Optimasi Fase Gerak Dapar Fosfat Ph 2,6 : Metanol Terhadap Vitamin C Dan Natrium Benzoat Dalam Kratingdaeng-S Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Kckt)

(1)

Lampiran 1.Kromatogram Natrium benzoat pada optimasi perbandingan fase gerak Dapar fosfat pH 2,6: metanol, laju alir 1 ml/menit dan panjang gelombang 254 nm.

Waktu retensi

K Luas Area Tinggi Simetris Lebar Lempeng

teoritis R α

23,114 22,18 335,47403 8,75236 0,86 0,5767 8900 - -

(2)

Waktu retensi

teoritis R α

13,187 12,22 346,63040 14,4456 0,94 0,3633 7297 - -

Perbandingan 70:30 Lampiran 1 (Lanjutan)

Waktu retensi

teoritis R Α

(3)

Perbandingan 60:40

Waktu retensi

teoritis R α

4,966 3,98 341,24533 32,5807 0,95 0,1517 5941 - -

Waktu retensi

teoritis R α

(4)

Perbandingan 40:60

Waktu retensi

teoritis R α

3,301 2,31 328,88269 25,6689 1,14 0,1917 1642 - -

Perbandingan 30:70

Lampiran 1 (Lanjutan)

Waktu retensi

teoritis R α

(5)

Perbandingan 20:80

Waktu retensi

teoritis R α

3,167 2,18 240,73596 17,4476 0,76 0,2052 1319 - -

Perbandingan 10:90

Lampiran 2. Kromatogram Vitamin C pada optimasi fase gerak Dapar fosfat pH 2,6: metanol, laju alir 1 ml/menit, dan panjang gelombang 254 nm.

Waktu retensi

teoritis R α

(6)

Perbandingan 80:20

Waktu retensi

K Luas Area Tinggi Simetris Lebar Lempeng teoritis

R α

2,654 1,66 59,52710 8,32348 0,43 0,1006 3857 - -

Waktu retensi

teoritis R α

(7)

Perbandingan 60:40

Waktu retensi

R α

2,605 1,61 106,27876 16,8183 0,76 0,0928 4363 - -

Perbadingan 50:50

Waktu retensi

teoritis R α

(8)

Perbandingan 40:60

Waktu retensi

teoritis R α

2,629 1,6 119,39925 9,11223 0,47 0,2150 831 - -

Waktu retensi

teoritis R α

(9)

Perbandingan 20:80

Waktu retensi

R α

2,655 1,66 163,15613 19,4934 0,44 0,1600 1528 - -

Perbandingan 10:90

Lampiran 3. Kromatogram Campuran Vitamin C dan Natrium benzoat pada optimasi fase gerak Dapar fosfat pH 2,6 : metanol, laju alir 1 ml/menit, dan panjang gelombang 254 nm.

Waktu retensi

(10)

2,761

Perbandingan 80:20

Waktu Lampiran 3 (Lanjutan)

(11)

Perbandingan 60:40

Waktu retensi

teoritis R α

2,606 4,973

1,61 3,99

369,11108 337,00629

59,119 32,110

0,78 0,92

0,0921 0,1524

4442 5903

-

11,38

-

2,47 Perbandingan 50:50

(12)

Waktu

(13)

Perbandingan 20:80

Waktu retensi

teoritis R α

2,644 3,058

1,65 2,07

63,95556 504,80411

8,0554 27,019

0,48 1,31

0,1552 0,2754

1670 682

-

1,14

-

1,2

Perbandingan 10:90

Lampiran 4. Kromatogram Sampel Kratingdaeng-s dengan fase gerak dapar fosfat pH 2,6 : metanol (50:50),laju alir 1 ml/menit, danpanjang gelombang 254 nm.

Waktu retensi

(14)

2,576

Lampiran 5. Kromatogram sampel Kratingdaeng-s setelah penambahan baku

Waktu

(15)

Perbandingan Fase Gerak Dapar fosfat pH 2,6 : metanol (50:50), kosentrasi 5 ppm.

Waktu retensi

teoritis R α

2,614 1,62 190,34166 31,5527 0,82 0,0881 4875 - -

Perbandingan Fase Gerak Dapar Fosfat pH 2,6 : metanol (50:50), kosentrasi 10 ppm.

Waktu retensi

teoritis R α

(16)

Perbandingan Fase Gerak Dapar fosfat pH 2,6 : metanol ( 50:50), kosentrasi 20 ppm.

Waktu retensi

teoritis R α

2,614 1,62 645,63464 104,772 0,80 0,0888 4802 - -

Perbandingan Fase Gerak Dapar Fosfat pH 2,6 : metanol (50:50), laju alir 1 ml/ menit dengan kosentrasi 30 ppm.

(17)

Waktu retensi

teoritis R α

2,614 1,62 859,84991 139,840 0,80 0,0886 4824 - -

Perbandingan Fase Gerak Dapar Fosfat pH 2, 6 : metanol ( 50:50), kosentrasi 40 ppm.

kromatogram hasil penyuntikan larutan vitamin C BPFI dengan kosentrasi 5

ppm, 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, dan 40 ppm. Dengan menggunakan KCKT

dengan kolom Agilent Eclipse XDB C18 ( 250 mm x 4,6 mm), autosampler 10 𝜇𝜇l ,

isokratik, perbandingan 50:50 , laju alir 1 ml/menit dan dengan panjang

gelombang 254 nm.

Lampiran 7. Kromatogram Penyuntikan Natrium benzoat BPFI pada pembuatan Kurva Kalibrasi

Waktu retensi

teoritis R α

(18)

Waktu retensi

k Luas Area Tinggi Simetris Lebar Lempeng

teoritis R α

5,109 4,12 380,23748 41,9017 0,74 0,1281 8817 - -

Waktu retensi

(19)

5,110 4,12 573,24084 61,0643 0,79 0,1322 8280 - -

Perbandingan Fase Gerak Dapar Fosfat pH 2, 6: metanol ( 50:50 ) kosentrasi 150 ppm.

Waktu retensi

teoritis R α

5,112 4,13 761,92780 77,1685 0,87 0,1381 7600 - -

(20)

Waktu retensi

teoritis R α

5,113 4,13 948,90216 89,8088 0,99 0,1447 6923 - -

Perbandingan Fase Gerak Dapar Fosfat pH 2,6 : metanol ( 50:50), kosentrasi 250 ppm.

kromatogram hasil penyuntikkan larutan natrium benzoat BPFI dengan

kosentrasi 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200ppm, dan 250 ppm. Dengan

menggunakan KCKT dengan kolom Agilent Eclipse XDB C18 ( 250 mm x 4,6 mm), autosampler 10 μL , isokratik, perbandingan 50:50 , alju alir 1 ml/menit dan

dengan panjang gelombang 254 nm.

Lampiran 8. Perhitungan persamaan regresi dari kurva kalibrasi Vitamin C BPFI yang diperoleh secara KCKT padapanjang gelombang 254 nmkonsenterasi (X) vc luas area (Y) untuk Vitamin C

No.

Konsentrasi

µg/ ml Luas Area

XY X2 Y2

X Y

1 0 0 0 0 0,0000

2 5 97,792 488,96 25 9563,2753

3 10 193,960 1939,6 100 37620,482

4 20 423,360 8467,2 400 179233,69

5 30 646,090 19382,7 900 417432,29

6 40 859,850 34394 1600 739342,02 ∑ 105 2221,052 64672,5 3025 1383191,8 Rata

(21)

Y

=

ax + b

=

n(

Σ

XY)

−

(

Σ

X)(

Σ

Y)

n(

Σ

X

2

)

−

(

Σ

X)

2

=

6(64672,46)

−

(105)(2221,052)

6(3025)

−

(105)

2

=

388034 ,76−233210 ,46

18150−11025

=

154824 ,3

7125

=

21,729726

b =

Y

� −

a

𝑋𝑋�

=

(370,17533) – (21,729726) (17,5)

=

370,17533- 380,27021

=

-10,09488

Sehingga diperoleh persamaan regresi Y =21,729726 X -10,09488

Untuk mencari hubungan konsentrasi (X) dengan luas area (Y) digunakan

pengujian koefisien korelasi (r):

r = (∑XY)− (∑X)(∑Y)/n

�[(∑X2₋₍_∑_X)2_/n][(_∑_Y2₎₋₍_∑_Y)2_/n]

= (64672 ,46)− (105)(2221,052)/6

�[(3025 )−(105)2/6][(1383191 ,8)−(2221 ,052)2/6]

= 64672,46 - 38868041

(22)

= 25804,05 �1187,5× 561013,13

=

25804 ,05

25810 ,91

= 0,99973

Lampiran 9. Perhitungan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) Vitamin C

Persamaan Regresi : Y = 21,729726 X – 10,09488

No

Konsentrasi X

Luas Area Y

Yi Y – Yi ( Y – Yi )2

1 5 97,792 98,55375 _-0,76175 _0,580263

2 10 193,960 207,20238 _-13,24238 _175,36063

3 20 423,360 424,49964 _-1,13964 _1,298779

4 30 646,090 641,7969 _4,2931 _18,430708

5 40 859,850 859,0 941 _0,75584 _0,57129

(23)

2

Lampiran 10. Perhitungan persamaan regresi dari kurva kalibrasi Na benzoat BPFI yang diperoleh secara KCKT pada panjang gelombang 254 nm konsenterasi (X) vc luas area (Y) untuk Na benzoat

(24)

Y = ax + b

=

𝑛𝑛(𝛴𝛴𝑋𝑋𝛴𝛴)−(𝛴𝛴𝑋𝑋)(𝛴𝛴𝛴𝛴)

𝑛𝑛(𝛴𝛴𝑋𝑋2₎₋₍_{𝛴𝛴𝑋𝑋}₎2

=

6(523105 )−(750)(2853,94)

6(137500 )− (750)2

=

3138630−2140455

825000−562500

=

998175

262500

= 3,8025714

b =

Y

� −

a

𝑋𝑋�

= (475,656) – (3,8025714) (125)

= 475,656 - 475,32143

= 0,334575

Sehingga diperoleh persamaan regresi Y =3,8025714X + 0,334575

Lampiran 10 (lanjutan)

Untuk mencari hubungan konsentrasi (X) dengan luas area (Y) digunakan

pengujian koefisien korelasi (r)

r = (∑XY)− (∑X)(∑Y)/n

�[(∑X2₋₍_∑_X)2_/n][(_∑_Y2₎₋₍_∑_Y)2_/n]

=

(523105 )− (750)(2853 ,94)/6

�[(137500 )−(750)2/6][(1990113 ,7)−(2853 ,94)2/6]

= 523105-356742,5

�(137500-93750)(1990113,7-1357495,6)

=

166362,5

(25)

=

166362 ,5

166364 ,18

=

0,99999

Lampiran 11. Perhitungan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) Natrium benzoat

Persamaan Regresi : Y = 3,8025714 X +0,334575

No Konsentrasi X

Luas Area

Y Yi Y – Yi ( Y – Yi )

2

1 50 189,580 190,46315 -0,88315 0,77995

2 100 380,290 380,59172 -0,30172 0,09103

3 150 573,240 570,72029 2,51971 6,348938

4 200 761,930 760,84886 1,08114 1,16886

5 250 948,900 950,97743 -2,07743 4,315715

∑ 12,704493

2 ) ( )

/ ( Deviasi Standar

2

− −

=

∑

n Yi Y x

(26)

(

)

Lampiran12.Contoh Perhitungan Vitamin C dan Natrium benzoat dalam Sampel a. Contoh Perhitungan Vitamin C pada sampel Kratingdaeng-s

Y = aX + b Kratingdaeng-s 100 ml≈ 110,9172 g Contoh Perhitungan Penentuan Kadar Sampel dipipet =1ml

Luas Area = 106,38821

(27)

Kadar vitamin C = Konsentrasi x volume Berat sampel yang ditimbang

= 5,3605411 mcg

ml

� x 10 ml 1 ml

= 53,605411µg/ml

Kadar kemurnian vitamin C = 53,605411µg/ml x Kadar Baku = 53,605411 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚�_{𝑚𝑚𝑚𝑚} 𝑥𝑥 99,85 % =53,525003mcg/ml

Kadar vitamin C setelah dikonversikan = 53,525003 mcg /ml 𝑥𝑥 100 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚

b. Contoh Perhitungan Natrium benzoat pada Kratingdaeng-s Y = aX + b

Contoh Perhitungan Penentuan Kadar

Sampel dipipet = 1ml

Kratingdaeng-s 100 ml≈ 110,9172 g

(28)

Luas Area Baku Natrium benzoat 100 ppm = 352,4

Luas Area sebenarnya =Luas Area yang didapat –Luas Area Baku Na benzoat = 394,7- 352,4

= 42,3 Persamaan Regresi Y = 3,8025714 X + 0,334575

X = 42,3−0,334575 3,8025714

= 11,036065µg/ml

Kadar natrium benzoat = Konsentrasi x volume Berat sampel yang ditimbang

= 11,036065 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚

𝑚𝑚𝑚𝑚

� 𝑥𝑥 10 𝑚𝑚𝑚𝑚 1 𝑚𝑚𝑚𝑚

= 110,36065µg/ml

Kadar kemurnian natrium benzoat = 110,36065𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚�_{𝑚𝑚𝑚𝑚} x Kadar Baku

= 110,36065 mcg�_ml x 100,34 % =110,73588𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚�_{𝑚𝑚𝑚𝑚}

Kadar natrium benzoat setelah dikonversikan

= 110,73588 mcg /ml x 100 mcg 100 ml =

110,73588 mcg /ml x100 mcg

110,9172 g = 99,8365 mcg

g

�

Lampiran 12b (Lanjutan)

Karena kadar natrium benzoat dalam kratingdaeng-s terlalu sedikit, sehingga dengan metode adisi /spiking ditambahkan natrium benzoat sebanyak 100 ppm yang dipipet dari LIB I (1000 ppm) ke dalam setiap sampel , selanjutnya untuk menghitung luas area sebenarnya sebagai berikut:

(29)

(30)

Waktu

Penyuntikkan ke-1

Waktu

(31)

Waktu

Penyuntikkan ke-3

Waktu

Penyuntikkan ke-4

Waktu retensi

(32)

2,430

Penyuntikkan ke -5

Waktu

Penyuntikkan ke -6 Lampiran 13 (lanjutan)

(33)

Waktu retensi

teoritis R α

2,576 5,099

1,58 4,11

107,19990 13,84946

10,934 1,4059

0,73 0,62

0,1942 0,1394

976 7401

-

8,89

-

2,6

Baku Natrium benzoat 100 ppm

Waktu retensi

teoritis R α

4,965 3,98 352,35318 29,503 1,01 0,1629 5147 - -

(34)

1

Lampiran 14 (lanjutan) No

Kadar (mg/kg) X

Luas Area

Y ( X - 𝑋𝑋� ) ( X - 𝑋𝑋�)2

1 50,3967 111,55383 1,715701 2,9436299

2 49,588112 109,60195 0,907113 0,822854

3 49,025961 108,24502 0,344962 0,11899878

4 48,592988 107,19990 -0,088011 0,00774594

5 48,256721 106,38821 -0,424278 0,18001182

6 47,468356 104,48524 -1,419784 2,0157866

∑ X=293,3288 _∑(X_-_𝑋𝑋�₎2

(35)

t hitung data 6 =

6 / 1,103542

| -1,419784 |

= 3,15144

Dari hasil perhitungan diatas didapat semua thitung: thitung < ttabel ,maka Semua

data tersebut diterima.

Kadar Vitamin C sebenarnya dalam Minuman Kratingdaeng-s terletak antara:

µ =

X

(t –

1

/

2

α) dk

×

=

48,88814± (4,0321x 1,103542

√6 )

= (

48,88814± 1,81653766) mg/kg

(36)

1

Lampiran 15 (lanjutan) No

(37)

t hitung data 6 =

6 / 0,55081

| 0,4446 |

= 1,977

Dari hasil perhitungan diatas didapat semua thitung: thitung < ttabel, maka

Semua data tersebut diterima. Kadar Natrium benzoat sebenarnya dalam

Minuman Kratingdaeng-s terletak antara:

µ = X (t – 1/2α) dk ×

=99,1554± (4,0321x 0,55081

√6 ) =(99,1554 ± 0,90669) mg/kg

(38)

Ditimbang Kratingdaeng-s sebanyak 100 ml kemudian dipipet 1ml sampel

Kratingdaeng-s kedalam labu tentukur 10 ml dan dari LIB I (1000 ppm) dipipet

1ml baku Na benzoat ( 100 ppm) dimasukan ke labu tentukur yang berisi sampel

tersebut. Kemudian dari LIB I (1000 ppm) ditambahkan lagi baku natrium

benzoat sebanyak 0,1ml dimasukkan kedalam labu tentukur sampel dilanjutkan

dengan penambahan Vitamin C dri LIB I(200 ppm ) dipipet 0,25 ml ke dalam

labu tentukur berisi sampel tersebut dicampurkan, dilarutkan dan dicukupkan

dengan pelarut hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan kadar

natrium benzoat 200 ppm, dan vitamin c yang ditambahkan 50 ppm.dikocok,

kemudian disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µm. Diinjeksikan sebanyak

10 µl dengan autosamplermenggunakan autosampler kesistem KCKT dan

dideteksi pada panjang gelombang 254 nm dengan perbandingan fase gerak dapar

fosfat : methanol (50:50), laju alir 1 ml/menit dengan suhu 300C. Dilakukan

sebanyak 6 kali perlakuan.

(39)

a.(Sebelum penambahan baku)

Penyuntikkan ke-1

Waktu

(40)

Waktu

Penyuntikkan ke -3

Waktu

Penyuntikkan ke-4

(41)

Waktu

Penyuntikkan ke -5

Waktu

Penyuntikkan ke-6

(42)

(Setelah penambahan baku)

Penyuntikkan ke-1

Waktu

(43)

Waktu

Penyuntikkan ke-3

Waktu

Penyuntikkan ke-4

(44)

Waktu

Penyuntikkan ke-6

(45)

Perhitungan % Recovery

% recovery = 𝐶𝐶𝐶𝐶−𝐶𝐶𝐶𝐶

𝐶𝐶∗𝐶𝐶 x 100%

Keterangan :

CF = Konsentrasi total sampel yang diperoleh setelah penambahan Natrium

benzoat dan Vitamin C baku (µg/ml)

CA = Konsentrasi dalam sampel sebelum penambahan baku (µg/ml)

C*A = Konsentrasi analit yang ditambahkan (µg/ml)

% Recovery = x 100%

(46)

Tabel 9. Data hasil penyuntikan sampel Kratingdaeng-s sebelum dan sesudah penambahan baku Vitamin C.

Tabel 10.Analisis Data Statistik Persen Perolehan Kembali Vitamin C pada Sampel Kratingdaeng-s.

No % Recovery (X) (𝑋𝑋 − 𝑋𝑋�) (𝑋𝑋 − 𝑋𝑋�)2

Dasar penolakan data apabila t hitung< t tabel

t hitung =

Penambahan baku (mg/kg)

(47)

t hitung data 4 =

Dari hasil perhitungan diatas didapat semua thitung: thitung < ttabel.,maka Semua

(48)

Lampiran 20. Contoh Perhitungan Persen Perolehan Kembali Natrium benzoat

Perhitungan % Recovery

% recovery = CF−CA

C∗A x 100%

Keterangan :

CF = Konsentrasi total sampel yang diperoleh setelah penambahan Natrium

benzoat dan Vitamin C baku (µg/ml)

CA = Konsentrasi dalam sampel sebelum penambahan baku (µg/ml)

C*A = Konsentrasi analit yang ditambahkan (µg/ml)

(49)

Contoh Perhitungan Natrium benzoat pada Sampel untuk Recovery Y = aX + b

Contoh Perhitungan Penentuan Kadar Kratingdaeng-s 100 ml≈ 110,9172 g Sampel dipipet = 1ml

Luas Area yang diAdisi + penambahan baku= 437,66837 Luas Area Baku Natrium benzoat 100 ppm = 352,4

Luas Area sebenarnya =Luas Area yang didapat –Luas Area Baku Na benzoat = 437,66837- 352,4

= 85,26837 Persamaan Regresi Y = 3,8025714 X + 0,334575

X = 85,26837−0,334575 3,8025714

= 22,335884µg/ml

Kadar natrium benzoat = Konsentrasi x volume Berat sampel yang ditimbang

= 22,335884

Kadar kemurnian natrium benzoat =223,35884 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚�_{𝑚𝑚𝑚𝑚} x Kadar Baku

= 223,35884mcg�_ml x 100,34 % =224,11826𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚�_{𝑚𝑚𝑚𝑚}

Kadar natrium benzoat setelah dikonversikan

(50)

Lampiran 21. Data Hasil Perhitungan Persen Perolehan kembali Natrium benzoat

Tabel 11. Data hasil penyuntikan sampel Kratingdaeng-s sebelum dan sesudah penambahan baku Natrium benzoat

Tabel 12.Analisis Data Statistik Persen Perolehan Kembali Natrium benzoat pada Kratingdaeng-s

No X (𝑋𝑋 − 𝑋𝑋�) (𝑋𝑋 − 𝑋𝑋�)2

1 102,22257 3,004203 9,0252357

2 98,864164 -0,354203 0,12545977

3 96,50524 -2,713127 7,3610581

4 99,79384 0,575473 0,33116917

5 98,90795 -0,310417 0,09635871

6 99,01644 -0,201927 0,04077451

∑ 595,3102 _∑₍_{𝑋𝑋 − 𝑋𝑋�}₎2

=16,98005596

𝑋𝑋� 99,218367

𝑅𝑅𝑅𝑅 =

�

∑(𝑋𝑋−𝑋𝑋�)

2 𝑛𝑛−1 =

�

16,98005596

5 = 1,8428

Pada tingkat kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = n – 1 = 6 – 1 = 5 Diperoleh t tabel = 4,0321

Dasar penolakan data apabila t hitung< t tabel

No Kadar sebelum Penambahan baku (mg/kg)

KadarSetelah Penambahan baku

(mg/kg) % Recovery

1 99,8365 202,05907 102,22257

2 98,851606 197,71577 98,864164

3 98,4924 194,99764 96,50524

4 99,48 199,27384 99,79384

5 98,68 197,58795 98,90795

(51)

Dari hasil perhitungan diatas didapat semua thitung: thitung < ttabel.,maka Semua

RSD = 𝑅𝑅𝑅𝑅

X

x 100%

=

1,8428

99,218367

x 100%

(52)

Lampiran 22.Hasil pengujian validasi, dengan parameter akurasi, presisi, batas deteksi (LOD), batas kuantitasi (LOQ) Vitamin C pada Kratingdaeng-s dengan menggunakan metode adisi standar

Lampiran 23.Hasil pengujian validasi, dengan parameter akurasi, presisi, batas deteksi (LOD), batas kuantitasi (LOQ) Natrium benzoat pada Kratingdaeng-s dengan menggunakan metode adisi standar

No Relative Standar Deviasi (%) = 1,8573

(53)

Lampiran 24.Daftar Spesifikasi Sampel Kratingdaeng-s = Kratingdaeng-S

Komposisi : Taurine, Glucuronolactone, Caffein, Inositol, Lysine, Choline Bitatrate, vitamin B3, vitaminB6, vitamin B5, vitamin B12, Gula murni, Ponceau 4R C.I.16255, Tartrazine C.I 19140, Citric acid, Trisodium Citrate, sodium benzoat and flavouring.

No. Batch : 436A111 B12

Produsen : PTAsia Health Energi Beverages Babakan Pari

No. Pendaftaran : 8886057 883672

(54)

(55)

(56)

(57)

Lampiran 28. Gambar alat – alat yang digunakan

Gambar 12. Instrument KCKT (Agilent)

Gambar 5Sonifikator (Branson 1510)

Gambar 5 Sonifikator (Branson 1510)

Gambar 13.Sonifikator (Branson 1510)