BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Pada penelitian ini menggunakan metode True Experimental dengan rencana penelitian menggunakan Post Test Only Control Group Design. Metode yang digunakan Tube dilution test dan Dilution agar test untuk mengetahui pengaruh cuka apel (Apple Cider Vinegar) terhadap pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa seacara in vitro.
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang pada bulan September 2022.
4.3 Populasi dan Sampel Penelitian 4.3.1 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi yang digunakan adalah biakan murni bakteri Pseudomonas aeruginosa Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang.
4.3.2 Sampel Penelitian
Sampel yang digunakan adalah bakteri Pseudomonas aeruginosa yang diambil menggunakan cara Simple Random Sampling. Metode ini digunakan dikarenakan tiap unit pada populasi bersifat homogen, dan bertujuan agar setiap unit populasi mendapat kesempatan yang sama untuk dijadikan sebagai sampel.
4.3.3 Estimasi Jumlah Pengulangan
Penelitian ini terdiri dari 6 kelompok yang terbagi menjadi 4 kelompok penelitian menggunakan perlakuan cuka apel, satu kelompok kontrol kuman, dan satu kelompok kontrol bahan.
Berdasarkan rumus federer dibawah ini yang terdiri dari t yang menyatakan jumlah perlakuan dan r menyatakan banyaknya pengulangan, maka didapatkan:
( r – 1 ) ( t – 1 ) ≥ 15 ( r – 1 ) ( 6 – 1 ) ≥ 15 5 ( r – 1 ) ≥ 15
5r – 5 ≥ 15
5r ≥ 15 + 5
5r ≥ 20
r ≥ 4
Dari hasil perhitungan tersebut, diambil jumlah pengulangan maksimum.
Maka dapat dilakukan estimasi pengulangan sebanyak 4 kali pada sampel bakteri Pseudomonas aeruginosa (Prihanti, 2016) .
4.4 Variabel Penelitian
4.4.1 Variabel Bebas Penelitian
Variabel bebas pada penelitian ini adalah cuka apel (Apple Cider Vinegar) dalam konsentrasi 100% (kontrol positif), 50%, 25%, 12,5%, 6,25% dan 0%
(kontrol negatif).
4.4.2 Variabel Terikat Penelitian
Variabel terikat pada penelitian ini adalah pertumbuhan koloni bakteri P.
aeruginosa yang dapat dilihat dari Kadar hambat minimum (KHM) dan Kadar bunuh minimum (KBM).
4.4.3 Variabel Kontrol Penelitian
Variabel kontrol pada penelitian ini adalah medium biakan dengan suhu inkubasi 37 ℃ dan waktu inkubasi 18 – 24 jam.
4.5 Definisi Operasional Tabel 4.1 Definisi Operasional
No Variabel Definisi Cara
Pengukuran
Indikator Penilaian
Skala 1 Cuka apel
(Apple Cider Vinegar)
Cuka apel merupakan olahan fermentasi yang berasal dari buah apel
Perhitungan dengan mikro pipet
Kosentrasi :
1. 100% (kontrol positif)
2. 50%
3. 25%
4. 12,5%
5. 6,25%
6. 0% (kontrol negatif)
Kategorik : Ordinal
2 KHM (Kadar Hambat Minimal)
Konsentrasi minimal cuka apel (Apple Cider Vinegar) yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri P.
aeruginosa dengan melihat tingkat kejernihan pada tabung
Penilaian secara visual, dinilai oleh minimal 3 orang
1. Jernih (+):
apabila garis hitam pada kertas di belakang tabung terlihat jelas, atau warna tabung sama dengan warna pada tabung kontrol positif
2. Agak keruh (++) : apabila garis hitam pada kertas di belakang tabung masih terlihat, tetapi samar-samar 3. Sangat keruh (+++): apabila garis hitam pada kertas di belakang tabung tidak terlihat, atau warna tabung sama dengan warna tabung kontrol negatif KHM dinilai dengan perubahan
indikator dari
“Agak keruh”
menjadi “Jernih”
Kategorik, ordinal
3 KBM (Kadar Bunuh Minimal)
Konsentrasi minimal cuka apel (Apple Cider Vinegar) mampu membunuh bakteri P.
aeruginosa ditandai dengan penurunan 99,9%
koloni bakteri pada media agar.
Penghitunga n dengan Colony Counter
KBM dinilai dengan tidak adanya
pertumbuhan
bakteri P.
aeruginosa atau maksimal 0,1%
dari kontrol bahan yang dihitung dengan Colony Counter
Numerik, Ratio
4.6 Alat dan Bahan Penelitian
4.6.1 Alat dan Bahan Pembuatan media Nutrien Broth (NB) a. Alat
1. Tabung reaksi steril 2. Erlenmeyer
3. Vortex 4. Autoclave 5. Kertas
6. Alumunium foil 7. Neraca analitik b. Bahan
1. Aquades
2. Nutrient Broth (NB)
4.6.2 Alat dan bahan pembuatan media Nutrient Agar Plate (NAP) a. Alat
1. Erlenmeyer
2. Cawan petri 3. Autoclave 4. Kertas
5. Alumunium foil 6. Neraca analitik 7. Microwave b. Bahan
1. Aquades
2. Nutrient agar (NA) 4.7 Prosedur Penelitian
4.7.1 Sterilisasi Alat
Sterilisasi alat dengan cara mencuci semua alat yang digunakan dengan sabun sampai bersih, kemudian dikeringkan. Setelah itu, alat-alat yang bisa disterilisasi menggunakan autoklaf dibungkus terlebih dahulu menggunakan kertas sebelum dimasukkan ke dalam autoklaf dengan suhu 121°C serta bertekanan 15 atm, selama 15 menit. Sedangkan alat-alat yang tidak bisa disterilisasi menggunakan autoklaf maka disterilisasikan menggunakan alkohol 70% selama 20 menit.
4.7.2 Pembuatan Cuka Apel
1. Apel di cuci dan diiris tipi-tipis
2. Rebus irisan apel dengan air sampai mendidih
3. Kecilkan apil kompor dan tambahkan gula biarkan selama 30 menit hingga aroma apel keluar
4. Lakukan penyaringan untuk mendapatkan sari apel 5. Setelah dingin masukkan sari apel ke dalam botol
6. Masukkan ragi/ yeast ke dalam botol dan tutup rapat 7. Fermentasi selama 1-2 minggu hingga terbentuk alkohol
8. Jika alkohol sudah keluar, tutup botol dibuka dan masukkan induk cuka atau bakteri asam asetat dan tutup dengan kain kasa. Fermentasi Kembali selama 2 minggu sehingga terbentuk cuka dan pH mencapai 3- 4
9. Ambil cuka dari botol dan lakukan pasteurisasu untuk mematikan mikroba pembentuk asam asetat.
4.7.3 Pembuatan Media NB
1. Menimbang Nutrient Broth sebanyak 0,65 gram, kemudian memasukkan dalam erlenmeyer.
2. Menambahkan aquades sampai volume menjadi 50cc dan mengaduknya secara merata kemudian ditutup dengan alumunium foil.
3. Mensterilisasi larutan dalam autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit.
4.7.4 Pembuatan media NAP
1. Menimbang agar nutrient sebanyak 14 gram, kemudian memasukkan dalam gelas berkala. Menambahkan aquades sampai volume menjadi 500cc. Mengaduknya secara merata kemudian tutup dengan alumunium foil.
2. Merebus larutan yang telah tercampur rata.
3. Mensterilisasi larutan yang sudah direbus ke dalam autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit
4. Menuangkan larutan yang sudah disterilisasi ke dalam masing-masing cawan petri sebanyak 20 ml (tebal 3-4 mm).
4.7.5 Pembuatan Pembenihan Cairan Bakteri P. aeruginosa
Perbenihan cair bakteri yang akan digunakan dalam penelitian adalah bakteri dengan kepadatan 106 bakteri/ml. Kemudian perbenihan akan distandarisasi dengan menggunakan metode McFarland I yaitu setara dengan kepadatan 108 bakteri/ml (Gazali, Anam and Khumaidi, 2016)
Pembuatan suspensi bakteri 106 bakteri/ml dapat melalui langkah-langkah berikut:
a. Mengambil 4-10 ose bakteri dari media agar yang telah diinkubasi selama 24 jam, dimasukkan ke dalam tabung yang berisi aquades, kemudian dihomogenkan. Suspensi bakteri tersebut disetarakan kekeruhannya dengan larutan standar McFarland I, sehingga menjadi suspensi bakteri dengan kepadatan 108 bakteri/ml.
b. Mengambil 1 ml suspensi bakteri dengan kepadatan bakteri 108 bakteri/ml dan memasukkan ke dalam tabung yang telah diisi 9ml aquades sehingga didapatkan pengenceran sebesar 10-1. Kepadatan bakteri sekarang menjadi 107 bakteri/ml.
c. Mengambil kembali 1ml suspensi bakteri dengan kepadatan bakteri 107 bakteri/ml dan memasukkan ke dalam tabung yang telah diisi 9ml Nutrient Broth. Kepadatan bakteri sekarang menjadi 106 bakteri/ml.
4.7.6 Uji Efektivitas kepekaan cuka apel terhadap P. aeruginosa
Metode yang digunakan pada uji kepekaan cuka apel adalah metode dilusi tabung. Pada penelitian ini digunakan 6 macam kadar cuka apel dengan 2 kelompok kontrol, pada tabung kontrol positif konsentrasinya adalah 100% dan pada tabung kontrol negatif adalah 0%. Kemudian di campurkan atau diinokulasi
dengan perbenihan cair bakteri P. aeruginosa lalu diinkubasi pada suhu 37o C selama 18-24 jam. Dengan melalui tahapan-tahapan sebagai berikut:
• Hari Pertama :
1. Menyediakan 5 tabung reaksi steril, yang terdiri dari tabung 1, tabung 2, tabung 3, tabung 4, tabung 5 dan tabung 6. Memberikan berbagai perlakuan konsentrasi cuka apel pada masing-masing 4 tabung reaksi.
Sedangkan 2 tabung lainnya sebagai kontrol, tabung 1 sebagai Kontrol Bahan dan tabung 6 sebagai Kontrol Kuman.
2. Memasukkan 0,5 ml Nutrient Broth pada tabung 3, 4, 5 dan 6 . Kemudian memasukkan 1ml cuka apel pada tabung 1.
1ml cuka apel 0,5 ml Nutrient Broth Kosong
Gambar 4.1 Konsentrasi Awal cuka apel dan Nutrient Broth
3. Memasukkan 0,5 ml cuka apel ke dalam tabung 2 dan 0,5 ml cuka apel ke dalam tabung 3.
Konsentrasi cuka apel:
Tabung 2 → 0,5ml (100%) Tabung 3 → 1ml (50%).
Gambar 4.2 Proses Pengenceran Cuka apel
2 3
1 5 6
1 2 3 4 5 6
4. Mencampurkan cuka apel dan Nutrient Broth pada tabung 3. Kemudian dipindahkan 0,5ml ke dalam tabung 4.
Konsentrasi cuka apel:
Tabung 3 → 0,5ml (50%)
Tabung 4 → 1ml (25%)
Gambar 4.3 Proses Pengenceran Cuka apel
5. Lakukan hal yang sama pada tabung 4 dan membuang larutan sebanyak 0,5 ml dari tabung 4
6. Ulangi pada tabung ke 5.
7. Mendapatkan konsentrasi awal anti mikroba pada pengenceran dari masing-masing tabung.
• Tabung 1 berisi 1 ml cuka apel (100%)
• Tabung 2 berisi 0,5 ml cuka apel (100%)
• Tabung 3 berisi 0,25 ml cuka apel + 0,25 ml nutrient broth (50%)
• Tabung 4 berisi 0,125 ml cuka apel + 0,375 ml nutrient broth (25%)
• Tabung 5 berisi 0.0625 ml cuka apel + 0.4375 ml nutrient broth (12,5%)
• Tabung 6 berisi 0,5 ml aquades (0%)
100% 100% 50% 25% 12,5% 0%
Gambar 4.4 Konsentrasi Awal Anti Mikroba
3 4 3 4
1
2 3 4 5 6
8. Menambahkan pembenihan cair bakteri sebanyak 0,5 ml pada tabung 2 sampai 6.
100% 100% 50% 25% 12,5% 0%
Gambar 4.5 Penambahan Bakteri pada Tabung 2 sampai 6
9. Mendapatkan konsentrasi akhir anti mikroba dengan volume pada masing-masing tabung sebesar 1ml
100% 50% 25% 12,5% 6,25% 0%
Gambar 4.6 Konsentrasi Akhir Anti Mikroba
10. Menginkubasi semua tabung ke dalam inkubator pada suhu 37oC selama 18-24 jam.
• Hari Kedua
Pada hari ke-2 Semua tabung dikeluarkan dari inkubator, lalu amati kejernihan tabung secara visual dengan penilaian minimal oleh 3 orang dan akan didapatkan nilai KHM (Kadar Hambat Minimal).
Kemudian masing – masing tabung diambul denga nose steril sebanyak 1 kali dan dilakukan streaking pada Media NAP, selanjutnya diinkubasikan Kembali selama 18 - 24 jam pada suhu 37o C.
2 3 4 6
1 5
• Hari Ketiga
Semua media NAP dikeluarkan dari inkubator dan dilakukan pengamatan kuantitatif pada masing – masing konsentrasi dengan cara menghitung jumlah koloni bakteri dengan colony counter sehingga didpatkan data jumlah. Setelahnya dapat ditentukan KBM (Kadar Bunuh Minimal. Penelitian ini dilakukan oleh peneliti dan dikonfirmasi oleh analis laboran.
Biakan bakteri Pseudomonas aeruginosa Pembuatan cuka apel berbagai konsentrasi
Perbenihan cair Pseudomonas aeruginosa dengan konsentrasi 106 bakteri/ml
Mengencerkan cuka apel dalam 6 tabung dengan volume masing-masing 0,5ml
Menginkubasi dalam suhu 37oC selama 18-24 jam Pengamatan KHM
Menghitung jumlah koloni (KBM)
Menganalisis hasil Mengoleskan pada media NAP
Menginkubasi dalam suhu 37oC selama 18 jam
4.8 Alur Penelitian
Gambar 4.7 Skema Prosedur Penelitian pada Bakteri Pseudomonas aeruginosa.
100% 100% 50% 25% 12,5% 0%
1
2 3 4 5 6
100% 50% 25% 12,5% 6,25% 0%
1
2
3
4
5
6
4.9 Analisis Data
Uji statistik yang digunakan untuk menganalisis data pada penelitian ini menggunakan uji ANOVA dengan langkah-langkah sebagai berikut:.
a. Uji normalitas yang digunakan adalah uji Saphiro-Wilk karena besar sampel yang digunakan ≤ 50. Data dianggap normal jika hasil p > 0,05.
b. Uji homogenitas yang digunakan paada penelitian ini adalah uji Levene, dimana dikatakan homogen jika p > 0,05.
c. Bila uji normalitas didapakan sebaran data normal dan homogen, maka akan dilanjutkan ANOVA untuk membuktikan adanya perbedaan yang bermakna antara kontrol dengan perlakuan. Hasil uji dikatakan ada perbedaan yang bermakna jika p < 0,05.
d. Bila didapatkan varian sama, setelah uji ANOVA dilanjutkan uji Post Hoc Bonferroni, namun jika didapatkan varian berbeda, dilanjutkan uji Post Hoc Games Howell.
e. Bila uji normalitas didapakan sebaran data tidak normal dan tidak homogen maka akan dilanjutkan uji non-parametrik Kruskal-wallis hasil uji ditentukan oleh nilai signifikansi, H0 adalah tidak terdapat perbedaan antara perlakuan yang diuji, sedangkan H1 terdapat perbedaan antara perlakuan yang diuji. Jika nilai signifikansi >0.05 H0 diterima dan jika nilai signifikansi <0.05 H1 diterima dan dilanjutkan uji Mann-whitney
