3 METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret-Agustus 2011. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan; Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan; Laboratorium Histopatologi, Ruang Diskusi Histopatologi, Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi (KRP), Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Alat dan Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan utama berupa jeroan (usus, hati, dan ginjal) ikan bandeng (Chanos chanos). Ikan bandeng yang diamati adalah ikan bandeng yang disimpan pada suhu chilling. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis proksimat meliputi H2SO4
(MERCK p.a.), kjeltab Selenium (MERCK p.a.), NaOH (MERCK p.a.), H3BO3
(MERCK p.a.), n-heksana (MERCK p.a.), dan HCl (MERCK p.a.). Bahan-bahan yang digunakan untuk pembuatan preparat histologi terdiri dari larutan Buffer Normal Formalin (BNF) 10% (MERCK p.a.), Bouin’s 10% (MERCK p.a.), alkohol 50-100% (MERCK p.a.), xylol (MERCK p.a.), parafin (MERCK p.a.), hematoksilin (MERCK), eosin (MERCK), dan mounting agent (MERCK).
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi soxhlet (SIBATA SB 6), tabung kjeldahl (PYREX), tanur pengabuan (Yamato FM 38), timbangan analitik (AND HF 400), oven (Yamato DV 40), cetakan yang terbuat dari kertas kalender, rotary mikrotom (Yamato Kohki LR-85), mikroskop cahaya (Olympus BH52), Microcular MD 130 Electron Eyepiece, serta kamera digital (Canon A495). Alat lainnya yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan uji organoleptik.
3.3 Metode Penelitian
Ikan bandeng yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari areal tambak di daerah Kampung Melayu, Teluk Naga, Tanjung Pasir, Kabupaten Tangerang-Banten. Bobot ikan yang diamati berkisar antara 200-250 gram dan
berumur sekitar 4 bulan. Ikan tersebut diambil menggunakan pancing. Setelah ditangkap, ikan langsung dimatikan dengan cara menusuk kepala bagian medula oblongata. Sebagian ikan diambil jeroannya dan dilakukan uji proksimat (kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, dan kadar karbohidrat). Ikan lainnya disimpan pada suhu chilling (±5 ºC) selama 17 hari (sampai ikan busuk). Ikan yang disimpan tersebut dibuka dibagian perut dan dilakukan pengamatan organoleptik setiap hari. Pengujian organoleptik dilakukan menggunakan
scoresheet berdasarkan dinding perut dan jeroan ikan segar (Laporan Penelitian
Lembaga Teknologi Perikanan, No. 2 1973 diacu dalam Ilyas 1983). Pengamatan dan pembuatan preparat histologis dilakukan pada setiap fase kemunduran mutu (prerigor, rigor, postrigor, dan busuk). Pembuatan preparat histologis menggunakan metode parafin (Angka et al. 1990). Tahapan penelitian dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6 Diagram alir penelitian. Ikan bandeng
Dimatikan
Analisis proksimat
Penyimpanan pada suhu chilling (±5 ºC) selama 17 hari
Prerigor Rigor Postrigor Busuk
Analisis histologi
Uji organoleptik setiap 24 jam
3.3.1 Uji organoleptik
Pengujian organoleptik dilakukan menggunakan scoresheet berdasarkan dinding perut dan jeroan ikan segar (Laporan Penelitian Lembaga Teknologi Perikanan, No. 2 1973 diacu dalam Ilyas 1983) (Lampiran 1). Pengujian organoleptik merupakan cara pengujian kesegaran ikan yang bersifat subjektif dengan menggunakan indera yang ditujukan pada mata, insang, lendir permukaan badan, daging, bau, tekstur, dan isi perut (jeroan) sampel ikan. Beberapa syarat yang harus dipenuhi oleh panelis untuk uji organoleptik (SNI 01-2346-2006), antara lain tertarik dan mau berpartisipasi dalam uji organoleptik, terampil dan konsisten dalam mengambil keputusan, siap sedia pada saat dibutuhkan dalam pengujian, tidak menolak contoh yang akan diuji, berbadan sehat, bebas dari penyakit THT dan tidak buta warna (psikologis), tidak sedang merokok, serta jumlah panelis minimum untuk satu kali pengujian adalah 15 orang (panelis semi terlatih). Data yang diperoleh, kemudian dilakukan analisis kesegaran ikan dengan kriteria :
Segar : nilai organoleptik berkisar 7-9 Agak segar : nilai organoleptik berkisar 5-6 Tidak segar : nilai organoleptik berkisar 1-3 3.3.2 Analisis proksimat
Analisis proksimat merupakan metode analisis kimia untuk mengidentifikasi kandungan nutrisi pada suatu bahan. Analisis proksimat terhadap jeroan ikan bandeng meliputi penentuan kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, dan kadar karbohidrat (by difference). Prosedur uji proksimat adalah sebagai berikut: (1) Analisis kadar air (AOAC 2005)
Tahap pertama yang dilakukan pada analisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu (102-105) oC selama 30 menit. Cawan tersebut diletakkan dalam desikator (kurang lebih 40 menit) hingga dingin kemudian ditimbang sampai beratnya konstan. Sampel sebesar 5 gram kemudian ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan. Cawan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 150 oC selama 8 jam hingga diperoleh bobot konstan. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan
sampai dingin kemudian ditimbang. Perhitungan kadar air jeroan ikan bandeng ditentukan dengan rumus :
Keterangan :
A = Berat cawan kosong (gram)
B = Berat cawan yang diisi sampel (gram)
C = Berat cawan dengan sampel yang sudah dikeringkan (gram) (2) Analisis kadar abu (AOAC 2005)
Cawan abu porselen dibersihkan dan dikeringkan di dalam oven bersuhu 105 oC selama 30 menit. Cawan abu tersebut kemudian dimasukkan ke dalam desikator (30 menit) dan ditimbang. Sampel sebesar 5 gram ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan abu porselen. Selanjutnya dibakar di atas kompor listrik sampai tidak berasap dan dimasukkan ke dalam tanur pengabuan (600 oC) selama 7 jam. Cawan dimasukkan ke dalam desikator dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Perhitungan kadar abu jeroan ikan bandeng ditentukan dengan rumus :
Keterangan :
A = Berat cawan abu porselen kosong (gram)
B = Berat cawan abu porselen dengan sampel (gram)
C = Berat cawan abu porselen dengan sampel setelah dikeringkan (gram) (3) Analisis kadar lemak (AOAC 2005)
Sampel sebesar 5 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring dan selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W2) dan disambungkan dengan perangkat soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor perangkat soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak kemudian dipasang pada perangkat soxhlet lalu dipanaskan pada suhu 40 oC menggunakan pemanas listrik selama 16 jam. Pelarut lemak yang ada di dalam labu lemak didestilasi hingga semuanya menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak. Selanjutnya labu lemak dikeringkan
dalam oven pada suhu 105 oC dan didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W3). Perhitungan kadar lemak jeroan ikan bandeng ditentukan dengan rumus :
Keterangan :
W1 = Berat sampel (gram)
W2 = Berat labu lemak tanpa lemak (gram) W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram) (4) Analisis kadar protein (AOAC 2005)
Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari destruksi, destilasi dan titrasi.
(a) Tahap destruksi
Jeroan ikan bandeng ditimbang sebesar 1 gram kemudian sampel tersebut dimasukkan ke dalam tabung kjeldahl. Sebanyak 0,25 gram selenium dan 3 ml H2SO4 pekat ditambahkan ke dalam tabung tersebut. Tabung yang berisi larutan
tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas. Proses destruksi dilakukan sampai larutan berwarna bening .
(b) Tahap destilasi
Isi labu dituangkan ke dalam labu destilasi lalu ditambahkan akuades 50 ml, air bilasan juga dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan larutan NaOH 40% sebanyak 20 ml. Cairan dalam ujung tabung kondensor ditampung dalam erlenmeyer 10 ml berisi larutan H3BO3 dan 2 tetes indikator (cairan methyl
red dan bromo cresol green) yang ada di bawah kondensor. Destilasi dilakukan
sampai diperoleh 10 ml destilat dan berwarna hijau kebiruan. (c) Tahap titrasi
Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan erlenmeyer berubah menjadi merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Perhitungan kadar protein jeroan ikan bandeng ditentukan dengan rumus :
(5) Analisis kadar karbohidrat (AOAC 2005)
Kadar karbohidrat ditentukan dengan cara by difference, yaitu hasil pengurangan dari 100% dengan kadar air, kadar abu, kadar lemak, dan kadar protein. Perhitungan kadar karbohidrat jeroan ikan bandeng ditentukan dengan rumus :
Karbohidrat (%) = 100% - (% kadar air - % kadar abu - % kadar protein - % kadar lemak)
3.3.3 Pembuatan preparat
Menurut Angka et al. (1990), pembuatan preparat histopatologi terdiri dari tiga tahapan besar yaitu fiksasi jaringan dan parafinisasi, pemotongan jaringan, serta pewarnaan jaringan (Lampiran 2).
(1) Fiksasi jaringan dan parafinisasi (a) Fiksasi
Fiksasi adalah tahapan yang dilakukan untuk mencegah autolisis dan dekomposisi postmortem dari suatu jaringan atau organ. Fiksasi juga bertujuan untuk mengawetkan morfologi dan komposisi jaringan sehingga jaringan tetap seperti pada keadaan semula sewaktu hidup juga mengeraskan jaringan agar dapat diiris serta mencegah jaringan larut selama proses pembuatan preparat. Larutan fiksatif yang digunakan adalah larutan BNF 10%. Jaringan direndam dalam larutan fiksatif ini selama 48 jam. Perendaman dilakukan di dalam botol film dengan volume larutan fiksatif sebanyak 15-20 kali volume jaringan.
(b) Dehidrasi
Dehidrasi merupakan proses untuk mengeluarkan cairan dari dalam sel dengan cara merendam jaringan yang telah difiksasi ke dalam alkohol dimulai dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi. Pertama jaringan direndam dalam alkohol 70% selama 24 jam. Perendaman dilakukan dalam botol film yang telah digunakan untuk perendaman dengan larutan fiksatif. Larutan fiksatif dibuang terlebih dahulu, kemudian alkohol dengan konsentrasi 70% dimasukkan ke dalam botol film hingga jaringan terendam. Selanjutnya organ diambil dari botol film dan dibungkus menggunakan kain kasa. Kemudian kain kasa diikat menggunakan benang yang dibentuk seperti teh celup agar memudahkan dalam proses pergantian alkohol. Setelah 24 jam, organ yang dibungkus kain kasa diambil dan
ditiriskan diatas kertas tisu. Kemudian organ tersebut dimasukkan ke dalam botol berisi alkohol 80%, 90%, 95%, 95% masing-masing selama dua jam dan alkohol 100% selama 12 jam dengan cara yang sama. Perendaman dilakukan pada suhu ruang.
(c) Clearing
Clearing merupakan proses penjernihan yang bertujuan untuk menggantikan
alkohol dan sekaligus menambahkan clearing agent (xylol) yang berfungsi sebagai pelarut parafin. Jaringan direndam dalam alkohol-xylol (1:1) selama 30 menit. Perendaman dilakukan sama halnya seperti pada perendaman dengan alkohol pada suhu ruang.
(d) Impregnasi
Selanjutnya dilakukan tahap impregnasi, yaitu penggantian xylol dengan parafin cair yang berlangsung di dalam oven dengan suhu 60 oC. Proses ini dilakukan dengan perendaman jaringan ke dalam xylol-parafin (1:1) yang diletakkan dalam gelas piala selama 45 menit. Proses perendaman dilakukan dengan cara yang sama seperti proses perendaman sebelumnya.
(e) Embedding
Embedding merupakan proses untuk memasukkan parafin cair ke dalam sel.
Proses ini berlangsung di dalam oven dengan suhu 60 oC. Titik cair parafin, yaitu 54 oC-58 oC. Proses ini bertujuan agar parafin menyusup ke dalam seluruh celah antar sel dan bahkan ke dalam sel sehingga jaringan lebih tahan saat pemotongan. Jaringan direndam secara berturut-turut ke dalam gelas piala yang berisi parafin I, parafin II, parafin III masing-masing selama 45 menit. Proses perendaman dilakukan dengan cara yang sama seperti proses perendaman sebelumnya.
(f) Blocking
Jaringan yang telah dilakukan proses embedding menggunakan parafin cair lalu diblok (dicetak agar mudah dipotong) dengan parafin cair, kemudian dibekukan. Proses ini membutuhkan cetakan yang dapat dibuat dari kertas yang kaku, seperti kertas kalender dengan ukuran 2x2x2 cm3. Parafin cair dituangkan ke dalam cetakan hingga memenuhi sekitar 1/8 bagian cetakan dan dibiarkan hingga sedikit membeku. Setelah itu, jaringan disusun dalam cetakan dan dituangi
parafin cair hingga material jaringan terendam. Selanjutnya dibiarkan beku dalam suhu ruang selama 24 jam.
(g) Trimming
Setelah parafin beku dengan sempurna, blok parafin dikeluarkan dari cetakan lalu ditrimming menggunakan silet bermata satu agar dapat disesuaikan dengan tempat blok pada alat pemotong.
(2) Pemotongan jaringan
Pemotongan jaringan dilakukan menggunakan mikrotom. Ketebalan sayatan, yaitu 4 mikrometer. Teknik pemotongan parafin yang menggandung preparat adalah sebagai berikut:
(a) Blok parafin yang mengandung preparat diletakkan pada tempat duduknya di mikrotom. Tempat duduk blok parafin beserta blok parafinnya kemudian diletakkan pada pemegangnya (holder) pada mikrotom dan dikunci dengan kuat. Mata pisau mikrotom harus tajam agar proses pemotongan dapat dilakukan dengan sempurna.
(b) Ketebalan potongan diatur dengan cara menggeser bagian pengatur ketebalan hingga ketebalan yang diinginkan. Ketebalan sayatan, yaitu 4 mikrometer. (c) Blok preparat digarakkan ke arah pisau sedekat mungkin lalu blok preparat
dipotong secara teratur dan ritmis. Pita-pita parafin yang awal tanpa jaringan dibuang hingga diperoleh potongan yang mengandung preparat jaringan. (d) Hasil irisan diambil dengan jarum lalu diletakkan di permukaan air hangat
dalam 45-50 oC waterbath hingga mengembang.
(e) Setelah pita parafin terkembang dengan baik, pita parafin ditempelkan pada gelas obyek yang telah diberi zat perekat seperti albumin dengan cara memasukkan kaca obyek itu ke dalam waterbath dan menggerakkannya ke arah pita parafin. Setelah merekat, gelas obyek digerakkan keluar dari
waterbath dengan hati-hati dan dibiarkan hingga mengering.
(3) Pewarnaan jaringan (a) Dewaxing
Sebelum dilakukan dewaxing, gelas obyek yang berisi jaringan diletakkan dalam keranjang preparat yang ukurannya sesuai dengan gelas obyek. Keranjang tersebut dapat diisi dengan 10 gelas obyek. Dewaxing merupakan proses untuk
mengeluarkan parafin. Wadah perendaman berupa wadah berbentuk persegi panjang dengan ukurannya sesuai dengan keranjang untuk gelas obyek. Jaringan pada gelas obyek yang telah diletakkan dalam keranjang direndam ke dalam xylol 1 dan xylol II masing-masing 2 menit. Lilin akan terlepas dari jaringan dan jaringan akan tampak jernih.
(b) Hidrasi
Hidrasi merupakan proses pemasukan air ke dalam preparat jaringan pada gelas obyek setelah proses dewaxing. Jaringan pada gelas obyek yang sebelumnya telah melalui proses dewaxing kemudian direndam dalam alkohol 100% dalam wadah perendaman, seperti pada proses dewaxing sebanyak dua kali, lalu secara berturut-turut dimasukkan ke dalam alkohol 95%, 90%, 80%, 70%, dan 50% masing-masing selama dua menit dengan cara yang sama pula. Setelah itu, preparat jaringan direndam ke dalam akuades selama dua menit.
(c) Pewarnaan hemaktosilin-eosin
Setelah hidrasi, preparat jaringan diberi pewarna hemaktosilin-eosin. Pertama, preparat jaringan direndam dengan pewarnaan hemaktosilin selama 7 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 7 menit untuk menghilangkan kelebihan zat warna yang tidak diserap. Selanjutnya preparat jaringan direndam dengan pewarna eosin selama 3 menit dan dicuci dengan akuades.
(d) Dehidrasi
Preparat jaringan kemudian direndam dalam alkohol 70%, 85%, 90%, dan 100% masing-masing dilakukan selama dua menit. Selanjutnya preparat jaringan direndam dalam xylol I dan xylol II masing-masing selama dua menit. Alat dan proses perendaman yang dilakukan sama seperti proses perendaman sebelumnya. (e) Mounting
Preparat jaringan yang telah diwarnai dapat dibuat preparat yang lebih awet dengan cara mounting menggunakan mounting agent atau Canada Balsam. Preparat jaringan ditutup dengan gelas penutup dan dikeringkan selama 24 jam, kemudian diamati dibawah mikroskop.
3.3.4 Pemeriksaan preparat histologi
Pengamatan preparat awetan dilakukan dengan mikroskop cahaya Olympus BH52 dengan perbesaran 400x. Proses pengambilan gambar dilakukan dengan
Micro Ocular MD 130 Electron Eyepiece. Diagram alir pembuatan preparat jeroan ikan bandeng (Chanos chanos) dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7 Diagram alir pembuatan preparat jeroan (hati, ginjal, usus) ikan bandeng (Chanos chanos).
Pemotongan bagian jeroan (hati, ginjal, dan usus)
Fiksasi dengan larutan BNF 10%
Penjernihan (clearing) dengan alkohol-xylol (1:1) Dehidrasi dengan alkohol berseri
Impregnasi dengan xylol-parafin (1:1)
Pembenaman (embedding) dalam parafin
Perekatan jaringan dengan mounting agent Pewarnaan hematoksilin-eosin Pelekatan pita parafin pada gelas obyek
Pemotongan dengan mikrotom
Trimming
Pengamatan dengan mikroskop Preparat awetan
Pengambilan gambar Ikan bandeng
3.4 Analisis Data
Analisis data dilakukan terhadap hasil pengukuran terhadap nilai organoleptik jeroan ikan bandeng (Chanos chanos) dan preparat histologis. Analisis hasil pengukuran organoleptik jeroan ikan bandeng dilakukan untuk mencari nilai rata-ratanya. Preparat histologi dianalisis untuk mengetahui gambaran jeroan ikan bandeng secara histologis.
3.4.1 Organoleptik
Hasil pengukuran terhadap nilai organoleptik jeroan ikan bandeng (Chanos
chanos) dicari nilai rata-ratanya Nilai rata-rata tersebut dihitung menggunakan
rumus berikut (BSN 2006):
X=
Keterangan: X : nilai rata-rata Xi : nilai X ke-i N : jumlah data 3.4.2 HistologiGambaran histologis dianalisis secara deskriptif kualitatif dengan melihat preparat histologi di bawah lensa mikroskop. Hasil yang diperoleh dibandingkan dengan jaringan ikan normal secara umum.
Pewarnaan histologi pada umumnya menggunakan kombinasi hematoksilin dan eosin (HE). Hematoksilin dan eosin adalah metode pewarnaan yang berfungsi ganda. Pertama memungkinkan pengenalan komponen jaringan tertentu dengan cara memulasnya secara differensial. Kedua, dapat memulas dengan tingkat atau derajat warna berbeda yang menghasilkan kedalaman pulasan yang berbeda. Hematoksilin berasal dari ekstrak dari pohon yang diberi nama logwood tree. Pada pulasan H & E, kompleks warna hemaktosilin berwarna ungu tua. Pewarna eosin memberikan warna merah muda sampai merah pada komponen jaringan yang tidak terpulas ungu-biru oleh hemaktosilin. Hematoksilin bekerja sebagai pewarna basa. Zat ini mewarnai unsur basofilik pada jaringan. Eosin bersifat asam serta memulas komponen asidofilik pada jaringan (Cormack 1992).
Mounting adalah suatu proses perekatan sayatan jaringan pada kaca sediaan
menggunakan bahan perekat (adhesive). Proses mounting dilakukan menggunakan
mounting media. Mounting media merupakan zat pengisi antara preparat yang
telah diwarnai dengan kaca penutup. Terdapat dua jenis mounting media, yaitu dalam bentuk resin dan cairan. Resin media terdiri dari tiga tipe, yaitu alami, semi sintetis, dan sintetis sepenuhnya. Contoh resin media adalah Canada Balsam. Canada balsam merupakan mounting alami yang terdiri dari komponen volatil, yaitu resin yang merupakan cairan kental berwarna kuning dan meleleh ketika dipanaskan. Balsam yang dikeringkan akan berbentuk padat dan harus ditambahkan xylene sehingga dapat digunakan sebagai mounting media. Komponen tak jenuh dalam resin membuat Canada balsam sebagai agen pereduksi ringan. Oleh karena itu, media Canada balsam dapat mempertahankan warna pada preparat awetan histologi lebih dari satu bulan atau satu tahun. Contoh
mounting media dalam bentuk cairan, antara lain Gliserol jelly, Buffer gliserol
dengan PDD, fructose syrup, dan Apathy’s medium (Cormack 1992).
Penutupan kaca obyek dilakukan dengan menutupkan kaca penutup di atas sajian, sehingga apabila xylol dalam media penjernih menguap maka kaca penutup melekat erat dengan kaca obyek. Hal ini dilakukan agar permukaan yang dihasilkan tidak menyebabkan pantulan cahaya selama pengamatan mikroskopis (Geneser 1994).
