bahan yang dapat meningkatkan kerja komponan-komponen sistem imun. Sistem imun terdiri atas imunitas nonspesifik dan spesifik. Imunostimulator dapat mengaktivasi sistem imun dengan berbagai cara seperti meningkatkan jumlah aktivitas sel T, NK-cell dan makrofag serta melepaskan interferon dan interleukin (Rahardja, 2007).
Kedua sistem imun tersebut bekerja sama dalam mempertahankan keseimbangan tubuh. Penyembuhan infeksi akan lebih cepat bila fungsi sistem imun tubuh ditingkatkan. Berbagai bahan asal tanaman dapat memacu fungsi berbagai komponen sistem imun nonspesifik (fagosit, sel NK) dan sistem imun spesifik (proliferasi sel T, sel B yang memproduksi antibodi) serta produksi sitokin sehingga dapat digunakan untuk meningkatkan penyembuhan berbagai penyakit infeksi (Alamgir dan Udin, 2010).
Sel tujuan dari imunomodulator adalah makrofag, granulosit, limfosit T dan B karena induktor paraimunitas ini menstimulasi mekanisme pertahanan seluler. Banyak tanaman obat yang telah diteliti membuktikan adanya kerja imunostimulator, sedangkan untuk imunosupresor masih jarang dijumpai. Pemakaian tanaman obat sebagai imunostimulator dengan maksud menekan atau mengurangi infeksi virus dan bakteri intraseluler, untuk mengatasi imuno defisiensi ataus ebagai perangsang pertumbuhan sel-sel pertahanan tubuh dalam sistem imunitas (Blok and Mead,2003).
Infeksi bakteri intraseluler akan memunculkan reaksi yaitu CD4 Th1 yang mengaktifkan makrofag yang memproduksi IFN-γ dan sel CD8 yang memacu pembunuhan mikroba serta lisis sel yang
terinfeksi. CD4 memberikan respon terhadap peptida antigen MHC-II untuk memproduksi IFN-γ yang mengaktifkan makrofag untuk menghancurkan mikroba. Sel CD4 naif dapat berdiferensiasi menjadi sel Th1 yang mengaktifkan fagosit untukmembunuh mikroba (Brooks, 2010).
Penggunaan imunostimulator dalam terapi sering mengalami hambatan, salah satunya adalah mahalnya imunostimulator yang tersedia dipasaran obat paten, imunostimulator sering diimpor dari luar negeri. Dalam kondisi seperti ini perlu dipertimbangkan untuk mendapatkan imunostimulator dari bahan alam yang berharga murah dan efektif (Kusmardi, 2007).
Penggunaan kemoterapi dan antibiotika untuk pengobatan terhadap penyakit dan peningkatan sistem kekebalan tubuh dapat memberikan dampak negatif, seperti resistensi dan penurunan sistem imun tubuh (imunosupresi). Sebagai contoh levamisole yang digunakan sebagai anti helminthiasis dan dapat meningkatkan sel T pada manusia, ternyata pada hewan dengan dosis tinggi dapat menyebabkan penurunan sistem imun (Kusmardi, 2007, Inonu, 2006).
Penggunaan herbal sebagai peningkat sistem imun sedang dikembangkan untuk hewan, penggunaan herbal dilakukan untuk menekan penggunaan bahan kimia yang dapat berpengaruh buruk bila digunakan dalam jangka waktu yang panjang (Sumaryono, 2002). Saat ini perlu digunakan obat herbal yang mampu meningkatkan sistem kekebalan tubuh (Salomi et al., 2011). Berdasarkan latar belakang tersebut maka Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek imunostimulator ekstrak etanol kayu manis (C.burmanii). Penelitian menggunakan mencit BALB/c betina umur 6-7 minggu dengan berat badan sekitar 150-200 gram. Mencit BALB/C betina telah mendapatkan jaminan bebas patogen yaitu dalam kondisi yang bebas dari paparan patogen, tidak dalam keadaan estrus dan tidak dalam keadaan bunting.
3
MATERI DAN METODE Persiapan Hewan Model
Hewan coba berupa mencit BALB/c berjenis kelamin betina berumur 6-7 minggu dengan berat 25-30 gram, mendapatkan jaminan bebas patogen dari Lab yang berada di jember, tidak dalam kondisi estrus dan tidak dalam kondisi bunting, diadaptasikan selama 7 hari di Laboratorium Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (MIPA) Universitas Brawijaya, tujuannya adalah untuk mengoptimalkan kondisi tubuh terhadap lingkungan yang baru. Pemberian pakan dan minum secara adlibitum. Hewan coba mencit BALB/c, terlebih dahulu diseleksi (usia, umur, berat badan, kesehatan), hewan coba dibagi dalam enam kelompok perlakuan. Setiap kelompok perlakuan terdiri dari lima ekor mencit BALB/c.
.
Pembuatan Ekstrak etanol kayu manis
Ekstrak etanol kayu manis didapatkan dari Destimed Kp. Yang beralamat di Cakung No. 1 Rt05/Rw03 Jatisari-Bekasi dalam sedian ekstrak kering serbuk. Ekstrak kayu manis dibuat dari kulit batang atau ranting C. burmanii, suku Lauraceae, mengandung minyak atsiri 2,5 % dan kadar sinamaldehid 1,03%. Dimaserasi menggunakan pelarut etanol 70%. Satu bagian serbuk kering kulit kayu manis dimasukan kedalam maserator, kemudian ditambahkan 10 bagian etanol 70%. Direndam selama 6 jam pertama sambil sekali-sekali diaduk, kemudian didiamkan selama 18 jam. Maserat dipisahkan dengan cara disentrifuse. Proses penyarian diulangi sekuranganya dua kali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Semua maserat dikumpulkan dan diuapkan dengan penguap tekanan rendah sampai diperoleh ekstrak kental. Rendeman yang diperoleh 30%. Ekstrak kental ditimbang kemudian ditambahkan bahan pengisi 5% aerosil dan 65% amylum, setelah itu diaduk hingga merata dan siap untuk dikeringkan selama 10 jam dengan metode freeze drying.
Ekstrak kering etanol kayu manis (C. burmanii) yang didapatkan ditimbang sesuai dosis perlakuan untuk diberikan kepada mencit BALB/c secara per oral. Penimbangan serbuk ekstrak etanol kayu manis dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Progam Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya. Persiapan bakteri Salmonella Enteritidis
Bakteri S. enteritidis didapatkan dari koleksi Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Progam Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya dengan kode 0405/03/2013 (lampiran 2) yang telah diuji kemurniannya di balai besar veteriner Wates Yogyakarta. Selanjutnyadisesuaikan dengan standart Mc Farland yaitu 0,5. Preparasi bakteri S. enteritidis dilakukan di Laboratorium Mikrobilogi dan Imunologi Progam Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya.
Pemberian Perlakuan
Setelah 7 hari adaptasi, mencit BALB/c diberikan ekstrak etanol kering kayu manis yang dicampurkan dengan aquades steril sesuai dengan dosis kelompok yaitu, 50mg/kg BB,100mg/kg BB,150mg/kg BB, dan 200mg/kg BB.Infeksi bakteri dengan tujuan mengetahui tingkat efektifitas imunostimulator ekstrak etanol kayu manis (C. burmanii) yang telah diberikan. Mencit BALB/c diberi minum dan pakan standart secara adlibitum pemberian pakan berupa sedian berbentuk biskuit, bentuk ini diharapkan agar tidak mencemari kandang, karena pakan diletakan diatas anyaman kawat pada kandang. Mencit dikelompokkan dalam 6 kelompok secara acak dan diberi perlakuan sesuai kelompoknya selama 14 hari dengan pembagian yaitu kelompok kontrol
Euthanasi dan Pembedahan
Eutanasi pada mencit dilakukan dengan cara dislokasi servicalis, dilakukan
4 sehari setelah hari terakhir perlakuan yaitu hari ke 22, sebelum dilakukan euthanasi. Mencit ditimbang berat badannya untuk mengetahui status kesehatan maupun gizi.
Setelah euthanasi, pembedahan dilakukan dengan mengambil organ limpa dan diambil peletnya kemudian ditambahkan antibodi ekstraseluler staning IFN-γ dan CD4 untuk kemudian dilakukan pengujian dengan teknik flowcytometry.
Pemerikasaan Flowcytometry
Pemeriksaan flowcytometry bertujuan untuk menghitungCD4 dan IFN-γ dengan metode flowcytometry.
Preparasi Limpa Untuk Pemeriksaan Flowcytometry
Mencit disayat bagian abdomen sebelah kiri dengan menggunakan gunting bedah, kemudian dicari organ limpanya kemudian diangkat, kemudian dibilas dengan menggunakan PBS sebanyak dua kali, diletakan dalam cawan petri yang berisi 5 ml PBS, digerus menggunakan pangkal spuit disaring dengan menggunakan filter milipore, dimasukan dalam tabung propilen, disentrifugasi dengan kecepatan 2500rpm selama 5 menit dengan suhu 40C kemudian diambil peletnya setelah didapatkan pelet
ditambahkan 50μl antibodi ekstrak seluler staning (anti interferon gamma), kemudian dimasukan dalam kuvet flowcytometry kemudian di running.
Perhitungan Sel Granulosit Dengan Haemocytometer
Pelet yang sudah didapatkan dari organ limpa diambil sebanyak 5μl ditambahakan 95μl Trypan Blue dimasukan dalam konikel 15 ml dan dihomogenkan sehingga sel mati terwarnai dan sel hidup dapat dihitung. Perhitungan untuk sel hidup menggunakan kamar hitung dalam haemocytometer. Hasil perhitungan sel granulosit digunakan dalam analisis flowcytometry.
Analisis Data
Analisis data jumlah CD4 dan IFN-γ menggunakan analisis data one way ANOVA. Bila hasil uji one way ANOVA menujukan hasil yang signifikan yaitu adanya peningkatan jumlah CD4 dan IFN-γ maka dilanjutkan dengan uji post hoc test untuk mengetahui signifikansi antar kelompok perlakuan dengan α = 0.05.
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekspresi CD4
Hasil penelitian ekspresi CD4 menunjukkan bahwa perlakuan ekstrak etanol kayu manis (C.burmanii) memiliki rata-rata yang meningkat dibandingkan
dengan kelompok kontrol negatif dan kelompok kontrol positif.Tabel dan grafik peningkatan jumlah CD4 dapat dilihat pada tabel 1 berikut :
Tabel 1. Tabel rata-rata Jumlah Sel CD4
Perlakuan Ulangan (dalam satuan sel) Rata-rata ± Std.Dev
1 2 3 4 Kontrol + 729968.75 816750 696687.5 809843.75 7,6x104 ± 59361,66a Kontrol - 6182737.5 6086000 2190040 7032800 53,7x104 ± 2164118b Perlakuan 1 10910375 7706400 10128000 9197825 948x104 ± 1377320bc Perlakuan 2 9066125 10324125 9360625 10298250 976x104 ± 645211,1cd Perlakuan 3 10760750 12928375 12249900 10865850 1170x104 ± 1062903d Perlakuan 4 12614062.5 10863125 12505500 11248718.75 1180x104± 883520,8 d
5
Berdasarkan uji ANOVA
menunjukkan bahwa ekstrak etanol kayu manis (C. burmanii) dapat meningkatkan jumlah CD4 secara nyata (p< 0,05), rata-rata antar dosis perlakuan cenderung meningkat (Lampiran 1). Perhitungan dilanjutkan dengan analisis post hoc dengan uji Tuckey didapatkan hasil bahwa kelompok perlakuan 1, 2, 3, dan 4 dengan dosis 50, 100, 150, sdan 200 mg/kg BB memiliki perbedaan yang signifikan dibandingkan kelompok kontrol negatif dan kelompok kontrol positif (Lampiran 1). Kelompok kontrol (-) diberi perlakuan pakan dan infeksi bakteri S. enteritidis memiliki rata-rata yang meningkat dibandingkan rata-rata kelompok kontrol (+) mencit yang hanya diberikan pakan, hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Mittrucker et al, 2000, bahwa Infeksi bakteri pada mencit dapat menginduksi respon sel Th1. Sebagian besar sel T CD4+ dan CD8+ akan teraktifasi setelah infeksi. Mencit BALB/c kontrol (-) yang diberi infeksi S.enteritidis mengalami peningkatan jumlah CD4 dibandingkan kelompok kontrol (+) yang diberi pakan standar saja.
Menurut Lehner (2001) pada umumnya antigen yang masuk dalam tubuh baik yang disebabkan oleh bakteri, virus, parasit, fungi, prion dan viroid akan selalu memicu sistem
kekebalan tubuh dimulai dari pertahanan tubuh non spesifik dengan cara memusnahkan bakteri serta pertahanan tubuh spesifik dengan membentuk pertahanan yang lebih kompleks melalui produksi antibodi ataupun dengan memproduksi berbagai sitokin.
CD4 di dalam penelitian ini bekerja sebagaI regulator dan fungsi efektor. Fungsi regulator terutama dilakukan oleh salah satu subset sel T, sel T penolong (CD4). Sel-sel CD4 mengeluarkan molekul yang dikenal dengan nama sitokin (protein berberat molekul rendah yang disekresikan oleh sel-sel sistem imun) untuk melaksanakan fungsi regulatornya. Sitokin dari sel CD4 mengendalikan proses imun seperti pembentukan imunoglobulin.
Ekspresi IFN-γ
Efek imunostimulator terhadap IFN-γ juga menunjukkan peningkatan. Pemberian ekstrak etanol kayu manis (C. burmanii) pada perlakuan rata-rata dapat meningkat dibandingkan dengan kelompok kontrol (-) dan kelompok kontrol (+), hal ini sejalan dengan hasil ekspresi CD4.
Tabel dan grafik peningkatan IFN-γ dapat dilihat pada tabel 2 berikut :
Tabel 2. Tabel Rata-rata Jumlah Sel IFN-γ
Perlakuan Ulangan (dalam satuan sel) Rata-rata ± Std.Dev
1 2 3 4 Kontrol + 124608.75 163350.00 93187.50 138243.75 129847.50 ± 29236,47a Kontrol - 671500.00 571200.00 806600.00 867300.00 729150.00 ± 133361,23b Perlakuan 1 901475.00 807625.00 657000.00 841500.00 801900.00 ± 104102,72b Perlakuan 2 937875.00 915562.50 1075350.00 999087.50 981968.75 ± 71570,847bc Perlakuan 3 1025125.00 1158300.00 995100.00 722250.00 975193.75 ± 182936,99bc Perlakuan 4 1216125.00 1210625.00 1047375.00 1010375.00 1121125.00 ± 107610,2 c
Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan, p = nilai signifikansi
Berdasarkan uji ANOVA
menunjukkan bahwa ekstrak etanol kayu manis (C. burmanii) dapat meningkatkan jumlah IFN-γ secara nyata (p< 0,05), rata-rata antar dosis perlakuan cenderung
meningkat(Lampiran 2). Perhitungan dilanjutkan dengan analisis post hoc dengan uji Tuckey didapatkan hasil bahwa kelompok perlakuan 1, 2, 3, dan 4 memiliki perbedaan yang signifikan dibandingkan kelompok kontrol (-) dan kelompok kontrol (+) (Lampiran 2). Pemberian terapi
6 menggunakan ekstrak etanol kayu manis dapat meningkatkan jumlah IFN-γ. Hal ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oeh Ramchandra, 2006 mengenai kandungan sinamaldehid pada C. zeylanicum bark. yang mampu meningkatkan respon imun. Kelompok kontrol (-) yang diberi infeksi S. enteritidis memiliki rata-rata lebih meningkat dibandingkan rata-rata kelompok kontrol (+) yang hanya diberikan pakan, hal tersebut sesuai dengan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Eckmann (2001) yang menunjukkan bahwa terdapat peningkatan jumlah IFN-γ pada hewan coba setelah penginfeksian bakteri S. enteritidis dibandingkan dengan hewan normal tanpa penginfeksian bakteri S. enteritidis.
Menurut, Abbas (1994). Senyawa sinamaldehid mempunyai aktivitas imunostimulator seperti pada Interferon gamma yang menginduksi dan mengaktivasi makrofag dan limfosit T. Aktivasi makrofag akan mensekresi sitokin (IL-1, IL-6, IL-12 dan TNF-α) dan mengaktivasi sel T. Aktivasi sel T tersebut mensekresi IFN-γ yang menginhibisi diferensiasi produksi antibodi oleh sel B. Aktivitas IFN-γ yang mampu memediasi respon imun seluler teraktivasi, ketika respon imun humoral ditekan produksinya. Senyawa sinamaldehid juga dapat memacu proliferasi limfosit, meningkatkan jumlah sel T dan meningkatkan aktivitas IL-2.
KESIMPULAN
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol kayu manis (C.burmanii) mempunyai efek imunnostimulator berdasarkan adanya peningkatan jumlah CD4 dan IFN-γ pada mencit BALB/c yang diinfeksi bakteri S. enteritidis.
UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti mengucapkan terima kasih kepada Drh. Dahliatul Qosimah., Mkes dan Dr. Sri Murwani , drh., MP yang telah mengijinkan penulis mengikuti penelitian payung ini kepada Prof. Dr. Pratiwi
Trisunuwati, drh., MS sebagai dosen pembimbing pertama.
DAFTAR PUSTAKA
Abbas, AK., Litchman AH, Pober JS. 1994. Cellular Immunology in: Cellular and molecular immunology, 2nd ed. Philadelphia: WB. Saunders Company Alamgir, H., Udin,. 2010. Development of
highly sensitive immunosay to measure HCG, aplication to malignancies. Cancer Res. USA
Dubiab, Al, 2012. Cinnamon Handbook of Herbs and Spices . New York : CRC Press.
Baratawidjaja, K G. 2010. Imunologi Dasar. Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia
Barnier, 1985. A source book of children with developmental Disabilities. Paul H. Brookes Publishing Co.: Baltimore
Benny, and Vanitha, 2004.
Imunnomodulatory and Antimicrobial Effect of some Traditional China Medical Herbs: Departement of Pharmacology, Faculty of Medicine, National University of singapore
Blok, and Mead, 2003. Immune system effects of echinacea, ginseng, and astragalus. Institute for Integrative Cancer Care and Block Center for Integrative Cancer Care, Evanston, Illinois 60201, USA.
Brooks, G.F., Carroll KC., Butel JS., Morse SA., Mi-etzner TA. Jawetz, Melnick, & Adelberg’s medical microbiology 25th ed. Access Medicine: Mc-Graw Hill; 2010 Cowan, M.M., 1999. Plant Product as
Antimcrobial Agent. Clinical Microbiology Reviews, p 564-582.
7 Cytopatol, 2009. III. Washington. D.C:
Georgetown University School of Medicine. Halaman 18
Delcenserie, 2010. Efek Imunostimulator Beberapa Fraksi Teripang Lokal (Phillophorus sp Terhadap Histology Limpa Mencit Mus Muculus yang diinfeksi Mycobacterium. Studi Biologi, Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga, Surabaya
Diane, 2008. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Terjemahan Irawati Setiawan. Jakarta :EGC
Ekaprasada, 2009. Ramuan Tradisional Untuk Pengobatan Kanker. Penebar Swadaya, Jakarta
Faix., and meriiana. 2009. Antibacterial Properties and MajorBioactive Components of Cinnamon Stick (Cinnamomum burmanii) : Activity against Foodborne Pathogenic Bacteria. J Agric Food Chem. 2007 jul 11;55(14) : 5484-90
Gende, 2008. Pengaruh Jus Aloe vera terhadap kemampuan fagositosis makrofag mencit Balb/c yang diinfeksi Salmonella typhimurium. Hasil Penelitian. Lembaga Penelitian Universitas Negeri Semarang
Gupta, GP., and Garris HK. 2008. Arzneidrogen (Ein Kompendium fur Pharmazeuten Biologen und Chemiker)., B.I . Manheim : Wissenschaftsverlag
Granot, 1998. Cell to cell Communication in The Ovarian Follicle: Reproduction 13 Suppl: 4. Europeean Society for human Reproduction Embrilogy.
Hernani, 1988. Penyulingan Minyak Dahan dan Ranting Kayu Manis. Jurnal Bala
Penelitian Tanaman Rempah dan Obat. Bogor.
Inonu, 2006. Kimia Farmasi. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. hal. 255-268 Kusmardi, 2007. Obat-obat penting khasiat,
penggunaan, dan Efek-efek Sampingnya Edisi ke VI. Jakarta: PT Elex Media Komputindo: hal. 193
Munusamy S., 2013. Aspek Teknis Pengolahan Rempah-rempah Oleoresin dan Minyak Rempah-rempah. Bogor : BBHIP.
Mittrucker, Davis, M.R., Quiqley, M.N., 2000. valuation of Crude Extracts of Cinnamomum tamala for Potential Antibacterial Activity. Electronic Journal of Biology. 2009. Vol.5(4): 75-79
Moreland, S. 2004, 3-Carbamoyl-4-aryl-
1,2,3,4-tetrahydro-6-methyl-5-pyrimidinecarboxylic Acid Esters as Orally Effective Antihypertensive Agents. J. Med. Chem. 34, hal: 806 , California Morimoto, T., Hara, Y., Kato, Y., Hiratsuka,
J., Yoshioka, T., Fujita, Y. & Yamda, Y. 1988. Berberine production by cultured Coptis japonica cells in a one-stage culture using medium with a high Copper concentration. Agric. Biol. Chem. 52 (7): 1835-1836.
Rahardja, 2007. Efek Imunomodulator Ekstrak Daun Ketepeng Cina (cassia alata l.) Terhadap Aktivitas dan Kapasitas Fagositosis Makrofag.
Sumaryono, 2002. Cell mediated immune respon. In: Sonnenwirth AC . Clinical Laboratory Methods and diagnosis vol II, St Louis, Mosby Company
Salomi, 2011. Ramuan Tradisional Pelangsing Tubuh.Penebar Swadaya :Depok
8 Rismunandar, 1995. Kayu Manis Budidaya
dan Pengolahan, Penebar Swadaya, Jakarta. Siagian.
Rismunandar, 2011. Rempah- rempah Komoditi Ekspor Indonesia. Bandung : Sinar Baru.
Rismunandar, 1993. Managemen Penyakit Infeksi : perkembangan baru Antibiotika dan Imunostimulan. Simposium Mini managemen Infeksi. Semarang.
Rusli, AK., dan Abdullah R, 1988. Komoditi Kayu Manis di Sumatera Barat. Pusat Penelitian dan Pengembangan Hasil Hutan dan Sosial Ekonomi Kehutanan. Balai Penelitian dan Pengembangan Kehutanan. Bogor.
Shen., Groves, G.A., Forber, P.D., 2011. Attracting AID to targets of somatic hypermutation." J Exp Med 207(2): 405-415.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/201 00870.
Suherlan, 1995 Suherlan, A. 1995. Uji aktivitas antibakteri ekstrak kayu manis (Cinnamomum burmanii (Nees) BI) . Skriksi JF MIPA UNPAD.
.
Thomas, J. dan P.P., and Duethi. 2001. Cinnamon Handbook of Herbs and Spices. New York : CRCPress.
Yen C.G., Yeh T.C. and Chen J.Yen. 2004. Protective Effect of Mesona procumbens against tert-Butyl Hydroperoxide-Induced Acute Hepatic Damage in Rats. J. Agricultural and Food Chemistry. 52,4121-4127.
Yuniastuti Ari, 2008. Gizi dan Kesehatan. Graha Ilmu : Yogyakarta.
