Berk. Penel. Hayati Edisi Khusus: 3A (95–99), 2009
PrODUKsI MaLtODEKstrIN BErBasIs PatI sECara ENZIMatIK
DaN UJI rEaKsI traNsGLIKOsILasI
rita Dwi rahayu, Joko sulistyo dan achmad DinotoBidang Mikrobiologi, Puslit Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Jl. Raya Jakarta-Bogor Km 46, Cibinong Science Centre. 1691116911
ABSTRACT
We have succesfully produced maltodextrin enzimatically by employing α-amylase of Bacillus licheniformis on various kinds of tuber's starch. Another results on thin layer chromatography analysis showed that maltodextrin from cassava starch was suitable as substrate for making isomaltooligosaccharides by employing glucoamylase of Aspergillus oryzae that was furthermore used for the substrate for enzymatic transglycosylation reaction. The synthesized isomaltooligosaccharide was then incubated with acceptors (pyrocathecol and resorcinol) for 24 hours. Pyrocathecol was able to be a good acceptor for synthesis of pyrocathecol-glycoside by the reaction and Rf value that closed to a standard of arbutin (0.75) while the value Rf of for pyrocathecol-glycoside was 0.66. The pyrocathecol was able to be a good acceptor for synthesis of pyrocathecol-glycoside as the transfer product with its Rf value closed to value Rf of arbutin as the standard (0.72) and Rf value of resorcinol-glycoside was 0.66. The result of the analysis using HPLC showed that the transfer product by using acceptor of resorcinol by yielded the highest concentration of transfer product (20.10 ppm) followed pyrocathecol as its acceptor (52.56 ppm) when they were incubated for 48 hours.
Key words: tubers, maltodextrin, Aspergillus oryzae, Bacillus licheniformis, transglycosilation reaction
PENGaNtar
Penggunaan maltodekstrin bagi industri pangan dan farmasi semakin meningkat karena maltodekstrin berfungsi sebagai pengental, emulsifier dan pengganti gula pada susu bubuk, karena maltodekstrin sangat baik bagi tubuh untuk memperlancar saluran pencernaan dengan membantu berkembangnya bakteri probiotik (Shofiyanto, 2008). Maltodekstrin dapat dibuat menggunakan pati dari jenis umbi-umbian sebagai bahan baku melalui proses hidrolisis oleh asam atau dengan hidrolisis secara enzimatik. Produksi maltodekstrin secara enzimatik lebih mudah, murah, cepat dan ramah lingkungan dibandingkan hidrolisis dengan asam (Atmana dkk, 1992).
Maltodekstrin merupakan salah satu produk turunan pati yang dapat dihasilkan melalui proses hidrolisis oleh enzim �-amilase (Blazek-Welsh, 2001). Maltodekstrin dapat�-amilase (Blazek-Welsh, 2001). Maltodekstrin dapat diuraikan menjadi komponen yang lebih sederhana sehingga dihasilkan isomaltooligosakarida dan dapat digunakan sebagai substrat yang efektif untuk menghasilkan produk transglikosilasi secara enzimatik dengan menggunakan akseptor polifenol yang sesuai (Handayani dan Sulistyo, 2008).
Reaksi transglikosilasi adalah reaksi pemindahan unit gula ke akseptor yang memiliki gugus –�H (Kometami et al, 1996), menggunakan enzim siklodekstrin glukanotransferase (CGTase) pada senyawa polifenol sebagai akseptor (Sulistyo
et al, 1998), mengingat bahwa beberapa senyawa polifenol
memiliki peranan sebagai antibakteri dan antioksidan (Funayama et al, 1995).
Namun penggunaan senyawa polifenol masih sangat terbatas, sehingga belum dapat dimanfaatkan secara optimal, mengingat senyawa polifenol tidak stabil terhadap pengaruh cahaya, oksidasi dan perubahan kimia, sehingga apabila teroksidasi strukturnya akan berubah dan fungsinya sebagai bahan aktif akan menurun bahkan hilang dengan sifat kelarutannya yang rendah (Kitao et al, 1993). Untuk meningkatkan kestabilan dan kelarutan dapat dilakukan dengan cara mengubah senyawa polifenol menjadi bentuk glikosida melalui reaksi transglikosilasi dengan bantuan enzim CGTase (Kometami et al, 1996).
Penelitian ini bertujuan untuk mensintesis maltodekstrin dan isomaltooligo sakharida dari berbagai jenis pati, masing-masing menggunakan enzim amilase dan glukoamilase dari biakan Bacillus licheniformis dan Aspergillus oryzae guna menghasilkan substrat yang efektif untuk reaksi transglikosilasi enzimatik.
BaHaN DaN Cara KErJa
Percobaan dilakukan dalam 4 tahapan, yaitu tahapan produksi enzim amilase secara fermentasi menggunakan isolat B. Licheniformis dan enzim glukoamilase menggunakan isolat A. Oryzae, tahapan pembuatan dan analisis kualitatif maltodekstrin, tahapan produksi isomalotooligosakarida serta tahapan uji aktivitas reaksi transfer.
Produksi Maltodekstrin Berbasis Pati
6
Produksi Enzim amilase dan Enzim Glukoamilase
Produksi enzim amilase dan enzim glukoamilase menggunakan media standar (3 gram (NH4)2S�4, 0,5 gram
MgS�4, 0,1 gram CaCl2, 0,01 gram MnS�4, 0,1 gram FeS�4, 3 gram malt ekstrak, 0,5 gram peptone, 10 gram
glukosa. Pembuatan enzim amilase menggunakan isolat
B. licheniformis dengan substrat pati belitung ternate.
Enzim glukoamilase menggunakan isolat A. oryzae pada substrat isomaltooligosakarida. pH disesuaikan dengan pH tumbuhnya mikroba (pH A. oryzae = 5,5 dan B. licheniformis = 6,9). Media disterilisasi dengan autoclaf suhu 121° C, selama 20 menit.
Biakan yang telah tumbuh disuspensikan dengan 5 ml air suling steril, suspensi biakan diinokulasi pada media produksi enzim. Inkubasi dilakukan dengan digoyang pada
incubator shaker suhu 45° C untuk Bacillus licheniformis
dan 40° C untuk Aspergillus oryzae dengan kecepatan 145 rpm selama 4 hari kemudian disentrifus pada suhu 4° C, 6000 rpm selama 30 menit, untuk menghasilkan enzim kasar. Aktivitas amilase dan glukoamilase ditentukan dengan pengukuran gula pereduksi menggunakan metode DNS.
Pengukuran aktivitas Enzim
Sebanyak 1 ml pati 1% (b/v) dan 1 ml enzim yang telah diencerkan dimasukkan ke tabung reaksi, diinkubasi suhu 37° C selama 120 menit, ditambah 1 ml DNS, dipanaskan pada suhu 100° C selama 7 menit, didinginkan dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada 540 nm. Aktivitas enzim dinyatakan dalam satuan U (unit) dengan cara mengkonversikan absorbansi gula pereduksi yang terbentuk berdasarkan kurva standar glukosa.
Gt × volume larutan × pengenceran BM Glukosa × volume enzim × waktu inkubasi (menit) Aktivitas enzim (U) =
Keterangan: (Gt), konsentrasi gula pereduksi (mg/l)�� (P), pengenceran�� (Volume larutan), volume total larutan dalam tabung reaksi 3 ml�� (BM Glukosa), bobot molekul glukosa 180 mg/ml�� (Volume enzim), volume ekstrak enzim yangVolume enzim), volume ekstrak enzim yang digunakan 1ml�� (Waktu inkubasi), dalam satuan menit yaitu 120 menit.
analisis Kualitatif Maltodekstrin
Produksi Maltodekstrin menggunakan beberapa macam pati umbi yaitu:belitung Ternate (Xanthosoma violaceum Schott.), ganyong Jawa Timur (Canna edulis Ker.), huwi jawa timur (Dioscorea bulbifera L.), singkong Bogor
(Manihot esculenta Crantz.), ubi jalar Ternate (Ipomoea
batatas Ker.) dan gembili Jawa Timur (Dioscorea aculeata
L.).
Sebanyak 10% (b/b) pati disuspensikan dalam air bebas ion mengandung 200 ppm CaCl2. Campuran
ditambahkan enzim �-amilase sebanyak 25% (b/b) sambil�-amilase sebanyak 25% (b/b) sambil diaduk, diinkubasikan dalam waterbath shaker selama 65 menit dihitung setelah suhu mencapai 85° C (Griffin & Brooks, 1989) kecepatan 600 rpm, selanjutnya campuran didinginkan dalam air dingin. Sampel dianalisa dengan KLT yang dikembangkan dengan larutan eluen A. Plat KLT dikeringkan pada suhu 121° C selama 1 jam, lalu disemprot dengan larutan penimbul warna dan dibakar pada suhu 150° C selama 5–10 menit.
Produksi Isomaltooligosakarida
Maltodekstrin yang telah dibuat dari substrat singkong dan ganyong menggunakan enzim amilase (enzim dari B.
Licheniformis) direaksikan dengan enzim glukoamilase
(enzim dari A. oryzae) sebanyak 5% b/v lalu diinkubasi selama 3, 6 dan 24 jam pada suhu 40° C pada waterbath, diharapkan dapat terbentuk isomaltooligosakarida dan selanjutnya dilakukan analisis KLT.
Uji aktivitas reaksi transfer
Campuran reaksi terdiri dari substrat isomaltooligo sakarida 0,1 g, akseptor polifenol (pirokatekol dan resorsinol) 0,1 g, enzim amilase 0,5 ml, buffer asetat (pH 5) 0,8 ml, diinkubasi pada suhu 40° C selama 3, 6, 24 dan 48 jam dan setelah diinkubasi 6 jam ditambahkan enzim glukoamilase 0,5 ml, kemudian dianalisis dengan KLT dalam larutan pengembang 1-propanol 85% (v/v). Plat KLT dikeringkan pada suhu 120° C selama 1 jam kemudian disemprot dengan larutan pembangkit H2S�4 dalam metanol (20:80). Plat KLT
dipanaskan dalam oven pada 150° C selama 5–10 menit. Standar yang digunakan adalah arbutin, �-metil glikosida, glukosa dan maltosa masing-masing 1% (b/v).
HasIL
Produksi Enzim amilase dan Enzim Glukoamilase
Hasil percobaan menunjukkan bahwa produksi enzim amilase dari biakan B. licheniformis dengan substrat pati belitung menghasilkan enzim amilase (2,4877 U). Enzim glukoamilase dari biakan A. oryzae dengan substrat isomaltooligosakarida menghasilkan aktivitas sebesar 3,797 U.
Rahayu, Sulistyo dan Dinoto 7 analisis Kualitatif Maltodekstrinis Kualitatif Maltodekstrin
Hasil sintesis maltodekstrin dapat dilihat pada gambar 1. Hasil positif terbentuknya maltodekstrin ditandai dengan larutnya keseluruhan pati dan menghasilkan cairan yang kental yang kemudian diuji secara kualitatif dengan menggunakan kromatografi lapis tipis.
1 2 3 4 5 6
Keterangan:
1. Pati singkong (Manihot esculenta Crantz.) 2. Pati gembili (Dioscorea aculeata L.) 3. Pati huwi buah (Dioscirea bulbifera .L) 4. Pati ganyong (Canna edulis Ker.) 5. Pati ubi jalar (Ipomoea batatas L.) 6. Soluble starch
Gambar 1. Produksi maltodekstrin menggunakan enam jenis
substrat pati. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Keterangan: 1. Maltodekstrin komersil 2. Maltosa 3. Glukosa 4. Pati singkong 5. Pati gembili 6. Pati huwi buah 7. Pati ganyong 8. Pati ubi jalar 9. Soluble starch Gambar 2. Hasil analisis maltodekstrin menggunakan KLT
1 2 3 4 5 6 Keterangan: 1. Isomaltooligosakarida komersil 2. Maltosa 3. Glukosa
4. Maltodekstrin hasil inkubasi 3 jam 5. Maltodekstrin hasil inkubasi 6 jam 6. Maltodekstrin hasil inkubasi 24 jam Gambar 3. Hasil analisis isomaltooligosakarida menggunakan
KLT Į-metil glikosida 1 2 3 4 5 6 7 1 Produk transfer Arbutin Glukosa Maltosa
Gambar 4. Hasil analisis KLT reaksi transglikosilasi dengan
substrat isomalto oligosakarida dan akseptor pirokatekol
1 2 3 4 5 6 7 1 Arbutin Į-metil glikosida Glukosa Maltosa Produk transfer
Gambar 5. Hasil analisis KLT reaksi transglikosilasi dengan
substrat isomalto-oligosakarida dan akseptor resorsinol. Keterangan: (1), Standar (Arbutin, metil-glikosida, maltosa, glukosa); (2), hasil inkubasi 0 jam; (3), Inkubasi 3 jam; (4), Inkubasi 6 jam; (5), Inkubasi 24 jam dan (6), setelah penambahan enzim glukoamilase; (7), Inkubasi 48 jam
PEMBaHasaN
Dari Gambar 1 menunjukkan bahwa maltodekstrin yang disintesis dari substrat pati singkong, gembili, huwi buah, ganyong, ubi jalar dan soluble starch menghasilkan profil maltodekstrin yang berbeda-beda satu dengan yang lainnya. Penggunaan substrat soluble starch menghasilkan maltodekstrin yang ditandai dengan terbentuknya cairan yang kental dan jernih. Substrat singkong relatif lebih jernih dan kental dibanding substrat lainnya yang padat dan agak keruh, karena pada pati selain ada amilosa dan amilopektin, juga terkandung protein, lipid, fosfor dan abu.
Produksi Maltodekstrin Berbasis Pati
Gambar 2 menunjukkan kromatogram KLT dari maltodektsrin yang dihasilkan oleh biakan B. licheniformis menggunakan substrat dari pati singkong, gembili, huwi buah, ganyong, ubi jalar dan soluble starch. Standar yang digunakan adalah maltodekstrin komersil, maltosa dan glukosa. Identifikasi maltodekstrin pada kromatografi lapis tipis ditunjukkan dengan adanya noda yang memiliki nilai Rf yang mendekati nilai Rf standar maltodekstrin komersil yaitu 0,36, 0,31, 0,25, 0,21, 0,16. Standar yang digunakan dalam identifikasi maltodekstrin adalah maltodekstrin komersil.
Hasil tersebut juga menunjukkan bahwa produk maltodekstrin yang dihasilkan dari enam jenis pati menunjukkan Rf yang berbeda-beda. Noda yang dihasilkan menggunakan substrat pati huwi buah dan pati ganyong lebih jelas pemisahannya dibandingkan noda yang dihasilkan menggunakan substrat dari pati singkong, gembili, ubi jalar dan soluble starch. Hal ini mengindikasikan bahwa maltodekstrin yang dihasilkan menggunakan substrat pati huwi buah dan pati ganyong lebih sesuai untuk digunakan sebagai substrat untuk enzim dari biakan B. licheniformis dibandingkan maltodekstrin yang dihasilkan dari substrat pati singkong, gembili, ubi jalar dan soluble starch.
Pembuatan dan analisis Kualitatif Isomaltooligosakarida
Hasil percobaan menunjukkan bahwa maltodekstrin substrat pati huwi dan ganyong secara fisik sulit untuk digunakan sebagai substrat pembuatan isomaltooligosakarida. Hal tersebut ditunjukkan dengan bentuk cairan yang lebih padat dibandingkan dengan substrat maltodekstrin yang dihasilkan dari pati singkong, sehingga untuk tahap penelitian selanjutnya dipakai substrat maltodekstrin dari pati singkong untuk mensintesis isomaltooligosakarida, tetapi juga dicoba menggunakan maltodekstrin dari substrat ganyong.
Hasil tersebut di atas menunjukkan bahwa isomaltooligosakarida dari maltodekstrin singkong secara fisik lebih encer dan jernih dibanding ganyong, untuk itu dalam percobaan reaksi transfer selanjutnya menggunakan isomaltooligosakarida dari maltodekstrin singkong.
Substrat berupa maltodekstrin hasil sintesis direaksikan dengan enzim glukoamilase dan diinkubasi pada suhu 40° C selama 3, 6 dan 24 jam. Pengujian dilakukan untuk mengetahui waktu optimum yang diperlukan enzim glukoamilase untuk merubah substrat maltodekstrin menjadi isomaltooligosakarida.
Hasil pengujian menunjukkan bahwa maltodekstrin yang diinkubasi selama 24 jam dapat membentuk
isomaltooligosakarida secara optimal, hal ini terlihat dari perubahan bentuk substrat maltodekstrin menjadi lebih encer dan ditandai dengan adanya noda yang lebih terpisah dibandingkan hasil inkubasi selama 3 dan 6 jam. Substrat isomaltooligosakarida hasil sintesis enzimatik selanjutnya digunakan sebagai substrat untuk reaksi transglikosilasi dan produk isomaltooligosakarida yang dihasilkan diuji secara kualitatif menggunakan kromatografi lapis tipis (Gambar 3).
Gambar 3 menunjukkan bahwa hasil kromatografi lapis tipis produk isomaltooligosakarida yang dihasilkan oleh biakan Aspergillus oryzae dengan menggunakan substrat maltodekstrin yang berasal dari pati singkong. Standar yang digunakan adalah isomaltooligosakarida komersil, maltosa dan glukosa. Identifikasi isomaltooligosakarida pada kromatografi lapis tipis ditunjukkan dengan adanya noda yang memiliki nilai Rf yang mendekati nilai Rf standar isomaltooligosakarida komersil yaitu 0,39, 0,28, 0,22, 0,19, 0,14.
Uji reaksi transglikosilasi
Gambar 4 dan gambar 5 menunjukkan hasil analisis KLT produk reaksi transglikosilasi menggunakan enzim amilase dan substrat isomaltooligosakarida menggunakan akseptor pirokatekol dan resorsinol. Hasil analisis menunjukkan bahwa enzim amilase dengan substrat isomaltooligosakarida yang diinkubasi pada 0 jam, 3 jam dan 6 jam belum menunjukkan terbentuknya produk transfer namun setelah dilakukan penambahan enzim glukoamilase, terlihat adanya produk transfer setelah diinkubasi selama 24 jam dan 48 jam.
Hasil reaksi transglikosilasi menunjukkan bahwa nilai Rf dari produk transfer pada akseptor pirokatekol (Gambar 4) dan resorsinol (Gambar 5) menghasilkan produk transfer pada Rf 0,71 (5 dan 6) dengan nilai Rf mendekati nilai Rf standar arbutin (1) yaitu 0,76. Arbutin adalah bentuk produk transfer berupa senyawa polifenol glikosida yang telah dipasarkan secara komersil.
Hasil analisis Kuantitatif Menggunakan HPLC
Berdasarkan hasil analisis kuantitatif dengan menggunakan HPLC menunjukkan bahwa produk transfer yang disintesis menggunakan akseptor resorsinol setelah diinkubasi selama 24 jam konsentrasinya 23,22 ppm dan diinkubasi 48 jam konsentrasinya 206,10 ppm. Hal ini menunjukkan bahwa hasil lebih tinggi dibandingkan produk transfer menggunakan akseptor pirokatekol meskipun campuran reaksi yang diinkubasikan selama 48 jam dengan konsentrasi 52,56 ppm.
Rahayu, Sulistyo dan Dinoto
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa maltodekstrin dapat dihasilkan secara enzimatik menggunakan enzim amilase (B.licheniformis) dari substrat pati singkong, pati huwi buah dan pati ganyong, sehingga isomaltooligosakarida dapat dihasilkan dari maltodekstrin sebagai substrat intermedier.
Hasil sintesis enzimatik substrat isomaltooligosakarida dengan akseptor polifenol dapat menghasilkan produk transfer Rf (0,71) mendekati standar arbutin yaitu Rf 0,76. Hasil analisis HPLC menunjukkan bahwa produk reaksi transfer dapat disintesis dari substrat isomaltooligosakarida dengan akseptor resorsinol maupun pirokatekol sebesar 23,22 ppm hingga 206,10 ppm setelah inkubasi berlangsung selama 24 jam hingga 48 jam.
KEPUstaKaaN
Atmana E, Widjayanti & Sumaryanto, 1992. Produksi Enzim Amiloglukosidase menggunakan Endomycopsis sp. dengan Alginat sehingga Matriks Imobilisasi. Dalam: Soetisna, U.B. Tappa dan E. Sukara (eds.). Bioteknologi untuk Menunjang Pembangunan Nasional. Pusat Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bogor.
Blazek-Welsh AI & Rhodes DG, 2001. Maltodextrin-based Proniosome. AAPS Pharmaceutical Sciences 3(1): 1–8
Funayama M, Arakawa H, Yamamoto R, Nishino T, Shin T, & Murao S, 1993. A new microorganism producing a glucosyl transfer enzyme to polyphenols. J Bioschi Biotect Biochem 58: 817–821.
Griffin VK & Brooks JR, 1989. Production and Size Distribution of Rice Maltodekstrin Hydrolized from Milled Rice Flour Using Heat Stable Alpha Amilase. Journal of Food Science.
Handayani R & J Sulistyo, 2008. Sintesis Senyawa Flavonoid-α-Glikosida secara Reaksi Transglikosilasi Enzimatik dan Aktivitasnya sebagai Antioksidan. J. Biodiversitas. 9(1): 1–4.
Kitao S, Ariga T, Sekine H, & Takano M, 1993. α-D-glucosyl transfer to phenolic compounds by sucrose phosphorylase from Leuconostoc mesentereides and production of α-arbutin. J Biosch Biotech Biochem 58: 38–42.
Kometami T, Terada Y, Nishimura T, Nakae T, Takii H & �kada S, 1996. Acceptor Specificity of Cyclodextrin Glucanotransferase from Alkalophilic Bacillus Species and Synthesis of Glycoscosyl Rhamnose., Biosci., Biotech Biochem.60(7): 1176–1178.
Shofiyanto ME, 2008. Maltodekstrin Produk Berpotensi di Indonesia. http://elovan.blogspot.com/2008/01/ maltodekstrin-produkberpotensi.html.16 Agustus 2008 Pukul 08.50 WIB.
Sulistyo J, Soeka YS and Karim AK, 1998. Sintesis Polifenol α-glukosida oleh CGT ase secara reaksi Transglikosilasi-glukosida oleh CGT ase secara reaksi Transglikosilasi., Biol. Indo. 2(3): 150–161.
