UJI BIOLOGIS CONDITIONED MEDIUM SEL LEYDIG
TERHADAP DIFERENSIASI STEM CELL MESENKIMAL
SUMSUM TULANG TIKUS DEWASA
ABSTRAK
Terapi menggunakan stem cell mesenkimal sumsum tulang telah banyak dilakukan pada penyakit degeneratif. Conditioned medium (CM) dari beberapa jenis kultur sel diperkirakan mengandung berbagai bahan bioaktif yang disekresikan secara in vitro sudah diuji terhadap transdiferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang. Penelitian ini dilakukan untuk menguji CM sel Leydig terhadap diferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang. Conditioned medium dikoleksi dari kultur sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz masing-masing sebanyak 1x 106 sel/ml setelah dikultur di dalam medium: 1) DMEM + NBCS 10% (M) sebagai kontrol; 2) dengan hCG 2.5 IU/ml; 3) dengan insulin 5 μg/ml, transferrin 10 μg/ml, Selenium 5 μg/ml (ITS) serta 4) hCG dan ITS. Setelah dikultur selama tiga hari, medium dari masing-masing perlakuan diganti dengan medium DMEM tanpa serum dengan perlakuan yang sama. Conditioned medium dikoleksi pada tiga hari kemudian dan disimpan dalam temperatur -20o C. Setelah dianalisis, CM yang diperoleh dari perlakuan hCG+ITS ditetapkan untuk digunakan sebagai medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang tikus. Masing-masing sebanyak 1x 106 sel/ml stem cell mesenkimal sumsum tulang dikultur di dalam medium: 1) DMEM+ NBCS 10% sebagai kontrol ; 2) dengan testosteron 10 ng/ml; 3) dengan CM sel Leydig 50% ; 4) dengan CM sel Leydig 50% dan hCG 2.5 IU/ml. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan hCG+ITS pada CM sel Leydig meningkatkan konsentrasi testosteron (0,71 ng/ml) dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Perlakuan yang sama juga meningkatkan konsentrasi protein (985,29µg/ml) yang terdapat di dalam CM dibandingkan dengan perlakuan lainnya (p<0,05). Pita protein yang dihasilkan mempunyai berat molekul (BM) mendekati 29 kDA, 62-70 kDa dan 95-130 kDa. Stem cell mesenkimal sumsum tulang yang dikultur dengan CM sel Leydig bereaksi positif terhadap pewarnaan spesifik 3β-HSD menghasilkan sel Leydig (53,2%), testosteron (0,93 ng/ml) dan protein (1251,94 μg/ml). Penambahan hCG ke dalam CM sel Leydig mampu meningkatkan konsentrasi testosteron (10,22 ng/ml) (p<0,05) dibandingkan dengan tanpa hCG. Dapat disimpulkan bahwa CM sel Leydig mampu mengarahkan stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel Leydig. Penambahan hCG ke dalam CM sel Leydig yang digunakan sebagai medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang meningkatkan perolehan sel Leydig dan testosteron yang disekresikan.
Kata kunci : conditioned medium, sel Leydig, stem cell mesenkimal, sumsum tulang, tikus, testosteron
ABSTRACT
Bone marrow mesenchymal stem cells theraphy have been carried out on degenerative diseases. Conditioned medium (CM) from several types of cultured cells contain of bioactive materials secreted in vitro. In this study were used Leydig cells conditioned medium to evaluate the ability differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Conditioned medium was collected from culture of 1x 106 cells/ml with 4 treatments, respectively: 1) DMEM supplemented with 10 % NBCS (M) as control ; 2) M supplemented with 2.5 IU/ml hCG ; 3) M supplemented with 5 µg/ml insulin, 10 µg/ml transferrin, 5 mg/ml Selenium (ITS) and 4) M supplemented with the combination of hCG and ITS. Each culture medium treatment was replaced after 3 days using DMEM without serum. Conditioned medium were collected 3 days later and analyzed for testosterone and protein concentration. The best result of treatment above was used for culture medium of bone marrow mesenchymal stem cells. The 1x 106 cells/ml bone marrow mesenchymal stem cells cultured in : 1) DMEM supplemented with 10% NBCS as control (M) , 2) M supplemented with 10 ng/ml testosterone; 3) M supplemented with 50% Leydig cells CM; 4) M supplemented with 50% Leydig cells CM and 2.5 IU/ml hCG respectively. The result showed that Leydig cells CM from combination of hCG and ITS had higher testosterone concentration (0.71 ng/ml) compared to ITS (0.69 ng/ml), hCG (0.68 ng/ml) and control (0.56 ng/ml). The similar result also showed on protein concentration. Leydig cells CM had three protein bands with molecular weight (29 kDa, 62-70 kDa and 95-130 kDa). Bone marrow mesenchymal stem cells cultured with Leydig cells CM has positive reaction to 3β-HSD specific stained for Leydig cells (53.2%) and produced testosterone (0.93 ng/ml). Supplementation of hCG to Leydig cell CM have an ability to increase testosterone production (10.22 ng/ml) and the positive number cells of Leydig cells (71.9% ) (p<0.05) compared without hCG. It can be concluded that Leydig cells conditioned medium can support differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells to Leydig cells.
Keywords : conditioned medium, Leydig cells , mesenchymal stem cells, bone marrow, rat, testosterone
PENDAHULUAN
Stem cell adalah sel yang terdapat dalam tubuh dan memiliki beberapa karakteristik yang cukup unik karena sel tersebut belum berdiferensiasi dan memiliki fungsi khusus, serta mampu memperbanyak diri sendiri menghasilkan sel yang sama dengan sel induknya (self renewal). Stem cell dapat berdiferensiasi
menjadi lebih dari satu jenis sel (multipoten atau pluripoten). Berdasarkan sumbernya, dapat digolongkan menjadi stem cell embrionik dan stem cell dewasa (Prentice 2003). Stem cell dewasa merupakan sel yang belum berdiferensiasi pada jaringan dan bersifat multipoten. Dapat ditemukan pada sumsum tulang, otak, pembuluh darah perifer, gastrointestinal, folikel rambut, hati, pankreas, jantung, kornea, retina, lemak dan otot skeletal. Sel tersebut berfungsi dalam memelihara dan memperbaiki kerusakan jaringan secara in vivo (Prentice 2003). Jika dibandingkan dengan stem cell embrionik, kemampuan berdiferensiasi stem cell dewasa lebih terbatas karena hanya mampu berdiferensiasi menjadi beberapa jenis sel saja serta hanya ditemukan dalam jumlah yang sedikit. Sejak dilaporkannya beberapa penelitian yang menyatakan bahwa stem cell dewasa mampu melakukan transdiferensiasi, maka harapan penggunaan stem cell dewasa khususnya stem cell mesenkimal dari sumsum tulang sebagai terapi alternatif penyakit degeneratif menjadi lebih besar. Penggunaan stem cell dewasa merupakan alternatif untuk mengatasi kendala etika penggunaan stem cell embrionik pada manusia.
Transdiferensiasi adalah perubahan sel yang irreversible dari suatu sel tertentu menjadi jenis sel lainnya (Eguizabal et al. 2013). Stem cell mesenkimal mampu berdiferensiasi menjadi sel saraf atau stem cell hematopoietik yang berdiferensiasi menjadi sel jantung merupakan contoh dari transdiferensiasi stem cell (Halim et al. 2010). Induksi transdiferensiasi stem cell mesenkimal secara langsung dari satu galur mesenkimal menjadi galur yang lain dapat dilakukan dengan mengubah faktor lingkungan mikro (Song & Tuan 2004). Stem cell mesenkimal juga mempunyai kemampuan berdiferensiasi menjadi sel yang spesifik jika dikombinasikan dengan bahan bioaktif dan stimulus diferensiasi tertentu (Caplan & Bruder 2001). Selain itu, transdiferensiasi secara in vivo juga dipengaruhi oleh lingkungan mikro dari jaringan (Phinney & Prockop 2007).
Sel yang dikultur secara in vitro mampu mensekresikan berbagai bahan bioaktif yang bermanfaat bagi pertumbuhan sel dalam kultur. Bahan bioaktif yang dihasilkan di antaranya adalah faktor pertumbuhan (growth factor, GF) dan produk lain yang diperlukan dalam perkembangan sel di dalam kultur. Conditioned medium (CM) adalah medium yang telah digunakan untuk mengkultur sel dan diperkirakan mengandung bahan bioaktif yang dihasilkan oleh kultur sel atau jaringan. Media tersebut dapat digunakan untuk menumbuhkan jenis sel yang sama ataupun yang berbeda. Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengetahui peranan faktor-faktor yang terdapat dalam CM dengan menggunakan stem cell mesenkimal sumsum tulang. Penggunaan CM kultur sel saraf untuk mengkultur stem cell mesenkimal sumsum tulang secara in vitro mampu mengarahkan sel tersebut berdiferensiasi menjadi sel saraf (Djuwita et al. 2010). Diferensiasi sel saraf pada stem cell mesenkimal tikus dan manusia juga dapat diinduksi oleh DMSO, β-mercapto-ethanol atau butylated hydroxyanisole (Woodbury et al. 2000)
Sel Leydig pada tikus dewasa bukan berasal dari sel Leydig fetus tetapi berasal dari sel prekursor yang belum berdiferensiasi (Habert 2001). Progenitor sel Leydig diduga merupakan sel mesenkim karena mempunyai morfologi seperti sel yang terdapat pada jaringan ikat yang berasal dari mesoderm embrio (Hardy et al. 1991 ) dan sel tersebut disebut sebagai stem cell mesenkimal (Ariyaratne et al. 2000). Sel Leydig terutama menghasilkan hormon testosteron, tetapi juga
mensekresikan berbagai bahan bioaktif seperti peptida, Interleukin-1 (IL-1) dan Interleukin- 6 (IL-6) (Chemes et al. 1992, Cudicini et al. 1997) ke dalam medium kulturnya. Sel Leydig diketahui juga mensekresikan beberapa faktor pertumbuhan seperti: Insulin-like Growth Factor I (IGF-I), Transforming Growth Factor-β (TGF-β), Epidermal Growth Factor (EGF), Fibroblast Growth Factor (FGF), Platelet-derived Growth Factor –A (PDGF-A) dan lainnya (Mendis-Handagama & Ariyaratne 2001, Saez 1994, Avallet et al. 1991). Yazawa et al. (2006) telah melaporkan bahwa stem cell mesenkimal sumsum tulang dapat berdiferensiasi secara in vivo menjadi sel Leydig ketika ditransplantasikan ke dalam testis. Hasil tersebut menunjukkan bahwa stem cell mesenkimal rodentia mempunyai kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi sel steroidogenik yang serupa dengan sel Leydig.
Pengarahan stem cell mesenkimal menjadi sel Leydig diharapkan dapat menjadi alternatif penyediaan sumber sel Leydig untuk transplantasi dan dapat menggantikan terapi testosteron sintetis yang umum dilakukan pada pria lanjut usia atau pada pasien penyakit hipogonadism. Terapi sel tersebut diharapkan dapat menghindari efek samping akibat pemberian testosteron sintetis dalam jangka waktu yang lama. Sun et al. (2009) menyimpulkan bahwa transplantasi sel Leydig dewasa pada tikus dengan penyakit hipogonadism dan dilakukan pada saat pra-pubertas mempunyai potensi terapeutik. Pengarahan sel dipengaruhi oleh kondisi lingkungan mikro stem cell mesenkimal tersebut, conditioned medium sel Leydig diduga menghasilkan bahan bioaktif yang dapat mendukung diferensiasi sel progenitor menjadi sel Leydig. Apabila pasien dalam kondisi hanya memiliki sel progenitor sel Leydig dalam jumlah yang sedikit di dalam testisnya maka kemungkinan penggunaan stem cell mesenkimal sebagai stem cell pengganti untuk menghasilkan sel Leydig perlu diketahui. Tujuan penelitian ini adalah menguji kemampuan sekreta yang dihasilkan CM sel Leydig untuk mengarahkan transdiferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel Leydig.
MATERI DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Embriologi, Bagian Anatomi, Histologi dan Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi; di Laboratorium Hormon, Unit Rehabilitasi Reproduksi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB dan di Laboratorium Reproduksi dan Kultur Sel Hewan, Puslit Bioteknologi LIPI mulai dari Desember 2012 sampai Agustus 2013.
Materi Penelitian
Suspensi stem cell mesenkimal sumsum tulang dikoleksi dari 3 ekor tikus (Sprague Dawley) jantan dewasa berumur 8-10 minggu yang diperoleh dari Fakultas Peternakan IPB. Penyediaan conditioned medium sel Leydig dilakukan dengan mengkultur sel Leydig yang dipurifikasi dari testis yang diambil dari 3 ekor tikus jantan dewasa. Perlakuan terhadap hewan percobaan pada penelitian ini telah dilakukan dengan mengikuti kaidah ilmiah terstandar dengan memperhatikan prinsip-prinsip kesejahteraan hewan.
Metode Penelitian
Tahapan kegiatan dalam penelitian ini adalah :
1. Kultur Sel Leydig Hasil Purifikasi dengan Gradien Nycodenz 2. Analisis Kandungan Testosteron dan Protein dari CM Sel Leydig 3. Isolasi Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang
4. Kultur In Vitro Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang dengan CM Sel Leydig
5. Analisis Kandungan Testosteron dan Protein dari Medium Kultur Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang Setelah Dikultur dengan CM Sel Leydig
Kultur Sel Leydig Hasil Purifikasi dengan GradienNycodenz
Tikus (Sprague Dawley) jantan dewasa berumur 8-10 minggu diambil testisnya setelah dibius dan dikorbankan dengan cara cervical dislocation. Selaput tunika albuginea dan jaringan ikat lainnya dibuang, kemudian jaringan testis ditempatkan di dalam cawan petri berisi medium Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline (DPBS) tanpa Ca dan Mg (Gibco, 21600-010, Invitrogen, NY, USA). Jaringan tersebut kemudian dicuci sebanyak tiga kali menggunakan medium DPBS yang ditambah Newborn Calf Serum 0.1% (NBCS, Gibco, 16010-159, Invitrogen, New Zealand, DPBS). Pengambilan jaringan testis dilakukan secara aseptis kemudian dimasukkan ke dalam tabung yang berisi satu ml collagenase type I (Sigma, C0130,St Louis, MO, USA) 0.04% dan trypsin inhibitor (Sigma, T9003, St Louis, MO, USA) 10 µg/ml dalam DPBS. Jaringan diinkubasi di dalam waterbath (Eyela SB-24) pada suhu 34 o C selama 40 menit. Suspensi sel diencerkan sebanyak empat kali volume awal dengan medium DPBS, kemudian didiamkan selama dua menit agar sel mengendap. Cairan
supernatan dikoleksi dan disentrifugasi dengan kecepatan 200 g selama tiga menit. Pelet sel dicuci sebanyak dua kali menggunakan medium DPBS dengan cara yang sama. Terakhir, pelet sel diencerkan dengan 500 µl medium DPBS.
Isolasi dan purifikasi sel Leydig dilakukan dengan menggunakan metode gradien Nycodenz. Pelet sel yang telah diencerkan kemudian dimasukkan ke dalam larutan Nycodenz dengan gradien 4%, 8%, 10%, 12%, 15%. Setelah itu, larutan gradien disentrifugasi menggunakan sentrifus swing rotor (Kokusan H-26F) dengan kecepatan 1500 g selama 10 menit pada suhu ruang. Lapisan sel yang terbentuk kemudian dikoleksi dan dicuci berturut-turut dengan DPBS sebanyak empat kali dan medium DMEM (Sigma, D5532, St Louis, MO, USA) yang ditambah NBCS 10% sebanyak satu kali dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 200 g selama tiga menit. Pelet sel diencerkan dengan 500 µl medium DMEM, kemudian dilakukan penghitungan konsentrasi sel dengan menggunakan hemositometer Neubauer.
Sel Leydig sebanyak 1 x 106 sel/ml ditempatkan dalam cawan petri (Corning, 430165, NY USA) berukuran 35 x 10 mm dengan perlakuan medium DMEM yang ditambah dengan 10% NBCS (M) sebagai kontrol (1); dengan 2.5 IU/ml hCG (Chorulon, Intervet, EU) (2); dengan 5 μg/ml insulin, 10 μg/ml transferrin, 5 μg/ml Se (ITS, Sigma I3146, St Louis, MO,USA) (3) serta hCG dan ITS (4) kemudian dikultur dalam inkubator 5% CO2 (Sanyo, MCO-95, Japan) dengan temperatur 37 C. Setelah dikultur selama tiga hari, medium diganti menggunakan medium DMEM tanpa penambahan serum. Pada hari ke-3, conditioned medium (CM) kemudian dikoleksi dan disterilkan dengan filter syringe (MS®CA)0,22 µm. Medium tersebut disimpan pada temperatur -200 C untuk pengujian ELISA, SDS PAGE dan spektrofotometer.
Analisis Kandungan Testosteron dan Protein dari CM Sel Leydig
Konsentrasi testosteron dari CM sel Leydig kemudian diukur menggunakan kit Testosteron ELISA (DRG Diagnostic EIA 1559). Hasil dianalisis dengan menggunakan alat ELISA reader Biotek EL 808.
Analisis kandungan protein di dalam CM sel Leydig dilakukan dengan metode SDS PAGE menggunakan gel Poliakrilamid 12%, kemudian masing-masing sebanyak 10 µl sampel CM sel Leydig sesuai perlakuan dimasukkan ke dalam sumur gel setelah dicampurkan dengan loading buffer dengan perbandingan 1 : 2. Disamping itu, dimasukkan pula larutan ukuran baku protein sebagai marker (kontrol positif) Chromatein Prestained Protein Ladder (PR- 0602 Vivantis). Alat elektroforesis (SCIE-PLAS) dijalankan dengan kuat arus listrik 30mA, tegangan 140 V(Consort EU 261) selama 3 jam. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses visualisasi protein dengan metode pewarnaan Coomassie Brilliant Blue (Phast GelTM Blue-R, Pharmacia 17-0518-01). Analisis hasil dilakukan secara deskriptif terhadap perbedaan berat molekul protein yang dihasilkan dari pita-pita pada masing-masing CM sel Leydig perlakuan dibandingkan dengan berat molekul protein standar (marker) yang digunakan.
Konsentrasi protein di dalam CM sel Leydig diukur dengan menggunakan alat UV spectrophotometer Shimadzu UV-1800 dengan menggunakan software UV Probe 2.42. Masing-masing sampel sebanyak 60 μl ditambahkan dengan 940 μl Protein Assay Dye Reagent (reagen Bradford, BioRad 500-0006), kemudian dimasukkan di dalam cuvet dan dilakukan pembacaan absorbansi pada panjang gelombang 595 nm. Hasil pembacaan dikoreksi dengan menggunakan kurva standar linier BSA 0 μg/ml sampai 1500 μg/ml yang telah dibuat sebelumnya. Isolasi Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang
Sumsum tulang (bone marrow) diisolasi dari tulang femur tikus jantan dewasa Sprague Dawley berumur 8-10 minggu. Tulang tibia atau femur dibersihkan dari jaringan dan darah, kemudian pada kedua ujung pangkal dilakukan pemotongan tulang rawan. Bagian stroma tulang dibilas dengan tiga ml medium DPBS dengan menggunakan syringe satu ml dengan jarum 26G. Bilasan ditampung dalam cawan petri kaca yang steril kemudian dihomogenkan dengan mikropipet 1000 µl. Setelah homogen, suspensi dimasukkan ke dalam tabung 15 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 200 g selama 10 menit. Setelah supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan tiga ml medium DPBS dan disentrifugasi ulang. Pencucian dilakukan masing-masing sebanyak dua kali menggunakan medium DPBS dan satu kali dengan medium kultur DMEM. Kemudian pelet sel diresuspensi dengan 1000 µl medium kultur DMEM.
Kultur In Vitro Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang dengan CM Sel Leydig
Setelah dilakukan penghitungan konsentrasi sel, sebanyak 1 x 106 sel/ml stem cell mesenkimal sumsum tulang dikultur ke dalam cawan petri yang berisi medium kultur DMEM yang ditambah NBCS 10%. Pada cawan petri lainnya diberi gelas cover steril untuk pengamatan morfologi sel. Setelah 24 jam, stem cell mesenkimal sumsum tulang dikultur dengan perlakuan medium: 1) DMEM ditambahkan NBCS 10%; 2) dengan testosteron 10 ng/ml (Nacalay Tesque 32811-61 Kyoto, Japan); 3) dengan CM Leydig 50%; 4) dengan CM Leydig 50% dan hCG 2.5 IU/ml. Conditioned medium sel Leydig yang digunakan untuk mengkultur stem cell mesenkimal diperoleh dari perlakuan DMEM+hCG+ITS. Cawan petri dikultur di dalam inkubator CO2 5% pada temperatur 37oC. Penggantian media dilakukan setiap 48 jam dan kultur dilakukan sampai hari ke-10. Parameter yang diamati adalah morfologi sel yang tumbuh dalam kultur dan pewarnaan histokimia spesifik 3β-HSD untuk mendeteksi sel Leydig. Analisis data dilakukan secara deskriptif terhadap perubahan morfologi sel yang terjadi. Medium kultur kemudian dikoleksi, disterilisasi dengan filter syringe serta disimpan pada temperatur -20o C untuk dilakukan pengujian ELISA dan spektrofotometer.
Analisis Kandungan Testosteron dan Protein dari Medium Kultur Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang Setelah Dikultur dengan CM Sel Leydig
Medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang perlakuan di atas kemudian dikoleksi dan digunakan untuk dilakukan pengukuran konsentrasi testosteron menggunakan kit Testosteron ELISA (DRG Diagnostic EIA 1559).
Pengukuran konsentrasi protein dengan menggunakan alat UV spectrophotometer Shimadzu UV-1800 dengan menggunakan software UV Probe 2.42.
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Kultur sel Leydig dilakukan sebanyak tiga kali ulangan untuk setiap perlakuan. Conditioned medium dikoleksi dari masing-masing perlakuan untuk dilakukan analisis testosteron, protein dan SDS PAGE. Data yang diperoleh kemudian diuji secara statistik dengan uji ANOVA dengan tingkat kepercayaan 95% dan uji lanjut Duncan. Hasil SDS PAGE dianalisis secara deskriptif. Conditioned medium terpilih yaitu hasil perlakuan penambahan hCG dan ITS kemudian diperbanyak untuk digunakan pada penelitian selanjutnya.
Kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang dilakukan sebanyak tiga kali ulangan untuk setiap perlakuan. Parameter yang diamati adalah morfologi sel dan reaksi terhadap pewarnaan histokimia 3β-HSD. Analisis kandungan testosteron dan protein dilakukan dari setiap perlakuan dengan tiga kali ulangan. Data yang diperoleh kemudian diuji secara statistik dengan uji ANOVA dengan tingkat kepercayaan 95% dan uji lanjut Duncan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis CM Sel Leydig
Conditioned medium (CM) sel Leydig dari empat perlakuan menghasilkan konsentrasi testoteron sebesar 0,56 sampai 0,71 ng/ml. Penambahan hCG dan ITS menghasilkan testosteron yang lebih banyak dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Penambahan hCG (601,66µg/ml), ITS (572,08 µg/ml) maupun hCG+ITS (985,29 µg/ml) meningkatkan konsentrasi protein di dalam conditioned medium sel Leydig dibandingkan dengan kontrol (436,92 µg/ml) (p<0,05) Tabel 8.
Tabel 8. Analisis konsentrasi testosteron dan protein dari conditioned medium sel Leydig
Conditioned medium sel Leydig dari perlakuan:
Testoteron (ng/ml) Protein
(μg/ml)
DMEM+ NBCS 10% 0,56 436,92 a
DMEM+ hCG 2.5 IU/ml 0.68 601,66 b
DMEM+ ITS (insulin 5 μg/ml, transferrin,
10 μg/ml,Se 5 μg/ml) 0.69 572,08
c
DMEM+hCG+ITS 0.71 985,29 d
Keterangan : Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) dengan uji statistik Duncan.
Hasil analisis protein dengan SDS PAGE terhadap CM sel Leydig ditampilkan pada Gambar 5. Conditioned medium sel Leydig pada penelitian ini menghasilkan pita protein antara berat molekul (BM) mendekati 29 kDa, 62–70 kDa dan 95-130 kDa.
Gambar 5. Hasil analisis SDS PAGE terhadap conditioned medium kultur sel Leydig
Sel Leydig merupakan sel yang memproduksi hormon testosteron di dalam tubuh hewan jantan. Berdasarkan penelitian sebelumnya, perlakuan kultur sel Leydig dengan medium DMEM yang ditambahkan dengan serum, ITS dan hCG menghasilkan konsentrasi testosteron yang paling tinggi sebesar 5,25 ng/ml (Kaiin et al 2013). Pada penelitian ini, kandungan testosteron dari conditioned medium (CM) kultur sel Leydig yang diberi perlakuan hCG dan ITS juga menunjukkan konsentrasi testoteron yang lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Bilinska et al (2009) menyatakan bahwa sel Leydig manusia hasil pemurnian dengan Percol secara in vitro menghasilkan testosteron sebanyak 5,76 ng/106 sel dalam waktu 24 jam dan dengan penambahan hCG mampu meningkatkan produksi testosteron menjadi 9,83 ng/106 sel Pada penelitian lain, sel Leydig yang dikultur secara in vitro menghasilkan testosteron
sebesar 3,5 ng/106 sel, dan dengan penambahan hCG di dalam medium menghasilkan testosteron sebesar 4,5ng/106 sel ( Risbridger et al. 1981).
Protein dengan BM mendekati 29 kDa pada CM kultur sel Leydig diperkirakan adalah Interleukin 1 (IL-1). Menurut Saez (1994), IL-1 memiliki berat molekul yang bervariasi antara 10-30 kDa. Protein lainnya yang terdeteksi berdasarkan SDS PAGE memiliki BM yang cukup besar yaitu antara 62- 70 kDa dan 95-130 kDa. Lakshmanan et al. (1990) menemukan EGF yang dideteksi dari urin mencit dewasa mempunyai berat molekul 66 dan 56 kDa, sedangkan pro-EGF mempunyai berat molekul 165 kDa. TGF-β merupakan famili dari polipeptida berukuran 25 kDa yang terdistribusi dan disintesis oleh sel yang berbeda-beda (Lawrence 1995 dalam Kropf et al. 1997), pada penelitian ini tidak ditemukan protein dengan berat molekul tersebut. Di dalam testis, EGF berfungsi untuk menstimulasi sintesis androgen, demikian juga hal yang sama terjadi pada kondisi in vitro (Suarez-Quian & Niklinski 1990). PDGF-A merupakan faktor penting dalam proses diferensiasi sel Leydig, tetapi bagaimana mekanismenya belum banyak diketahui (Mendis-Handagama & Ariyaratne 2001). Selain faktor pertumbuhan tersebut masih banyak faktor lain yang disekresikan oleh sel Leydig seperti: Corticotropin-releasing factor (CRF), Arginin-vasopressin (AVP), oxytocin (OT), Angiotensin-II (A-II) dan peptida lainnya (Saez 1994). Diperlukan penelitian lanjutan untuk menentukan protein yang dihasilkan dalam gambaran hasil SDS PAGE pada penelitian ini.
Uji Biologis CM Sel Leydig Terhadap Kultur Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang
Transdiferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang diuji dengan menggunakan CM sel Leydig. Hasil menunjukkan bahwa stem cell mesenkimal yang dikultur dengan CM sel Leydig bereaksi positif dengan pewarnaan histokimia spesifik 3β-HSD untuk mendeteksi sel Leydig (Gambar 6c), menghasilkan sel Leydig sebesar 53,2 % dan hasil tersebut lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol (4,5%) maupun DMEM yang ditambahkan testosteron (20,5%) (p<0,05). Penambahan hCG ke dalam CM sel Leydig meningkatkan perolehan sel Leydig (71,9%) (p<0,05). Perlakuan CM Leydig menghasilkan testosteron dan protein di dalam medium kultur stem cell mesenkimal (Tabel 9). Penambahan hCG ke dalam CM sel Leydig meningkatkan konsentrasi testosteron (10,22 ng/ml) (p<0,05) dibandingkan dengan kontrol (2,01 ng/ml) dan CM Leydig saja (0,93 ng/ml). Penambahan testosteron ke dalam medium kultur juga menghasilkan sel yang positif terhadap pewarnaan 3β-HSD (Gambar 6b).
Tabel 9. Kultur in vitro stem cell mesenkimal sumsum tulang dengan perlakuan conditioned medium kultur sel Leydig serta analisis konsentrasi testosteron dan protein di dalam medium kultur.
Perlakuan Pewarnaan 3 β-HSD Sel Leydig (%) Testoteron (ng/ml) Protein (μg/ml) DMEM + NBCS 10% +/- 4,5a 2.01 a 1770,29 a DMEM+testosteron10 ng/ml ++ 20,5b 4.85 a 1285,39 b DMEM+ CML50% +++ 53,2c 0.93 a 1251,94 c DMEM+CML50%+ hCG2.5 IU/ml +++ 71,9d 10.22b 799,01d
Keterangan : Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) dengan uji lanjut Duncan.
Gambar 6. Kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang tikus yang diwarnai dengan pewarnaan histokimia spesifik 3β-HSD. Keterangan : a. DMEM+ NBCS 10%; b.DMEM+testosteron 10 ng/ml; c. DMEM+ CM Leydig 50%; d. DMEM+CM Leydig 50%+ hCG 2.5 IU/ml. Skala = 20 µm
Berdasarkan pengamatan morfologi sel, tampak ada perbedaan morfologi sel dari ketiga perlakuan (Gambar 7 b,c,d) dibandingkan dengan kontrol (Gambar 7a). Stem cell mesenkimal yang dikultur dengan CM kultur sel Leydig menghasilkan morfologi sel yang memiliki penjuluran yang lebih banyak dibandingkan dengan kultur stem cell mesenkimal tanpa perlakuan. Karakterisasi stem cell mesenkimal dapat dilakukan berdasarkan molekul protein permukaan (Cluster of Differentiation, CD) dan terdapat beberapa molekul protein permukaan pada stem cell mesenkimal di antaranya adalah CD73, CD90 dan CD105 (Halim et al. 2010). Transdiferensiasi stem cell mesenkimal menjadi sel Leydig akan menyebabkan terjadinya perubahan pada molekul protein permukaan.
Gambar 7. Morfologi stem cell mesenkimal sumsum tulang yang dikultur secara in vitro. Keterangan : a.DMEM+NBCS 10%; b. DMEM+ testosteron 10 ng/ml; c. DMEM+ CM Leydig 50%; d.DMEM+CM Leydig 50% +hCG 2.5 IU/ml hCG. Skala= 10 µm. Keterangan: menunjukkan penjuluran sel
Kemampuan stem cell mesenkimal sumsum tulang mengalami transdiferensiasi menjadi sel Leydig pada penelitian ini dilakukan berdasarkan bahwa sel Leydig dewasa berasal dari stem cell mesenkimal yang merupakan galur sel Leydig di dalam testis karena sel tersebut dapat mengekspresikan beberapa marker spesifik seperti 3β-HSD, reseptor LH dan produksi androgen (Ariyaratne et al. 2000). Menurut Djuwita et al. (2010), stem cell mesenkimal sumsum tulang yang dikultur selama 24 jam morfologi selnya berbentuk poligonal dan berbentuk seperti fibroblas (fibroblast-like cell). Hal yang sama terjadi pada kelompok kontrol (Gambar 7 a). Pada penelitian ini, kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang yang dikultur dengan CM kultur sel Leydig menunjukkan perbedaan morfologi sel yaitu lebih banyak juluran pada selnya (Gambar 7 c,d) dan setelah diidentifikasi dengan pewarnaan spesifik 3 β – HSD menghasilkan reaksi yang positif (Gambar 6 c,d). Mendis-Handagama & Ariyaratne (2001) menyatakan bahwa pewarna spesifik 3 β – HSD positif pada galur sel Leydig dimulai dari progenitor sel sampai sel Leydig dewasa. Pewarna tersebut akan negatif jika sel masih dalam tahap stem cell mesenkimal. Perubahan morfologi stem cell mesenkimal sumsum tulang tersebut kemungkinan merupakan proses transdiferensiasi menjadi sel Leydig. Transdiferensiasi sangat dipengaruhi oleh lingkungan mikro di sekitar sel, dengan adanya CM kultur sel Leydig di dalam medium yang memiliki kandungan bahan bioaktif seperti testosteron, faktor pertumbuhan dan protein yang disekresikan oleh sel Leydig menciptakan kondisi lingkungan untuk mendukung transdiferensiasi sel Leydig dari stem cell mesenkimal yang dikultur. Sifat stem cell mesenkimal yang multipoten dan didukung oleh lingkungan mikronya kemungkinan mengakibatkan terjadinya proses tersebut. Penelitian Wu et al. (2012) yang mengkultur stem cell sumsum tulang manusia dengan medium yang mengandung, LH, hCG, IL-1α dan PDGF menghasilkan sel yang bertransdiferensiasi menjadi sel steroidogenik (sel Leydig)
secara in vitro. Hasil tersebut mendukung penelitian ini karena diduga di dalam CM sel Leydig mengandung kedua faktor pertumbuhan tersebut, sehingga dapat menginduksi stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel Leydig yang dapat mensekresikan testosteron.
Androgen berperan dalam diferensiasi sel Leydig Rodentia (Habert et al. 2001), demikian juga proses diferensiasi progenitor sel Leydig menjadi sel Leydig dewasa secara in vitro dipengaruhi oleh LH dan dihidrotestosteron (Mendis-Handagama & Ariyaratne 2001). Chemes et al. (1992) menyatakan bahwa stem cell mesenkimal dari pasien yang awalnya tidak sensitif terhadap androgen, jika dikultur dalam medium dengan penambahan hCG akan berdiferensiasi dan memproduksi testosteron, selain itu jumlah testosteron yang disekresikan oleh sel prekursor mesenkimal lebih rendah dibandingkan dengan kultur sel Leydig tikus dan manusia. Aktivitas 3 β- HSD dan produksi testosteron meningkat ketika hCG ditambahkan ke dalam medium kultur. Hal tersebut terjadi karena penambahan LH atau hCG diperlukan dalam proses perbanyakan dan diferensiasi sel Leydig (Saez 1994). Penambahan hCG pada medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang dengan perlakuan CM sel Leydig menghasilkan testosteron dengan konsentrasi tertinggi dibandingkan dengan perlakuan lain dan kontrol, tetapi menghasilkan konsentrasi protein yang lebih rendah. Hasil tersebut kemungkinan disebabkan adanya hCG yang menginduksi sel Leydig untuk lebih banyak mensekresikan testosteron daripada protein (Tabel 9).
Pada penelitian ini, kultur stem cell mesenkimal yang dikultur dengan medium mengandung testosteron juga menghasilkan sel yang bereaksi positif (20,5 %) terhadap pewarnaan 3 β-HSD. Terjadi peningkatan testosteron sebesar 4,85 ng/ml dibandingkan dengan yang ditambahkan ke dalam medium yaitu sebesar 10 ng/ml. Hasil ini membuktikankan bahwa androgen (testosteron) juga dapat berperan dalam proses diferensiasi stem cell mesenkimal menjadi sel Leydig.
Penambahan serum dilakukan sebagai tambahan nutrisi seperti asam lemak esensial dan kolesterol serta beberapa faktor seperti : IGF, EGF dan protein lainnya. Seedelar & Isaacs (2009) melaporkan bahwa terdapat kandungan testosteron di dalam bovine serum sebesar 1,2 -7,5 ng/ml terutama pada serum yang dikoleksi pada saat setelah kelahiran sampai umur 1 tahun. Penemuan sel (4,5%) yang bereaksi positif terhadap 3 β- HSD di dalam kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang pada kelompok kontrol kemungkinan disebabkan adanya hormon testosteron atau faktor lainnya di dalam serum yang digunakan.
SIMPULAN
1. Conditioned medium kultur sel Leydig mengandung testosteron dan protein lainnya yaitu dengan BM mendekati 29 kDa, 62–70 kDa dan 95-130 kDa.
2. Penggunaan CM Leydig sebagai medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang menghasilkan sel yang positif terhadap pewarnaan spesifik 3β-HSD (sel Leydig), morfologi sel yang berbeda serta testosteron.
3. Penambahan hCG bersama-sama dengan CM kultur sel Leydig mampu meningkatkan jumlah sel Leydig dan sekresi testosteron di dalam medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang.
4. CM sel Leydig dapat mengarahkan stem cell mesenkimal sumsum tulang mengalami transdiferensiasi menjadi sel Leydig.
DAFTAR PUSTAKA
Ariyaratne HBS, Mendis-Handagama SMLC, Hales DB, Mason JI. 2000. Studies on the onset of Leydig precursor cell differentiation in the prepubertal rat testis. Biol Reprod 63 : 165-171.
Avallet O, Vigier M, Chatelain PG, Saez JM. 1991. Regulation by growth factor of Leydig cell differentiated functions. J Steroid Biochem Mol Biol 40(1-3) : 453 – 464.
Bilinska B, Kotula-Balak M, Sadowska. 2009. Morphology and function of human Leydig cells in vitro. Immunocytochemical and radioimmunological analyses. European J Histochem 53(1) : 35-42.
Caplan AI, Bruder SP. 2001. Mesenchymal stem cells: building block for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med 7(6) : 259-264. Chemes H, Cigorraga S, Bergada C, Schteingart, Rey R, Pellizzari. 1992.
Isolation of human Leydig cell mesenchymal precursors from patients with the androgen insensitivity syndrome: testosterone production and response to human chorionic gonadotropin stimulation in culture. Biol Reprod 46 : 793-801.
Cudicini C, Lejeune H, Gomez E, Bosmans E, Ballet F, Saez J, Jegou B. 1997. Human Leydig cells and Sertoli cells are producers of Interleukins-1 and -6. J Clin Endocrin Metab 82 (5) : 1426-1433.
Djuwita I, Mohamad K, Prasetyaningtyas WE, Nurhidayat. 2010. In vitro differentiation of adult rat bone marrow stromal cells into neurons using conditioned medium of newborn rat neuron primary culture. The Proceedings of the first Congress of South East Asia Veterinary School Association. Bogor, Indonesia. Hal 51-52.
Eguizabal C, Montserrat N, Veiga A, Belmonte JCI. 2013. Dedifferentiation, transdifferentiation and reprogramming: Future direction in regenerative medicine. Sem Reprod Med 31: 82-94.
Halim D, Murti H, Sandra F, Boediono A, Djuwantono, dan Setiawan B. 2010. Stem Cell. Dasar teori dan aplikasi klinis. Jakarta. Erlangga.
Habert R, Lejeune H, Saez JM. 2001. Origin, differentiation and regulation of fetal and adult Leydig cells. Mol Cell Endocrin 179 : 47-74
Hardy MP, Kelce WR, Klinefelter GR, Ewing LL. 1990. Differentiation of Leydig cell precursors in vitro : a role for androgen. Endocrin 127: 488-490.
Kaiin EM, Djuwita I, Yusuf TL, Setiadi MA. 2013. Development of in vitro culture of rat Leydig cells after purification with Nycodenz gradient. Open J Anim Sci 3 (4) : 299-304.
Kropf J, Schurek JO, Wollner A, AM Gressner. 1997. Imunological measurement of transforming growth factor- beta I (TGF-βI) in blood, assay, development and comparison. Clin Chem 43(10) : 1965-1975.
Lakshmanan J, Salido EC, Lam R, Barrjas L, Fisher DA. 1990. Identification of pro-epidermal growth factor and high molecular weight EGF in adult mouse urine. Biochem Biophysic Res Comm 173 (3) : 902-911.
Mendis-Handagama SMLC, Ariyaratne HBS. 2001. Differentiation of the adult Leydig cell population in the postnatal testis. Biol Reprod 65 : 660-671. Phinney DG, Prockop DJ. 2007. Concise Review: Mesenchymal
stem/multipotent stromal cells : The state of transdifferentiation and modes of tissue repair-Current views. Stem Cells 25: 2896-2902.
Prentice DA. 2003. Stem Cells and Cloning. San Francisco. Pearson Education Inc.
Risbridger GP, Kerr JB, Peake R, Rich KA, de Kretser DM. 1981. Temporal changes in rat Leydig cell function after the induction of bilateral cryptorchidism. J Reprod Fertil 63 : 415-423.
Saez JM. 1994. Leydig cells: endocrine, paracrine, and autocrine regulation. Endocrine Rev 15(5): 574-626.
Sedelaar JPM, Isaacs JT. 2009. Tissue culture media supplemented with 10% Fetal Calf Serum contains a castrate level of testosterone. Prostate 69 (16) : 1724-1729.
Song L, Tuan RS. 2004. Transdifferentiation potential of human mesenchymal stem cell derived from bone marrow. FASEBJ 18 : 980-982.
Suarez-Quian, Niklinski. 1990. Immunocytochemical localization of EGF receptor in mouse testis. Biol Reprod 43 : 1087-1097.
Sun J, Xi Y-B, Zhang Z-D, Shen P, Li H-Y, Yin M-Z, Li W-Y, Shi C-R. 2009. Leydig cell transplantation restores androgen production in surgically castrated prepubertal rats. Asian J Androl 11: 405-409.
Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, Black IB. 2000. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res 61: 364-371.
Wu YJ, Dong Q, Li SF, Wei X, Long D, Zeng Y. 2012. Differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into Leydig or steroidogenic cells in vitro. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 43(4):493-7, 506.(Abstract). Yazawa T, Mizutani T, Yamada K, Kawata H, Sekiguchi T, Yoshino M, Kajitani
T, Shou Z, Umezawa A, Miyamoto K. 2006. Differentiation of adults stem cells derived from bone marrow stroma into Leydig or adrenocortical cells. Endocrin 147(9) : 4104-4111.
