PENGUKURAN AKTIVITAS AMILASE PADA IKAN LELE
(Clarias batrachus) DAN IKAN NILEM (Osteochilus vittatus)
Oleh:
Nama : Nindya Nuraida Ayuningtyas
NIM : B1J014118
Rombongan : I Kelompok : 1
Asisten : Muthiara Nur Afifah LAPORAN PRAKTIKUM FISIOLOGI NUTRISI
KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO
I. PENDAHULUAN I.1 Latar belakang
Enzim adalah substansi yang dihasilkan oleh sel-sel hidup dan berperan sebagai katalisator pada reaksi kimia yang berlangsung dalam organisme. Katalisator adalah substansi yang mempercepat reaksi tetapi pada hasil reaksi, substansi tersebut tidak berubah. Enzim mempunyai ciri dimana kerjanya dipengaruhi oleh lingkungan. Salah satu lingkungan yang berpengaruh terhadap kerja enzim adalah pH. pH optimal enzim adalah sekitar pH 7 (netral) dan jika medium menjadi sangat asam atau sangat alkalis enzim mengalami inaktivasi (Gaman, 1994).
Aktivitas enzim pencernaan berkorelasi dengan jumlah enzim yang terdapat pada tempat pencernaan berlangsung. Aktivitas amilase dan protease dapat diketahui dengan cara mengukur banyaknya mikromol maltosa dan asam-asam amino (tirosin) yang dihasilkan per menit (Al Gadri et al., 2014). Salah satu enzim yang diperlukan untuk pertumbuhan adalah amilase. Amilase dapat diartikan sebagai segolongan enzim yang merombak pati, glikogen dan polisakarida yang lain. Tumbuhan mengandung α dan β amilase, hewan memiliki hanya α amilase, dijumpai dalam cairan pankreas dan juga (pada manusia dan beberapa spesies lain) dalam ludah. Amilase memotong rantai polisakarida yang panjang, menghasilkan campuran glukosa dan maltosa. Amilosa merupakan polisakarida yang terdiri dari 100-1000 molekul glukosa yang saling berikatan membentuk rantai lurus. Dalam air, amilosa bereaksi dengan iodin memberikan warna biru yang khas (Fox, 1991).
Amilase merupakan enzim yang paling penting dan keberadaanya paling besar, pada bidang bioteknologi, enzim ini diperjual belikan sebanyak 25% dari total enzim yang lainya. Amilase didapatkan dari berbagai macam sumber, seperti tanaman, hewan dan mikroorganisme. Amilase yang berasal dari mikroorganisme banyak digunakan dalam industri, hal ini dikarenakan mikroorganisme periode pertumbuhanya pendek. Amilase pertama kali yang diproduksi adalah amilase yang berasal dari fungi pada tahun 1894 (Salisbury, 1990).
Tujuan praktikum kali ini adalah mengukur perbedaan kapasitas pencernaan ikan yang terukur sebagai aktivitas amilase pada ikan yang diberi pemuasaan dan pemberian pakan.
II. MATERI DAN CARA KERJA 2.1 Materi
Alat yang digunakan adalah alat bedah, timbangan analitik, bak plastik, kertas
tissue, lempengen es, tabung reaksi, penangas air, kompor, nesting, botol sampel, homogenizer listrik, tabung appendorf, sentrifuge, freezer, pipet, spectrophotometry, micropipete, tip, dan vortex.
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah Ikan lele (Clarias
batrachus), Ikan nilem (Osteochilus vittatus), buffer fosfat, reagen DNS (asam
dinitrosalisilat), Tris-HCL buffer, ekstrak enzim, substrat amilum, dan akuabides.
Cara kerja yang digunakan dalam praktikum Pengukuran Aktivitas Protease Pada Ikan Lele (Clarias batrachus) Dan Ikan Nilem (Osteochilus vittatus) adalah sebagai berikut :
2.2.1 Preparasi Jaringan
1. Saluran digesti diisolasi dengan cara pembedahan lalu dibersihkan di atas
lempengen es.
2. Saluran digesti yang telah diisolasi kemudian ditimbang beratnya di
timbangan analitik.
3. 50 mM Tris-HCL buffer dingin ditambahkan pada saluran digesti dengan
rasio 1:8 dari berat saluran digesti.
4. Saluran digesti dilumatkan dengan homogenizer listrik.
5. Homogenant dipindahkan ke dalam tabung appendorf dan disentrifugasi
dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4oC.
6. Supernatan diambil dan disimpan pada suhu -80 oC pada freezer.
2.2.2 Pengukuran aktivitas Amilase
1. 0,1 Buffer fosfat dicampurkan ke dalam tabung sampel dan blanko sebanyak 350 µl.
2. Ekstrak enzim ditambahkan pada tabung sampel sebanyak 50 µl. 3. Tabung sampel dan blanko diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37oC.
4. Substrat amilum ditambahkan sebanyak 350 µl ke dalam tabung sampel dan blanko, lalu diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37oC.
5. Setelah inkubasi, pada tabung sampel dan blanko ditambahkan dengan 750 µl larutan DNS.
6. Ekstrak enzim ditambahkan sebanyak 50 µl pada tabung blanko.
7. Semua tabung sampel dan blanko dididihkan selama 5 menit pada suhu 100oC.
8. Tabung yang telah didihkan, kemudian didinginkan sampai larutan tersebut dingin kira-kira 20 menit, lalu ditambahkan akuabides sebanyak akuabides 1500 µl.
9. Campuran reaksi dihomogenkan menggunakan vortex.
10. Campuran reaksi diukur absorbansinya pada spektofotometer dengan panjang gelombang 540 nm.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Hasil
Tabel 3.1.1 Berat Usus Ikan yang dipuasakan dan Tidak dipuasakan
Kelompok Jenis Ikan
No. Eppendorf Sebelum sentrifugasi No. Eppendorf Setelah sentrifugasi Berat Usus (gr) Berat Tris-HCl (gr) 1 Lele makan 1-4 1-2 0,76 6,08 Lele puasa 5-8 3-4 0,32 2,56
2 Lele makanLele puasa 13-169-12 5-67-8 0,610,44 4,883,52 3 Nilem makanNilem puasa 17-2021-24 11-129-10 0,570,86 4,566,88 4 Nilem makanNilem puasa 25-2829-32 13-1415-16 0,890,63 7,125,04 5 Nilem makanNilem puasa 33-3637-40 17-1819-20 0,881,02 7,048,16 Tabel 3.1.2. Pengukuran Aktivitas Amilase
Nomor tabung Nilai absorbansi Konsentrasi
1 (Ikan makan) 2, 525 1, 305
2 (Ikan makan) 2, 555 1, 372
3 (Blanko ikan makan) 1, 954 0, 043
4 (Ikan puasa) 2, 211 0, 612
5 (Ikan puasa) 3, 327 3, 080
6 (Blanko ikan puasa) 2, 778 1, 866
Perhitungan:
Berat Tris-HCl = Berat usus x 8 Ikan lele makan = 0,76 x 8
= 6,08 gram Ikan lele puasa = 0,32 x 8
Aktivitas enzim dinyatakan dalam konsentrasi (X) =
Ikan Lele Makan = 1,305+ 1,372 – 0,043 2
= 1,2955 µg
Ikan Lele Puasa = 0, 612 + 3, 080 – 1, 866 2
= -0,02 µg
Aktivitas enzim dinyatakan dalam konsentrasi (X)/ menit
= x
Waktu inkubasi (15 menit)
Ikan Lele Makan = 1,2955 = 0,086 µg /menit 15
Ikan Lele Puasa = - 0,02
=
-0,0013 µg /menit 15Gambar 3.1.1 Hasil tabung sampel dan blanko setelah diinkubasi selama 5 menit pada suhu 100oC.
3.2 Pembahasan
Berdasarkan praktikum didapatkan hasil kelompok 1 rombongan 1 Hasil pengamatan aktivitas amilase pada ikan yang memperoleh perlakuan strategi pemberian pakan berbeda. yaitu aktivitas enzim amilase untuk ikan lele makan yaitu 1,2955 µg, sedangkan untuk ikan lele puasa yaitu -0,02 µg. Aktivitas enzim dinyatakan dalam konsentrasi (x)/menit untuk ikan lele makan yaitu 0,086 µg /menit dan untuk lele puasa yaitu -0,0013 µg /menit. Terdapat perubahan warna pada tabung sampal dan blanko yang telah didihkan selama 5 menit pada suhu 100oC dari yang
sebelumnya berwarna kuning menjadi merah kecoklatan yang berarti terdapat aktivitas enzim amilase. Perbandingan aktivitas enzim protease pada lele yang diberi pakan dan yang dipuasakan terlihat berbedaan yang sangat signifikan, terlihat bahwa laju aktivitas enzim amilase ikan lele yang dipuasakan lebih rendah dibandingkan dengan laju aktivitas enzim amilase ikan yang diberi pakan. Hal ini sesuai dengan pernyataan Eroldogan et al., (2008), yaitu aktivitas enzim digesti akan meningkat pada saat ikan berada pada fase pemberian pakan. Aktivitas amilase yang meningkat diduga juga berkaitan dengan meningkatnya peran pakan yang dikonsumsi sebagai stimulator aktivitas enzim. Adanya peningkatan aktivitas enzim sebagai akibat meningkatnya makanan dalam saluran digesti yang bertindak sebagai substrat. Aktivitas amilase pada intestine sangat dipengaruhi antara lain oleh jumlah amilase aktif yang ada, jumlah pakan (amilum) dan kualitas pakan serta pola makan bukan oleh ukuran (Al gadri et al., 2014).
Amilase adalah enzim yang menghidrolisis molekul pati menjadi polimer dekstrin dan unit glukosa yang lebih sederhana. Enzim amilase merupakan enzim yang memiliki peran penting dalam aplikasi bioteknologi mulai dari makanan, pembuatan bir, fermentasi, deterjen, tekstil industri serta kimia obat dan klinis (Singh et al., 2012). Aktivitas enzim pencernaan berkorelasi dengan jumlah enzim yang
terdapat pada tempat pencernaan berlangsung. Aktivitas amilase dan protease dapat diketahui dengan cara mengukur banyaknya mikromol maltosa dan asam-asam amino (tirosin) yang dihasilkan per menit. Aktivitas enzim pencernaan juga berkorelasi dengan jumlah enzim yang terdapat pada tempat pencernaan berlangsung, semakin banyak enzim yang bekerja pada organ pencernaan tersebut semakin tinggi pula aktivitasnya (Al gadri et al., 2014).
Amilase memotong rantai polisakarida yang panjang, menghasilkan campuran glukosa dan maltosa. Amilosa merupakan polisakarida yang terdiri dari 100-1000 molekul glukosa yang saling berikatan membentuk rantai lurus. Dalam air, amilosa bereaksi dengan iodine memberikan warna biru yang khas (Fox, 1991). Pada manusia, α amilase pada ludah dan pankreas berguna dalam hidrolisis pati yang terkandung dalam makanan ke dalam bentuk aligosakarida, di mana dalam perubahan tersebut dapat dihidrolisis oleh disakarida atau trisakarida dalam jumlah kecil. Contohnya, α amilase pada mamalia memiliki pH optimum 6-7, bergantung pada ada atau tidaknya ion halogen (Whitacker, 1994).
Perbedaan perlakuan uji aktivitas protease dengan uji aktifitas amilase yaitu pada uji aktifitas protease diukur menggunakan metode hidrolisis kasein. Sedangkan pada uji aktifitas amilase diukur dengan metode hidrolisis pati. Pada uji aktifitas protease menggunakan buffer 0,1 M Tris-HCl (pH 8-9). Sedangkan pada uji aktifitas amilase mengunakan buffer fosfat. Untuk menghentikan kerja enzim protease menggunakan reagen asam tricloroasetat (TCA), sedangkan untuk menghentikan kerja enzim amilase menggunakan reagen DNS (asam dinitrosalisilat). Reaksi enzim protease dimulai dengan cara mencampurkan 1 % (w/v) kasein (350 µl), buffer (350 µl) dan sampel enzim (50 µl) dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37 oC.
Reaksi dihentikan melalui penambahan 750 µl dari 8 % (w/v) asam tricloroasetat (TCA). Campuran reaksi diendapkan selama 15 menit dalam lemari pendingin, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 10 menit. Absorbansi dicatat pada panjang gelombang 280 nm. Sedangkan reaksi enzim amilase dimulai dengan cara mencampurkan substrat amilum (350 µl), buffer fosfat (350 µl) dan sampel enzim (50 µl) kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37oC.
Kemudian ditambahkan larutan DNS (750 µl), dan dididihkan selama 5 menit pada suhu 100oC. Campuran reaksi dibiarkan dingin lalu ditambahkan akuabides (350 µl).
Aktivitas amilase ditentukan dengan metode hidrolisis pati. Uji dilakukan mengunakan buffer fosfat. Campuran reaksi enzim dimulai dengan cara mencampurkan substrat amilum (350 µl), buffer fosfat (350 µl) dan sampel enzim (50 µl) kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37oC. Kemudian
ditambahkan larutan DNS (750 µl), dan dididihkan selama 5 menit pada suhu 100oC.
Campuran reaksi dibiarkan dingin lalu ditambahkan akuabides (350 µl). Absorbansi dicatat pada panjang gelombang 540 nm (Hidalgo et al., 1999).
Alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah alat bedah yang berfungsi untuk untuk membedah ikan dan mengisolasi ususnya, timbangan analitik untuk menimbang berat usus, bak plastik sebagai wadah untuk membedah ikan, kertas tissue untuk membersihkan area kerja, lempengan es untuk mencegah rusaknya jaringan serta menstabilkan pH, botol sampel sebagai wadah campuran reaksi, homogenizer listrik untuk menghancurkan usus dan mencampurkannya dengan larutan Tris-HCl, kompor untuk mendidihkan air, tabung appendorf sebagai wadah campuran reaksi, sentrifuge untuk memisahkan natan dan supernatan, freezer untuk menyimpan supernatan pada suhu suhu -80 oC, tabung reaksi untuk wadah
campuran reaksi, penangas air untuk tempat melakukan inkubasi, nesting untuk wadah mendidihkan air, mikropipet untuk memindahkan larutan-larutan dalam kadar mikro, pipet transfer untuk memindahkan larutan, spectrophotometry untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu objek kaca atau kuarsayang disebut kuvet, dan vortex Untuk mengaduk senyawa kimia yang ada dalam tabung reaksi atau wadah (Csuros, 1997)
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah Ikan lele (Clarias
batrachus), Ikan nilem (Osteochilus vittatus) sebagai objek preparat penelitian,
Tris-HCL buffer berfungsi menjaga buffer enzim agar tidak rusak dan penstabil pH, buffer fosfat berfungsi untuk penstabil pH, ekstrak enzim diinkubasi selama 10 menit berfungssi untuk mengaktifkan enzim dan diikubasi selama 15 menit berfungsi agar enzim berikatan dengan substrat, substrat amilum merupakan substrat untuk protease, akuabides berfungsi untuk mengenceran/pelarut, dan reagen DNS untuk memberikan reaksi kompleks yang membantu dalam pengukuran absorbansi larutan pada spektrofotometer dan berfungsi menghentikan kerja enzim, sehingga enzim tidak memecah pati (Lehnninger, 1995).
Preparat yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu Ikan lele dan nilem. ikan nilem (Osteochilus vittatus) termasuk ikan omnivora, karena ikan tersebut
memakan tumbuhan dan hewan yang menempel pada kerikil sebagai pakan alaminya. Sistem pencernaan pada ikan nilem dimulai di usus bagian depan bukan di bagian rongga mulut, sebab ikan nilem tidak memiliki kelenjar air liur yang dapat menghasilkan enzim saliva. Proses pencernaan dalam sistem pencernaan ikan nilem berlangsung secara biologis yang melibatkan peran enzim sebagai katalisator yang mampu mempercepat proses pencernaan (Harms et al., 1991). Ikan Lele (Clarias
batrachus) termasuk kelompok ikan siluroid yang seringdisebut catfish. Kelompok
ini mencakup jenis-jenis ikan yang bertulang keras denganciri-ciri bagian luar tidak bersisik, berkumis 2-4 pasang disekitar mulut, pada sirip dada terdapat sepasang duri (patil), dan juga pada sirip punggungnya, sedangkan bentuk sirip ekornya bervariasi menurut jenisnya (ada yang meruncing, berlekuk dan bercagak) (Fujaya, 2004).
Perbedaan ketersediaan pakan pada perbedaan perlakuan yang diterapkan memiliki efek pada respon fisiologi ikan yang dicerminkan oleh perubahan aktivitas protease. Umumnya enzim disekresi kaitannya dengan keberadaan pakan pada saluran digestinya, pada kondisi puasa atau tidak diberi pakan maka akan menjadikan ketiadaan senyawa penginduksi sekresi dan aktivitas enzim. Pada kondisi pemberian pakan, pakan yang berada pada saluran digesti akan bertindak sebagai penginduksi aktivitas enzim, sehingga aktivitas amilase akan meningkat (Hanum et al., 2013). Aktivitas amilase yang meningkat diduga juga berkaitan dengan meningkatnya peran pakan yang dikonsumsi sebagai stimulator aktivitas enzim. Adanya peningkatan aktivitas enzim sebagai akibat meningkatnya makanan dalam saluran digesti yang bertindak sebagai substrat (Eroldogan et al., 2008).
IV. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan, dapat disimpulkan bahwa ikan lele yang diberi makan memiliki aktivitas amilase lebih tinggi dibandingkan dengan ikan lele yang dipuasakan.
DAFTAR REFERENSI
Al Gadri, F.S., Susilo, U & Priyanto, S. 2014. Aktivitas Protease dan Amilase pada Hepatopankreas dan Intestine Ikan Nilem Osteochilus hasselti C.V. Scripta
Biologica, 1 (1), pp. 43-48.
Csuros M. 1997. Environmental Sampling and Analysis Lab Manual. Inggris: CRC Press
Eroldogan, O.T., Suzer, C., Tasbozan, O & Tabakoglu, S. 2008. The Effect of Rate Restricted Feeding Regimes in Cycles in Digestive Enzymes of Gilthehead Sea-brem, Sparus aurata. Turkish Journal of Fisheris and Aquatic Sciences, 8, pp. 49-54.
Fox, P.F. 1991. Food Enzymology Vol 2. London: Elsevier.
Fujaya, Y. 2004. Fisiologi Ikan Dasar Pengembangan Teknik Perikanan. Jakarta: Rineka Putra.
Gaman, P.M & Sherrington. 1994. Ilmu Pangan, Pengantar Ilmu Pangan, Nutrisi
dan Mikrobiologi. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada Press.
Hanum, W.H., Susilo, U., Piyanto, S. 2013. Aktivitas Protease dan Kadar Protein Tubuh Ikan Lele Dumbo (Clarias gariepinus) pada Kondisi Puasa dan Pemberian Pakan Kembali. Scripta Biologica.
Harms J, Anger K, Klaus S, Seeger B. 1991. Nutritional effects on ingestion ate, digstive enzyme activity, growth and biochemical composition of Hyas araneus L. (Dekapoda: Majidae) larvae. J. Exp. Mar. Biol. Ecol, 145, pp. 233-265.
Hidalgo MC, Urea E, Sanz A. 1999. Comparative study of digestive enzymes in fish with different nutritional habits. Proteolytic and amylase. Aquaculture, 170, pp. 267-283.
Lehninger, A.L. 1997. Dasar-dasar Biokimia. Jilid I. Jakarta: Erlangga.
Salisbury, F. B & Cleon. W., Ross. 1990. Fisiologi Tumbuhan. Bandung: Institut Teknologi Bandung.
Singh, P., Gupta, P., Singh, R & Sharma, R. 2012. Activity and stability of immobilized alpha-amylase produced by Bacillus acidocaldarius.
International Journal Of Pharmacy & Life Sciences, 3 (12), pp. 2247-2253.
Whitaker, J.R. 1994. Principle of Enzymology for the Food and Science. New York: Oxford University Press.
