METODE PARAFIN METODE PARAFIN
Metode parafin adalah suatu cara pembutan sediaan baik itu tumbuhan ataupun hewan Metode parafin adalah suatu cara pembutan sediaan baik itu tumbuhan ataupun hewan dengan menggunakan parafin. Kebaikan-kebaikan metode ini ialah irisan jauh lebih tipis dari dengan menggunakan parafin. Kebaikan-kebaikan metode ini ialah irisan jauh lebih tipis dari pada
pada menggunakan menggunakan metoda metoda beku beku atau atau metoda metoda seloidin. seloidin. Dengan Dengan metoda metoda beku, beku, tebal tebal irisan irisan rata- rata-rata diatas 10 mkron, tapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata-rata-rata 6 mikron. rata diatas 10 mkron, tapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Kelemahan dari metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Kelemahan dari metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan- jaringan
jaringan yang yang besar besar tidak tidak dapat dapat dikerjakaan, dikerjakaan, bila bila menggunakan menggunakan metode metode ini. ini. Sebagian Sebagian besarbesar enzim-enzim yang terdapat pada jaringan akan larut dengan menggunakan metode ini
enzim-enzim yang terdapat pada jaringan akan larut dengan menggunakan metode ini (Rina,(Rina, 2010).
2010).
Prosedur pembuatan sediaan menggunakan metode parafin pada umumnya sama baik pada Prosedur pembuatan sediaan menggunakan metode parafin pada umumnya sama baik pada jaringan hewan maupun tumbuhan
jaringan hewan maupun tumbuhan yaituyaitu diseksi, fiksasi, pencucian dan dehidrasi, dealkoholisasi, diseksi, fiksasi, pencucian dan dehidrasi, dealkoholisasi, infiltrasi, embedding, penyayatan, affixing, pewarnaan, penutupan dan pemberian nama atau infiltrasi, embedding, penyayatan, affixing, pewarnaan, penutupan dan pemberian nama atau pelabelan (Hasan, 2010)
pelabelan (Hasan, 2010)..
Diseksi merupakan proses pengambilan jaringan atau bagian jaringan dari sumber alami Diseksi merupakan proses pengambilan jaringan atau bagian jaringan dari sumber alami baik
baik berupa berupa tumbuhan tumbuhan ataupun ataupun hewan hewan yang yang akan akan digunakan digunakan sebagai sebagai bahan bahan dasar dasar dalamdalam mikroteknik. Fiksasi adalah usaha yang dapat mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan mikroteknik. Fiksasi adalah usaha yang dapat mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan agar tetap berada pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran. agar tetap berada pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran. Tujuan dilakukan fiksasi dalam pembuatan preparat dengan menggunakan metode paraffin Tujuan dilakukan fiksasi dalam pembuatan preparat dengan menggunakan metode paraffin adalah:
adalah:
1. mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme)jaringan dengan cepat, sedangkan 1. mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme)jaringan dengan cepat, sedangkan keadaan sedikit banyaknya mendekati keadaan semula.
keadaan sedikit banyaknya mendekati keadaan semula.
2. mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabkan oleh mikroorganisme ataupun 2. mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabkan oleh mikroorganisme ataupun kerusakan oleh jenis enzim yang terkandung oleh jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan kerusakan oleh jenis enzim yang terkandung oleh jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autoloisis.
autoloisis.
3. Meningkatkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras (mordant) yang merupakan 3. Meningkatkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras (mordant) yang merupakan komponen jaringna fiksatif.
komponen jaringna fiksatif.
Dehidrasi adalah proses penarikan air dari dalam jaringan dengan menggunakan Dehidrasi adalah proses penarikan air dari dalam jaringan dengan menggunakan bahan- bahan kimia tertentu. Dehidrasi bertujuan
bahan kimia tertentu. Dehidrasi bertujuan untuk mengeluarkan untuk mengeluarkan air dari dalam jaringan air dari dalam jaringan yang telahyang telah difiksasi. Dealkoholisasi merupakan proses harus segera dilakukan setelah dehidrasi. Tujuan dari difiksasi. Dealkoholisasi merupakan proses harus segera dilakukan setelah dehidrasi. Tujuan dari
penjernihan ini adalah menggantikan tempat alcohol sementara dalam jaringan yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih sebelum proses penanaman dalam paraffin.
Infiltrasi adalah suatu usaha menyusupkan media penanaman (embedding media) ke dalam jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih (clearing agents). Media penanaman yang digunakan dalam infiltrasi ini adalah paraffin. Proses infiltrasi ini umumnya dilakukan di dalam oven yang suhunya dapat diatur sesuai titik leleh jenis paraffin yang digunakan. Pada jaringan
Embedding atau penanaman merupakan proses memasukan atau penanaman jaringan ke dalam balok-balik paraffin (cetakan) sehingga memudahkan proses penyayatan dengan bantuan mikrotom. Tujuan dari tahap ini adalah untuk membuat balok paraffin yang berisi jaringan yang akan dibuat preparat permanen.
Proses penyayatan adalah pembuatan sayatan atau pita dari balok parafin yang telah terbentuk dengan menggunakan mikrotom, yang bertujuan untuk membuat sayatan jaringan dan dapat dilihat jelas dari dalam mikroskop. Pembuatan irisan dengan metode parafin memiliki beberapa keuntungan,
Affixing adalah proses pelekatan atau penempatan sayatan jaringan pada kaca objek dengan bantuan media pelekat tertentu. Tujuan penempelan ini adalah untuk menempelkan pita paraffin yang sudah berisi sayatan jaringan pada kaca objek. Deparafinasi adalah suatu tahap menjelang proses pewarnaan dengan menggunakan xilol untuk membersihkan paraffin dari jaringan dan kaca objek
I. TUJUAN : Untuk mengetahui bahan, alat dan cara pembuatan sediaan irisan jaringan tumbuhan dengan metode parafin.
II. ALAT & BAHAN
1. ALAT
Nama alat Jumlah
a. Wadah untuk proses dehidrasi-clearing secukupnya
b. Staining jar secukupnya
c. Label secukupnya
d. Pinset secukupnya
f. Rotary mikrotome secukupnya
g. Hot plate secukupnya
h. Waterbath secukupnya
i. Objek glass secukupnya
j. Deg glass secukupnya
2. BAHAN
Nama bahan Jumlah
a. Akar kaktus secukupnya
b. Akar Enceng Gondok ( Eichornia crassipes) secukupnya c. Batang Seledri ( Apium graveolens) secukupnya d. Batang Bayam ( Amaranthus sp) secukupnya e. Daun Jeruk purut (Citrus hystrix) secukupnya f. Daun Karet kebo ( Ficus elastica) secukupnya g. Bunga Belimbing ( Averrhoa carambola) secukupnya h. Bunga Cabe (Capsicum annum) secukupnya i. Biji Belimbing wuluh ( Averrhoa bilimbi) secukupnya j. Biji Cabe besar (Capsicum annum) secukupnya k. Buah Pisang ( Musa paradisiaca) secukupnya l. Buah Cabe (Capsicum annum) secukupnya
III. CARA KERJA Hari ke I : A. Pencucian
Mencuci organ dengan air, jangan sampai merusak organ. Kemudian memasukkan kedalam flakon.
B. Koleksi organ tumbuhan: a. Bunga
1. Mengambil bunga yang masih kuncup
2. Potong bagian ujung untuk mendapatkan benang sari dan putik, dan potong bagian pangkal untuk mendapatkan ovul.
b. Daun
1. Memotong daun dengan bentuk persegi empat pada bagian daun yang terdapat tulang daun atau urat daun.
c. Akar
1. Memotong akar secara melintang d. Batang
1. Memotong batang secara melintang e. Biji
C. Fiksasi : Dipakai larutan FAA
Formalin ... ... 5 bagian Asam asetat glasial ... 5 bagian Alkohol 70% ... 90 bagian Diamkan selama 24 jam
Hari ke II : Pencucian dan dehidrasi:
Fiksatif dibuang lalu diganti berturut-turut dengan: Alkohol 70% ... 30 menit Alkohol 80% ... 30 menit Alkohol 95% ... 30 menit Alkohol 100% ... 30 menit Alkohol 100% ... 30 menit Dealkoholisasi:
Alkohol / xilol 3:1 ... 30 menit Alkohol / xilol 1:1 ... 30 menit Alkohol / xilol 1:3 ... 30 menit Xilol ... 30 menit Xilol ... 30 menit
Campuran Xilol / parafin 1:9 dengan temperatur 57°C selama 24 jam
Hari ke III : Infiltrasi: Campuran xilol/parafin dibuang diganti dengan paraffin murni.
Temperatur tetap 57°C selama 24 jam.
Hari ke IV : Penyelubungan: Parafin dibuang diganti dengan parafin murni yang baru.
Setelah ± 1 jam dibuat balok.
Hari ke V : Pengirisan: Dibuat irisan-irisan dengan menggunakan Rotary mikrotome dengan ketebalan 6-12µm (mikronmeter).
Perekatan: Irisan direkatkan pada gelas benda dengan campuran Gliserin: Albumin yang dibubuhi air, kemudian gelas benda ditaruh diatas Hot plate dengan temperatur 45°C sampai pita paraffin merenggang.
Hari ke VI : Pewarnaan : dengan safranin 1% dalam alkohol 70%. Berturut-turut gelas benda dimasukkan dalam:
Xilol ... 3 menit Xilol ... 3 menit Alkohol / xilol 1:3 ... 3 menit Alkohol / xilol 1:1 ... 3 menit Alkohol / xilol 3:1 ... 3 menit Alkohol 100% ... 3 menit Alkohol 100% ... 3 menit Alkohol 95% ... 3 menit
Alkohol 80% ... 3 menit Alkohol 70% ... 3 menit Safranin 1% dalam Alkohol 70% ... 1 jam Alkohol 70% ... 1 menit Alkohol 80% ... 1 menit Alkohol 95% ... 1 menit Alkohol 100% ... 1 menit Alkohol 100% ... 1 menit Alkohol / xilol 3:1 ... 1 menit Alkohol / xilol 1:1 ... 1 menit Alkohol / xilol 1:3 ... 1 menit Xilol ... 1 menit Xilol ... 1 menit
Penutup: Irisan ditutup dengan gelas penutup dengan pemberian Balsam Kanada terlebih dahulu.
Pemberian nama: Disebelah kiri gelas penutup dilekatkan etiket dan diberi keterangan: nama spesies, organ, penampang, dsb.
