17
BAB III. METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mitra Anggrek Indonesia, Desa Junrejo, Kecamatan Junrejo, Kota Batu, Malang pada bulan Juli 2020 - Februari 2021.
3.2. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan saat penelitian meliputi timbangan analitik, Laminar Air Flow Cabinet, Bunsen burner, hot plate dan magnetic stirer, pisau bedah, pinset, peralatan gelas dengan berbagai bentuk dan ukuran seperti pipet tetes, pipet ukur, beaker glass, gelas ukur, cawan petri, labu ukur, serta peralatan penunjang yaitu tissue, kapas, alumunium foil, kertas label, alat tulis, dan alat dokumentasi.
Bahan yang digunakan saat penelitan terdiri dari eksplan bakal tunas bawang putih varietas Lumbu Hijau, bahan-bahan kimia dan media tanam meliputi media Murashige dan Skoog (MS), zat pengatur tumbuh Tidiazuron (TDZ) dan Naphthalene Acetic Acid (NAA) aquades steril, sabun cuci, spirtus, alcohol 70 %.
3.3. Metode Penelitian 3.3.1. Rancangan Penelitian
Penelitian ini disusun menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan pola perlakuan faktorial dua faktor. Faktor yang pertama adalah konsentrasi TDZ yang terdiri dari 3 taraf yaitu :
T1 : 0.04 ppm.
T2 : 0.07 ppm.
T3 : 0.1 ppm.
18
Sedangkan faktor yang kedua adalah konsentrasi NAA yang terdiri dari 4 taraf meliputi :
N1 : 0.5 ppm.
N3 : 1 ppm.
N4 : 1.5 ppm.
Berdasarkan kedua faktor diatas maka diperoleh kombinasi perlakuan sebanyak 9 perlakuan yang kemudian diulang sebanyak 3 kali senhingga mendapatkan 27 unit pengamatan. Kombinasi perlakuan dapat digambarkan sebagai berikut :
Tabel 1. Tabel Kombinasi Perlakuan TDZ dan NAA
Kombinasi Pelakuan
Konsentrasi TDZ
T1 T2 T3
Konsentrasi NAA
N1 T1N1 T2N1 T3N1
N2 T1N2 T2N2 T3N2
N3 T1N3 T2N3 T3N3
3.4. Metode Penelitian
3.4.1. Tahap Persiapan 1. Sterilisasi Alat
Tahapan persiapan untuk sterilisasi alat adalah sebagai berikut:
a. Alat set pemotong (pisau bedah, pinset, gunting), botol kultur dan dan alat- alat gelas lainnya dicuci dengan detergen kemudian dibilas dengan air hingga bersih.
19
b. Alat set pemotong (pisau bedah, pinset, gunting), botol kultur dan dan alat- alat gelas lainnya dikeringkan di rak pengering hingga benar-benar kering.
c. Alat set pemotong (pisau bedah, pinset, gunting), botol kultur dan dan alat- alat gelas lainnya dibungkus menggunakan kertas hingga tertutup rapat.
Selanjutnya dilakukan proses sterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121ºC selama 10 menit.
2. Sterilisasi Ruang Kerja
Tahapan persiapan untuk sterilisasi ruang kerja adalah sebagai berikut:
a. Lantai ruangan disapu kemudian rak-rak dan peralatan di lap hingga bersih dari debu dan kotoran.
b. Lantai ruangan dipel menggunakan sabun khusus pel dan ditunggu hingga kering.
c. Kabin LAF (Laminar Air Flow) debersihkan dengan alkohol 70%, kemudian sebelum pemakaian sinar UV dinyalakan selama 60 menit.
3. Pembuatan Larutan Stok ZPT
Pembuatan Larutan Stok TDZ dan NAA dengan konsentrasi 100 ppm dilakukan dengan metode sebagai berikut:
a. Pembuatan Larutan Stok TDZ 100 ppm sebanyak 100 mL (Maulidina, 2020) dengan langkah sebagai berikut:
➢ TDZ padat ditimbang sebanyak 10 mg.
➢ Ditambahkan larutan dimethylsulfoxide (DMSO) 5% sebanyak 100 mL
➢ Dihomogenkan dengan stirrer di atas hot plate.
20
100 ppm x V1 = 0.5 ppm x 900 mL V1 = 0.5 𝑝𝑝𝑚 𝑥 900 𝑚𝐿
100 𝑝𝑝𝑚
V1 = 4.5 mL Diketahui :
C1 = 100 ppm V1 = Dicari C2 = 0.5 ppm V2 = 900 mL
➢ Larutan dipindahkan kedalam botol kaca tertutup dan dan disimpan didalam lemari pendingib. Pembuatan Larutan Stok NAA 100 ppm sebanyak 100 mL (Mutmainah, 2016) dengan langkah sebagai berikut:
➢ Ditimbang serbuk NAA sebanyak 10 mg.
➢ Ditambahkan aquades steril sebanyak 100 ml.
➢ Dihomogenkan sampai larutan tercampur merata.
➢ Larutan disimpan didalam botol kaca tertutup dan disimpan didalam lemari pendingin
Pengambilan larutan stok sesuai dengan konsentrasi perlakuan yang dibutuhakan dilakukan dengan menggunakan rumus pengenceran yaitu:
C
1.V
1=C
2.V
2Contoh pengaplikasian rumus tersebut dalam pengambilan dosis larutan stok TDZ 100 ppm untuk media perlakuan TDZ 0.5 ppm dengan asumsi perlakuan membutuhkan 900 ml dijelaskan sebagai berikut :
Keteranga:
C1 = Konsentrasi 1 V1 = Volume 1 C2 = Konsentrasi 2 V2 = Volume 2
21 4. Pembuatan Media Kultur
Langkah kerja pembuatan media kultur dikutip dari penelitian terdahulu oleh Mutmainah (2016) tentang pembuatan media MS ( Murasighe & Skoog) sebanyak 1 liter yaitu sebagai berikut :
a. Ditimbang Media Murasighe & Skoog (MS) sebanyak 4,43 gram, gula sebanyak 30 gram, dan agar sebanyak 7 gram untuk 1 liter larutan.
b. Bahan Media MS, gula serta ZPT yang telah ditakar sesuai perlakuan yang digunakan kemudian dilarutkan kedalam 1000 mL aquades kemudian dihomogenkan diatas hot plate dalam suhu ruang.
c. Dilakukan pengecekan pH dengan menggunakan kertas pH dan dilakukan penyesuaian pH. Jika pH berada dibawah 5,8 maka perlu dinaikan dengan ditambahkan larutan NaOH 0,1 N dan jika lebih dari 5,8 maka diturunkan dengan HCL 0,1 N.
d. Ditambahkan agar sebanyak 7 gram.
e. Media dipanaskan dengan hot plate dan terus diaduk hingga menididh f. Media yang telah mendidih dimasukkan kedalam botol kultur sesuai label
masing-masing perlakuan sebanyak 25 mL.
g. Botol kultur yang telah terisi media ditutup menggunakan plastik bening dan disegel meggunakan karet.
5. Sterilisasi Media
Media kultur yang telah dibuat kemudian disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 1210C pada tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
22 3.4.2. Tahap Pelaksanaan
1. Sterilisasi Bawang Putih (Allium sativum L.)
Tahap yang dilakukan dalam sterilisasi bawang putih adalah sebagai berikut:
1. Bawang putih utuh dikupas kulit bagian luar kemudian diambil bulbilnya.
2. Bulbil yang diperoleh kemudian dicuci dengan air biasa kemudian direndam dalam detergen 2 g/100mL selama 15 menit lalu dibilas dengan air mengalir selama 15 menit.
3. Bulbil bawang putih dibilas dengan aquades steril sebanyak 3 kali.
4. Direndam deengan larutan fungisida 2g/100mL selama 1 Jam dan dibilas dengan aquades steril sebanyak 3 kali.
5. Tahap selanjutnya bulbil direndam Clorox 10% selama 10 menit dan 5%
selama 5 menit.
6. Dibilas dengan aquades steril 1 kali.
2. Tahap Inisisasi (Penanaman)
Semua proses penanaman (inisiasi) dilakukan dalam keadaan steril di dalam LAF (Laminar air flow). Tahapan kerja yang dilakukan dalam pelaksanaan inisiasi adalah sebagai berikut :
a. Sterilisasi tangan dimulai dari luar LAF dengan disemprotkan 70%
alkohol dan dibersihkan dengan tisu dan alkohol 70%.
b. Seluruh alat dan bahan yang akan dimasukan kedalam LAF harus disemprot alkohol 70%.
c. Semua alat steril yang masih tertutup kertas disemprot alkohol 70%
kemudian dimasukkan kedalam LAF.
23
d. Alat-alat seperti pinset, gunting, pisau bedah yang diperlukan untuk kultur dicelup kedalam alkohol 96% dan dibakar dengan api Bunsen.
e. Perlatan diletakan diatas wadah steril (cawan petri) dan dibiarkan hingga dingin.
f. Eksplan bawang putih yang akan ditanam dipotong dan dibersihkan mengunakan pisau bedah dan pinset hingga tersisa bakal tunas yang ada didalam bulbil.
g. Eksplan yang telah bersih kemudian ditanam dalam media perlakuan dengan bantuan pinset dan peralatan yang tersedia.
h. Botol kultur yang telah ditanami kemudian ditutup dengan plastik dan disegel menggunakan karet.
i. Seluruh botol kultur berisi eksplan diinkubasi dalam ruang kultur pada suhu 230C. keadaan ruang kultur harus tetap steril dan terjaga kebersihannya.
3. Pengamatan
Pengamatan tanaman dilakukan dimulai dari hari penanaman dan dinyatakan dalam HSI (Hari Setelah Inisiasi). Pengamatan dilakukan selama 30 hari dengan mengamati hari munculnya tunas, jumlah tunas, jumlah daun, tinggi tunas, dan jumlah akar. Pengamatan seluruhnya dilakukan dari luar botol tanpa merusak sampel tanaman.
24
Pengamatan variabel pengamatan dilakukan sebagai berikut:
a. Waktu Awal Bertunas : Mencatat hari yang diperlukan untuk tunas mulai muncul setinggi 2 mm dimulai dari 1 hari setelah tanam pada semua perlakuan eksplan.
b. Jumlah Tunas : Dihitung 1 hari setelah tanam dengan menghitung berapa tunas yang tumbuh setinggi 2 mm setiap 3 hari sekali dan dicatat hingga 30 hari waktu pengamatan.
c. Jumlah Daun : Dihitung 1 hari setelah tanam dengan menghitung berapa daun yang tumbuh setinggi 1 cm setiap 3 hari sekali dan dicatat hingga 30 hari waktu pengamatan.
d. Tinggi Tanaman : Dilakukan dengan mengukur rerata tinggi tanaman dari pangkal sampai ujung daun tertinggi dengan satuan sentimeter (cm) menggunakan alat ukur penggaris tanpa mengeluarkan tunas dari botol dan dilakukan pada hari ke 14 dan 30 setelah tanam.
e. Jumlah Akar : Dihitung 1 hari setelah tanam dengan menghitung berapa akar yang tumbuh sepanjang 1 mm setiap 3 hari sekali dan dicatat hingga 30 hari waktu pengamatan.
3.4.3. Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisa menggunakan Two way Analysis of Variance (ANOVA) dengan bantuan aplikasi Minitab 19 untuk mengetahui pengaruh antar setiap perlakuan. Apabila ditemukan perbedaan nyata dari data tersebut maka dilakukan uji lanjut Honest Significant Difference (HSD) pada taraf 5%.
