ELECTROPHORESIS FOOD ANALYSIS AND BIOCHEMISTRY- PRACTICE ENDRIKA WIDYASTUTI MOCH. NURCHOLIS FOOD AND SCIENCE TECHNOLOGY UNIVERSITY OF BRAWIJAYA 2012

(1)

ELECTROPHORESIS

FOOD ANALYSIS AND

BIOCHEMISTRY-PRACTICE

ENDRIKA WIDYASTUTI MOCH. NURCHOLIS

FOOD AND SCIENCE TECHNOLOGY UNIVERSITY OF BRAWIJAYA 2012

(2)

Electrophoresis

• Separation into bands

due to

friction

through the gel and

charge

on protein.

• Magnitude of charge

and voltage will also

determine how far the

protein will travel in

the electrical field.

• Smaller

proteins tend

to move

faster

(3)

Why Electrophoresis ???

• Quantiative analysis and fractination

of biological fluids

• Characterization

of

purified

components

• Detection and characterization of

(4)

Type of Electrophoresis

• Moving boundary

electrophoresis

• Zone electrophoresis

• SDS Disk Electrophoresis

• Paper electrophoresis

• SDS-PAGE

(5)

Electrophoresis- SDS Page

Separation based on

size

.

– Protein berikatan dengan SDS to become

negatively charged.

– SDS =

sodium dodecyl sulfate

=>

anionic detergent

(negative charge)

– Proteins move through gel matrix to the anode

(electrical pole with a positive charge).

– The

RATE

they move is based on

size

.

– Good for determining

protein composition

,

(6)

(7)

• Prinsip Analisis :

Suatu metode untuk memisahkan makromolekul seperti asam nukleat dan protein berdasarkan ukuran, muatan listrik dan ciri fisik.

• Tujuan :

• Mengetahui prinsip dasar pemisahan protein

dengan metode elektroforesis

• Menentukan berat molekul kasein

(8)

ELEKTROFORESIS SDS-PAGE

• Protein  mempunyai muatan positif dan negatif

• Muatan listrik  menyebabkan protein bergerak ke

elektroda melewati gel poliakrilamid

• Gel  memisahkan molekul berdasarkan :

1. Ukuran

2. Bentuk molekul

3. Kekuatan medan listrik

4. Sifat hidrofobik relatif sampel 5. Kekuatan ionik.

Poliakrilamid  memisahkan Protein MW 0,5-250 kDa  memisahkan DNA 5-2000 bp

(9)

Isoelectric Point (pI)

• Setiap protein memiliki (pI), kondisi dimana

protein tidak bermuatan sehingga tidak terjadi

perpindahan.

• pH dimana protein tidak bermuatan

• Protein dikatakan basa, asam atau netral

tergantung pada muatan protein pada pH fisiologis

• Nilai pH

dibawah

pI  protein berpindah

sebagai kation(-) mobility increasing with

decreasing

pH

• Nilai pH

diatas

pI  protein berpindah sebagai

anion(+), mobility increasing with

increasing

pH

(10)

Media for Electrophoresis

• Paper strip

• Cellulose acetate

• Agar

• Starch

• Polyacrylamide gels (PAGE)  molecular

sieving is utilized to great advantage.

• PAGE  Size, shape and electrophoretic

(11)

MARKER

• LMW (Low Molecular Weight)  14,4-97kDa

• HMW-SDS (High Molecular Weight)  53-220

kDa

• HMW-Native  66-669 kDa

• Peptide marker kit (Horse myoglobin peptides) 

Mr = 2,5-17 kDa

(12)

LMW Marker

Protein Mr (kDa) Source Amount (µg)

Phosphorylase b 97 Rabbit muscle 67

Albumin 66 Bovine serum 83

Ovalbumin 45 Chicken egg white 147

Carbonic anhydrase 30 Bovine erythocyte 83

Trypsin inhibitor 20,1 Soybean 80

(13)

HMW-SDS Marker

Myosin 220 Rabbit muscle 25

α-2-Macroglobulin 170 Bovine plasma 100

β-Galactosidase 116 Escherchia coli 16

Transferrin 76 Human 17

Glutamate

dehydrogenase

(14)

HMW-Native Marker

Thyroglobulin 669 Porcine thyroide 76

Ferritin 440 Equine spleen 50

Catalase 232 Bovine liver 36

Lactate dehydrogenase 140 Bovine heart 48

(15)

Bahan-Bahan

• Sampel 

Kasein

• Buffer

 Bufer Tris-Cl 0,5 M pH 6,8 ; SDS 2% ;

Merkaptoetanol 0,05%

• Larutan stock

Akrilamid

30%  29.2 gram

akrilamid ditambah 0.8 gram N’N’-bis-methylene

acrylamid dalam 100 ml aquades.

(16)

Bahan-Bahan

• Larutan SDS 10 %

• Amonium persulfat (APS) 10% (di buat setiap akan digunakan)

• TEMED

• Larutan Pewarna (Staining)  0.1 % commasie blue dalam larutan metanol : air : asam asetat (5:5:2)

• Larutan Pembilas (destaining)  metanol : air : asam asetat (5:5:2)

(17)

Alat

• Seperangkat alat elektroforesis

• Mikropipet

• Tip

• Beker glass 100 ml

• Beker glas 50 ml

• Eppendorf

• Shaker

(18)

(19)

Prosedur Kerja

Pembuatan gel :

• Pasanglah alat gelas untuk mencetak gel ke tempat yang disediakan (seperti gambar 4.)

• Untuk membuat 20 ml gel 20% campurkan 13.3 ml larutan stok akrilamid 30%, 5 ml buffer Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8, 0.2 ml SDS 10%, 1.5 ml aquades.

• Tambahkan segera 100 µl APS 10% dan TEMED 10 µl • Aduk hingga tercampur merata

• Tuangkan ke dalam cetakan gel dengan menggunakan mikropipet hingga tinggi yang dikehendaki. Beri sisa tempat untuk stacking gel di bawah area peletakan gigi sisir.

(20)

Polyacrylamide Gel

Cathode

Anode

(21)

Prosedur Kerja

• Tuangkan aquades dengan mikropipet ke permukaan gel pemisah dan kemudian buang aquades tersebut dengan menyerapkan tisu

• Sementara itu buat lagi gel untuk membuat 4 ml stacking gel 4% dengan mencampur 1.2 ml larutan stok akrilamid 30%, 0.5 ml buffer Tris-HCl 6.8, 40 µl SDS 20%, 2.26 ml aquades.

• Tambahkan segera 20 µl 10% APS dan 5 µl TEMED. • Tuangkan larutan ke atas gel pemisah

• Sisipkan gigi sisir pada stacking gel dengan perlahan, jangan sampai terbentuk gelembung.

• Biarkan gel terpolimerisasi selama 15-30 menit dalam suhu ruang • Ambillah sisir secara perlahan dari gel.

• Pindahkan gel secara perlahan ke dalam tank elektroforesis (seperti gambar 5.)

(22)

(23)

(24)

(25)

Prosedur Kerja

• Persiapan sampel

• Larutkan 0.1 gram kasein ke dalam 4.9 gram sampel buffer • Panaskan pada suhu 90o_{C selama 5 menit.}

• Pemisahan protein dengan elektroforesis

• Masukkan sampel ke dalam sumuran sebanyak 5 µl • Pasanglah elektrode sesuai dengan warnanya.

• Gel dijalankan pada tegangan 200 V selama 45 menit atau hingga sampel telah mencapai bagian dasar.

(26)

Pemisahan Molekul Berdasarkan Berat Molekul dan

Muatan

(27)

(28)

Pewarnaan Gel

• Hentikan listrik, pindahkan gel dari tank • Pindahkan glass plate dari gel kedua sisi

• Tuangkan larutan pewarna pada gel dalam wadah

• Tutup dengan plastik dan letakkan di atas shaker selama 15-30 menit

• Pindahkan larutan pewarna dari gel. Simpan untuk digunakan kembali.

• Bilas gel dengan aquades

• Tuangkan larutan pembilas selama dan masukkan potongan kertas saring, biarkan selama 10-15 menit di atas shaker

• Ganti larutan pembilas dengan yang baru hingga yang terlihat pada gel adalah pita-pita protein.

(29)

Pengamatan

Amati pita-pita yang terbentuk pada gel elektroforesis.

Cari dalam literatur berat molekul masing-masing

komponen penyusun kasein dan tentukan letak

komponen tersebut pada pita gel elektroforesis.

(30)

Hasil SDS-PAGE

(31)

(32)

Protein gel (SDS-PAGE) that has been

stained with Coomassie Blue.

(33)

MATERI

(34)

SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel

Electrophoresis)

• SDS-PAGE,

sodium dodecyl sulfate polyacrylamide

gel electrophoresis, is a technique widely used in

biochemistry,

forensics, genetics and molecular biology:

• to separate proteins according to their

electrophoretic mobility (a function of length of

polypeptide chain or molecular weight).

• to separate proteins according to their size, and no

other physical feature.

(35)

Fig.1Before SDS: Protein (pink line) incubated with the denaturing detergent SDS showing negative and

positive charges due to the charged R-groups in the protein.

The large H's represent hydrophobic domains where nonpolar R-groups have collected in an attempt to get away from the polar water that surrounds the protein.

After SDS: SDS disrupt hydrophobic areas (H's) and coat proteins with many negative charges which overwhelms any positive charges the protein had due to positively charged R-groups.

The resulting protein has been denatured by SDS (reduced to its primary structure-aminoacid sequence) and as a result has been linearized.