23
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Penentuan panjang gelombang maksimum ini digunakan untuk mengetahui pada serapan berapa zat yang dibaca oleh spektrofotometer UV secara optimum karena detektor KCKT yang digunakan untuk penelitian ini adalah detektor UV. Pada penelitian ini, hasil scanning panjang gelombang maksimum atorvastatin
dalam fase gerak metanol-air pH 3 (80:20 v/v) dengan konsentrasi 100 µg/mL menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 200 – 400 nm menunjukkan bahwa atorvastatin memiliki serapan maksimum pada 245 nm. Berdasarkan penelitian Sawant et al., (2012), panjang gelombang maksimum atorvastatin adalah 246 nm. Perbedaan panjang gelombang sebesar 1 nm masih dalam batas toleransi yang diperkenankan menurut Depkes RI (1995), yaitu lebih kurang 3 nm. Spektrum UV atorvastatin dapat dilihat pada gambar 2.
Gambar 2. Spektrum UV atorvastatin dalam fase gerak metanol : air pH 3 (80:20, v/v) dengan konsentrasi 100 µg/mL.
B. Optimasi Komposisi dan Kecepatan Alir Fase Gerak
berbagai variasi komposisi dan kecepatan alir fase gerak. Prioritas pertama dalam pemilihan perbandingan komposisi fase gerak adalah nilai resolusi yang dihasilkan yaitu RS > 2. Nilai ini menunjukkan puncak yang dihasilkan terpisah sempurna dengan puncak yang lain. Prioritas kedua adalah waktu retensi, semakin cepat maka akan semakin baik karena menghemat waktu analisis. Prioritas ketiga adalah tailling factor dari masing-masing puncak yang dihasilkan yaitu < 2 dan nilai N yang dihasilkan > 2000.
Optimasi metode analisis atorvastatin dengan KCKT kondisi awal yaitu
kolom Cosmosil C18, ukuran partikel 5 µm, panjang kolom 150 mm dan diameter dalam 4,6 mm, fase gerak campuran metanol-air pH 3, volume injeksi 20 µL, detektor UV 245 nm, dan kecepatan alir fase gerak 1 mL/menit. Optimasi metode analisis dilakukan dengan optimasi perbandingan komposisi fase gerak metanol-air pH 3. Hasil optimasi komposisi fase gerak dapat dilihat pada tabel 2, sedangkan kromatogram hasil optimasi perbandingan fase gerak metanol-air pH 3 dapat dilihat pada lampiran 2.
Tabel 2. Hasil Optimasi Perbandingan Komposisi Fase Gerak Metanol-Air pH 3
Parameter
Perbandingan Komposisi Fase Gerak (Metanol-Air pH 3)
Syarat (Snyder
et al., 2010) 70-30 75-25 80-20 85-15 90-10
Resolusi (Rs) 1,54 0,83 3,15 1,06 3,00 > 2 Rt (menit) 6,24 4,98 3,91 3,25 2,72 ≤ 10
Tailing factor 1,60 0,89 0,90 0,75 1,20 < 2
Jumlah lempeng
teoritis (N) 5784 5377 5184 4210 5980 > 2000
kromatogram pada lampiran 3, peak yang dihasilkan memberikan hasil yang baik pula.
Selanjutnya, hasil dari optimasi perbandingan komposisi fase gerak yang dipilih yaitu metanol-air pH 3 (80:20) dilakukan optimasi kecepatan alir fase gerak. Optimasi kecepatan alir yang dilakukan yaitu pada kecepatan 0,9; 1,0 dan 1,1 mL/menit. Hasil optimasi kecepatan alir dapat dilihat pada tabel 3.
Tabel 3. Hasil optimasi kecepatan alir fase gerak
Parameter
Kecepatan Alir Fase Gerak
(mL/menit) Syarat (Snyder et al., 2010)
0,9 1,0 1,1
Resolusi (Rs) 3,00 3,15 2,63 > 2
Rt (menit) 4,49 3,91 3,61 ≤ 10
Tailing factor 1,12 0,90 0,75 < 2
Jumlah lempeng teoritis
(N) 5367 5184 5184 > 2000
Hasil optimasi kecepatan alir yang dipilih adalah 1 mL/menit, karena menghasilkan nilai resolusi, tailing factor, nilai N, serta luas area yang optimal dengan waktu retensi yang cukup cepat dibandingkan dengan kecepatan alir yang lain.
Berdasarkan hasil optimasi yang dilakukan diperoleh sistem kromatografi sebagai berikut:
Fase diam : Cosmosil C18 (150 x 4,61 mm, 5 µm)
Fase gerak : Metanol-air pH 3 yang diatur dengan asam fosfat (80:20) Kecepatan alir : 1 mL/menit
Detektor : UV 245 Vol. Injeksi : 20 µL
C. Uji Kesesuaian Sistem
KCKT memberikan hasil yang baik (Gandjar dan Rohman, 2012). Syarat uji kesesuaian sistem yang baik menurut Snyder et al. (2010), apabila waktu retensi menghasilkan CV ≤ 1,0%, luas area dan intensitas menghasilkan CV ≤ 2,0%, nilai resolusi > 2, tailing factor ≤ 2, dan nilai N > 2000. Hasil uji kesesuaian sistem dapat dilihat pada tabel 4.
Tabel 4. Hasil uji kesesuaian sistem KCKT untuk analisis atorvastatin 120 ng/mL dalam larutan fase gerak
Parameter Rerata SD CV (%)
Syarat (Snyder et
al., 2010)
Waktu Retensi 3,96 0,01 0,17 CV ≤ 1,0 % Luas Area 2726465 21018,89 0,77 CV ≤ 2,0 % Tinggi Puncak 362225 1829,41 0,51 CV ≤ 2,0 %
Resolusi 2,45 0,05 2,02 Rs > 2
Tailing Factor 0,88 0,01 1,67 TF ≤ 2
Jumlah Lempeng
Teoritis (N) 6055 4,19 0,07 N > 2000
Hasil uji kesesuaian sistem terhadap kadar atorvastatin 120 ng/mL yang dianalisis dengan KCKT menunjukkan bahwa kondisi yang digunakan untuk analisis kadar atorvastatin dalam tablet memenuhi persyaratan uji kesesuaian sistem.
D. Validasi Metode Analisis 1. Penentuan Selektivitas
Selektivitas menggambarkan kemampuan suatu metode untuk mengukur zat tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain. Pada penelitian ini, selektivitas metode analisis dilakukan dengan membandingkan puncak dalam kromatogram atorvastatin standar, sampel
Gambar 3. Profil kromatogram : A) standar atorvastatin, B) sampel tablet atorvastatin, C) pelarut fase gerak
Parameter KCKT :
Fase diam : Cosmosil C18 (150 x 4,61 mm, 5 µm)
Fase gerak : Metanol-air pH 3 yang diatur dengan asam fosfat (80:20) Kecepatan alir : 1 mL/menit
Detektor : UV 245 Vol. Injeksi : 20 µL
ATR ATR
A
B
Pada penelitian ini dihasilkan kromatogram dengan puncak atorvastatin standar dan sampel tablet atorvastatin pada waktu retensi 3,9 menit, serta tidak terlihat adanya puncak pada kromatogram pelarut fase gerak. Hal ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan selektif terhadap senyawa tertentu, dan menunjukkan tablet atorvastatin dapat dianalisis mengggunakan metode ini dengan membandingkan dengan standar atorvastatin yang memiliki waktu retensi yang sama.
Menurut Snyder et al. (2010), persyaratan uji selektivitas untuk
pengembangan metode analisis apabila memiliki nilai resolusi (Rs) > 2, hasil perhitungan resolusi diperoleh dari kromatogram atorvastatin standar dengan nilai resolusi sebesar 3,1 yang berarti memenuhi persyaratan. Hasil ini menunjukkan metode KCKT yang digunakan untuk analisis atorvastatin mempunyai selektivitas yang baik. Hasil kromatogram atorvastatin standar, sampel tablet atorvastatin, dan pelarut fase gerak dapat dilihat pada gambar 3.
2. Penentuan Linearitas
Uji linearitas dilakukan dengan cara menginjeksikan 5 seri konsentrasi atorvastatin pada sistem KCKT. Konsentrasi yang digunakan adalah 20, 40, 60, 80, 120 ng/mL. Data luas area atorvastatin yang diperoleh diplotkan dengan seri konsentrasi atorvastatin. Persamaan garis yang dihasilkan antara seri konsentrasi atorvastatin dengan luas area yang diperoleh dari kromatogram adalah y = 10742607,432x – 1356494,324; koefisien korelasi (r) = 0,9995, dan koefisien determinasi (r2) = 0,9990.
Menurut Chan et al. (2004), persyaratan linearitas untuk validasi metode analisis bisa diterima jika nilai koefisien determinasi (r2) lebih besar
atau sama dengan 0,997. Pada penelitian ini, nilai r2 yang diperoleh adalah
0,9990 sehingga metode analisis yang digunakan telah memenuhi syarat
Gambar 4. Kurva hubungan luas area kromatogram atorvastatin terhadap konsentrasi atorvastatin pada penentuan linearitas
3. Penentuan Akurasi dan Presisi
Salah satu syarat utama metode analisis adalah tepat dan teliti.
Ketepatan bisa dilihat dari parameter akurasi yang dalam penelitian ini diperoleh dari nilai perolehan kembali (recovery). Ketelitian dapat dilihat dari parameter presisi yang pada penelitian ini diukur sebagai simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (CV) (Rohman, 2009). Pada penelitian ini, uji presisi yang dilakukan adalah keterulangan (repeatability) yaitu presisi pada kondisi percobaan yang sama (berulang) baik orangnya, peralatanya, maupun waktunya (Gandjar dan Rohman, 2012).
Penentuan presisi dan akurasi dilakukan pada 5 konsentrasi atorvastatin, dimana pengukuran pada setiap konsentrasi sebanyak 5 kali. Pada penelitian ini, uji presisi dan akurasi dilakukan pada konsentrasi atorvastatin yaitu sebesar 20, 40, 60, 80, dan 120 ng/mL. Nilai perolehan kembali dan koefisien variasi pengukuran atorvastatin hasil penelitian ini dapat dilihat pada tabel 5.
y = 10.742,61x + 1.356.494,32 R 2= 0,999
0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000
0 20 40 60 80 100 120 140
Lu
as Ar
e
a Ato
rv
astat
in
Tabel 5. Nilai Recovery dan Koefisien Variasi (CV)
Konsentrasi Atorvastatin diketahui
(ng/mL)
Replikasi Kadar Atorvastatin terukur (ng/mL)
Recovery
(%) CV (%)
20
1 20,22 101,15
0,64
2 20,66 103,32
3 19,02 95,09
4 20,96 104,85
5 18,92 94,62
40
1 43,59 108,99
1,38
2 39,66 99,16
3 38,49 96,22
4 37,53 93,84
5 39,72 99,30
60
1 58,28 97,14
1,35
2 56,15 93,59
3 56,12 93,53
4 56,73 94,55
5 62,02 103,37
80
1 81,58 101,98
1,73
2 81,31 101,63
3 73,84 92,31
4 75,04 93,79
5 78,40 98,01
120
1 111,69 93,08
2,82
2 129,53 107,95
3 119,80 99,86
4 123,18 102,65
5 115,25 96,05
Untuk uji presisi, apabila sampel yang digunakan memiliki konsentrasi di bawah 1000 ng/mL maka syarat CV yang diterima menurut AOAC adalah kurang dari 7,3% (Gandjar dan Rohman, 2012). Dengan demikian, metode analisis yang digunakan dalam penelitian ini memenuhi persyaratan presisi.
4. Penentuan LOD (Limit Of Detection) dan LOQ (limit Of Quantifitation)
LOD adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi dan masih memberikan respon signifikan, sedangkan LOQ adalah konsentrasi terendah analit dalam sampel yang dapat ditentukan denga presisi dan akurasi
yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan (Gandjar dan Rohman, 2012).
Pada penelitian ini, penentuan LOD digunakan dengan metode visual instrumental dengan perhitungan signal to noise ratio (Ahuja and Dong, 2005). Pengukuran dilakukan pada konsentrasi atorvastatin sebesar 0,05; 0,1; 0,2 ng/mL. Hasil penelitian diperoleh bahwa konsentrasi atorvastatin 0,05 dan 0,1 ng/mL tidak terlihat adanya puncak atorvastatin pada waktu retensi sekitar 3,9 menit, sedangkan pada konsentrasi 0,2 ng/mL terlihat adanya puncak atorvastatin pada waktu retensi 3,96 menit. Hasil kromatogram penentuan LOD dapat dilihat pada gambar 5.
Nilai LOD dapat dibuktikan dengan melakukan injeksi berulang konsentrasi terpilih sebanyak 6 kali, apabila CV yang diperoleh lebih besar dari
50 𝑆/𝑁′=
50
3/1 = 16,67%, maka nilai tersebut merupakan LOD (Snyder et al.,
2010). Pada penelitian ini, injeksi berulang konsentrasi 0,2 ng/mL dihasilkan CV sebesar 30,07%, dapat dilihat pada tabel 6. Oleh karena itu, dapat ditetapkan bahwa konsentrasi 0,2 ng/mL merupakan nilai LOD.
nilai recovery 80 – 110%. Oleh karena itu, ditetapkan konsentrasi 0,7 ng/mL merupakan nilai LOQ.
Gambar 5. Profil kromatogram atorvastatin : A) konsentrasi 0,05 ng/mL, B) konsentrasi 0,1 ng/mL, C) konsentrasi 0,2 ng/mL
Parameter KCKT :
Fase diam : Cosmosil C18 (150 mm x 4,61 D, 5 µm)
Fase gerak : Metanol-air pH 3 yang diatur dengan asam fosfat (80:20) Kecepatan alir : 1 mL/menit
Detektor : UV 245 Vol. Injeksi : 20 µL
ATR
A
B
Tabel 6. Hasil Injeksi Berulang Atorvastatin 0,2 ng/mL Konsentrasi Atorvastatin (ng/mL) Luas Area Atorvastatin Rerata Luas Area Atorvastatin
SD CV (%)
Syarat (Snyder et al., 2010) 0,2 27105
2801,83 842,52 30,07 CV > 16,67 38624 16123 21844 28562 35873
Tabel 7. Nilai Recovery dan Koefisien Variasi (CV) pada penentuan LOQ
Konsentrasi Atorvastatin diketahui (ng/mL) Replikasi Kadar Atorvastatin terukur (ng/mL) Recovery
(%) CV (%)
0,7
1 0,70 100,01
0,93
2 0,71 101,27
3 0,71 101,14
4 0,72 103,04
5 0,71 101,10
E. Uji Keseragaman Kadar Tablet
Tabel 8. Kadar Tablet Atorvastatin Generik
Tablet Kadar (%) SD CV (%)
1 105,09
1,79 1,75
2 100,52
3 105,82
4 102,45
5 102,55
6 101,93
7 103,60
8 100,34
9 102,09
10 101,51
Berdasarkan data di atas menunjukkan kadar atorvastatin generik dalam sediaan tablet memenuhi persyaratan kadar menurut Aini et al. (2015) yaitu tidak kurang dari 90,0 % dan tidak lebih dari 110,0 % dari jumlah yang tertera pada etiket. Untuk perhitungan dapat dilihat pada lampiran 10.
35
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa:
1. Metode analisis sederhana secara KCKT menggunakan kolom Cosmosil C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm); menghasilkan kondisi optimum untuk
penetapan kadar tablet atorvastatin dengan fase gerak campuran metanol-air pH 3 (80:20 v/v); kecepatan alir 1 mL/menit dan dideteksi dengan detektor UV 245 nm.
2. Metode analisis sederhana yang dikembangkan telah memenuhi persyaratan validasi metode analisis meliputi selektivitas; linearitas pada rentang 20 – 120 ng/mL dengan r2 = 0,999; akurasi; presisi; Limit of Detection (LOD) sebesar 0,2 ng/mL; dan Limit of Quantitation (LOQ) sebesar 0,7 ng/mL.
B. Saran
Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik maka perlu dilakukan beberapa hal seperti berikut:
1. Perlu dilakukan validasi dengan parameter yang lain seperti robustness dan stabilitas larutan.
