periodontal temasuk karies gigi masih banyak terjadi di kalangan masyarakat dunia. Hal ini disebabkan oleh faktor dalam, yaitu kehigienisan mulut dan gigi serta faktor luar yang mempengaruhi faktor dalam tersebut. Faktor luar yang tidak langsung diantaranya pola diet masyarakat, pengetahuan masyarakat tentang kehigienisan mulut termasuk pengetahuan tentang cara menggosok gigi yang benar. Hanya 27,5% sukarelawan di dua kecamatan di Medan yang menggosok gigi pada waktu yang tepat atau setelah makan dan sebelum tidur (Situmorang 2004). Rata-rata para ibu selalu memberikan makanan pokok dengan kadar karbohidrat 80%, dan memberikan makanan ringan yang mengandung 96,7% karbohidrat (Yuyus et al. 1991).
Sebenarnya plak gigi yang menjadi penyebab terjadinya karies gigi dapat dihilangkan dengan menggosok gigi dengan cara yang benar dan dilakukan pada waktu yang tepat. Selain itu, dapat digunakan pasta gigi yang mengandung antibakteri yang mampu membunuh bakteri penyebab karies gigi. Pasta gigi komersial biasanya mengandung fluorida dalam bentuk natrium fluorida (NaF). Zat tersebut berperan penting dalam mencegah kerusakan gigi. Senyawa fluorida ini juga sangat penting untuk pemeliharaan gigi agar tetap kuat, terutama pada anak-anak. Hal ini disebabkan senyawa fluorida dapat membantu pembentukan enamel gigi yang lebih tahan terhadap kerusakan.
Over dosis penggunaan senyawa berfluorida dapat menyebabkan fluorosis kerusakan tulang dan anemia. Fluorosis merupakan kerusakan gigi berupa perubahan warna gigi menjadi gelap dan rapuh. Selain itu dapat juga timbul bercak pada gigi dan yang lebih berbahaya lagi dapat menyebabkan gagal ginjal.
Penggunaan bahan alternatif lain sebagai antibakteri dalam pasta gigi banyak dilakukan. Hal ini dilakukan dengan mencari bahan alami yang memiliki potensi sebagai antibakteri dalam pasta gigi dan seminimal mungkin memiliki efek samping. Minyak daun sirih dilaporkan memiliki aktivitas antibakteri terhadap Streptococcus mutans yang lebih tinggi dibandingkan dengan NaF (Sundari 1991). Bahan alami lain yang berfungsi sebagai antibakteri adalah propolis. Propolis Trigona spp. berdasarkan penelitian
perlu dilakukan pengujian terhadap propolis Trigona spp. sebagai antibakteri kariogenik (S. mutans).
Antibakteri yang biasa digunakan dalam pasta gigi umumnya merupakan senyawa fluorida. Apabila digunakan secara berlebih, senyawa fluorida akan menyebabkan deremineralisasi gigi. Maka usaha mencari alternatif antibakteri yang memiliki potensi sebagai campuran dalam pasta gigi perlu dilakukan.
Penelitian dilakukan untuk menentukan adanya aktivitas antibakteri propolis dan menentukan konsentrasi hambat tumbuh minimum (KHTM) propolis terhadap kultur S. mutans yang ditambahkan dengan ekstrak propolis.
Hipotesis penelitian adalah propolis mempunyai aktivitas antibakteri terhadap S. mutans yang lebih besar dibandingkan dengan natrium fluorida (NaF 3000 ppm). Hasil penelitian diharapkan memberikan informasi ilmiah mengenai propolis yang dapat dijadikan antibakteri kariogenik alternatif yang dapat diaplikasikan dalam formula pasta gigi. Penelitian bermanfaat dalam memperluas aplikasi dan nilai guna propolis.
TINJAUAN PUSTAKA
Lebah Madu Trigona spp. Tingkah lakuLebah madu Trigona spp. merupakan serangga sosial yang hidup berkelompok membentuk suatu koloni. Lebah ini mudah dijumpai di daerah tropis dan sub tropis di Amerika Selatan, setengah bagian Afrika Selatan dan Asia Tenggara. Koloninya terdiri atas 300-800.000 ekor lebah (Free 1982). Trigona spp. (gala-gala, lebah lilin), dalam bahasa daerah dinamakan klanceng, lenceng (Jawa), atau teuweul (Sunda) (Perum Perhutani 1986). Jumlah madu yang dihasilkan lebih sedikit dan lebih sulit diekstrak, namun jumlah propolis yang dihasilkan lebih banyak dibandingkan dengan lebah jenis lain (Singh 1962).
Trigona spp. memiliki sengat sisa, namun tidak digunakan sebagai alat pertahanan. Lebah ini akan menggigit musuhnya atau membakar kulit musuhnya dengan larutan basa. Organ vital (mata, hidung, dan telinga) musuh akan dikelilingi oleh lebah lain dalam satu koloninya. Lebah ini juga dilengkapi
sistem kekebalan untuk menyerang serangga pengganggun lain (Free 1982).
Koloni lebah madu terdiri atas dua golongan, yaitu golongan reproduktif (lebah jantan dan ratu) dan golongan non reproduktif (lebah pekerja). Mereka dapat dibedakan satu dengan lainnya dari bentuk, rupa, warna, dan tingkah laku. Satu koloni lebah hanya memiliki satu ekor ratu, ratusan ekor lebah jantan, dan ribuan ekor lebah pekerja (Sumoprastowo 1980).
Ratu berukuran paling besar dan paling menarik diantara golongan lainnya. Ratu hanya bertugas menghasilkan telur dan lebah jantan bertugas mengawini ratu lebah. Semua pekerjaan dilakukan oleh lebah pekerja, baik itu pekerjaan dalam sarang maupun pekerjaan di luar sarang. Semua pembagian tugas dilakukan dengan teratur berdasarkan tingkatan usia (Sumoprastowo 1980).
Lebah pekerja mencari sumber nektar pada waktu pagi dan sore hari (Nelli 2004). Lebah pekerja mencari bunga yang memiliki nektar dengan kandungan gula yang tinggi. Lebah ini akan memberitahukan keberadaan sumber nektar pada lebah lain dalam koloninya dengan menggunakan suatu tarian. Jenis lebah Trigona yang lain ada yang menandai sumber makanannya dengan menggunakan feromon dari kelenjar mandibular yang dikenali oleh lebah lain dalam satu koloni (Free 1982).
Sarang lebah
Trigona spp. biasanya membuat sarang di dalam lubang pohon, celah dinding atau lubang bambu di dalam rumah. Lebah ini tidak suka hijrah karena ratunya sangat gemuk dan tidak pandai terbang (Perum Perhutani 1986). Beberapa koloni menempati bekas sarang semut atau rayap dan membangun sarangnya di bebatuan di bawah tanah (Free 1982).
Sarang lebah dibuat dengan mencampur lilin dan resin propolis dari tanaman. Sarang tersusun atas sel anakan yang dikelilingi dengan pelepah lembut yang disebut involucrum dan sel besar yang terdiri atas madu serta cadangan pollen. Terkadang madu dan pollen disimpan dalam tempat yang terpisah. Sel anakan berbentuk vertikal dan sel membuka pada bagian atasnya. Biasanya sel anakan disusun dalam sisir horizon secara berurutan. Sel anakan dan tempat penyimpanan koloni disangga oleh pilar dan bagian luarnya dilapisi oleh lapisan keras yang biasa dikenal dengan nama batumen (Free 1982).
Sel baru dibuat pada batas sisir sampai mereka memperluas dinding lubang sarang. Lebah pekerja memulai untuk membangun sisir baru di atas atau di tengah-tengah sisir sebelumnya. Seiring berjalannya waktu, bagian atas sel anakan telah terisi penuh dan lebah dewasa muncul dari sisir bawah. Ketika telah muncul lebah dewasa, kepompong yang kosong dipindahkan dan sel baru dibangun kembali (Free 1982).
Lebah madu memiliki cara yang unik untuk mengatur panas sarangnya. Koloni menjaga kestabilan suhu sarang antara 31-35
oC. Jika suhu sarang di bawah 18 oC kepala
dan badannya dimasukkan ke dalam tandannya saling merapatkan diri. Jika suhu sarang naik, lebah akan mengibaskan sayapnya untuk menurunkan suhu. Sesekali lebah menyiramkan air ke seluruh sarang lalu dikipasi pada kondisi udara yang sangat panas. Jika suhu lebih dari 40 oC lebah akan
meninggalkan sarang dan jika suhu naik lebih ekstrim lagi koloni akan hijrah membuat sarang baru (Sumoprastowo 1980).
Propolis
Propolis merupakan resin lengket yang dikumpulkan oleh lebah pekerja dari kuncup, kulit kayu, dan dari bagian tumbuhan lain (Gojmerac 1983). Propolis merupakan produk alami lebah yang menunjukkan efek antimikrob (Dharmayanti 2000). Lebah madu membuat propolis dengan mengumpulkan getah damar dari tanaman yang dicapur dengan lilin pada sarangnya. Lebah madu memerlukan propolis karena lebah madu rentan terhadap infeksi bakteri dan virus (Chinthalapally et al. 1993). Selain itu, propolis digunakan untuk mengisi celah dan retakan serta menghaluskan permukan yang kasar pada sarang lebah madu (Gojmerac 1983). Secara kimia, propolis sangat kompleks dan kaya akan senyawa terpena, asam benzoat, asam kafeat, asam sinamat dan asam fenolat. Propolis juga mengandung flavonoid yang sangat tinggi sehingga banyak peneliti lebih memilih propolis sebagai senyawa flavonoid (Chinthalapally et al. 1993).
Keragaman jenis tumbuhan asal resin merupakan faktor utama yang menimbulkan perbedaan komposisi senyawa kimia yang terdapat dalam propolis. Perbedaan komposisi senyawa kimia menimbulkan perbedaan warna dan aroma pada jenis propolis yang berbeda. Aroma yang tercium merupakan aroma senyawa aromatis yang bersifat volatil
yang terkandung dalam propolis (Salatino et al. 2005).
Pemilihan metode ekstraksi bergantung atas tujuan penggunaan ekstrak propolis dan kelarutan zat aktif yang ingin diekstraksi. Pelarut yang dipilih dalam ekstraksi dengan pelarut harus bersifat tidak toksik sehingga ekstrak propolis yang didapat aman digunakan dengan pemakaian di dalam atau di luar tubuh. Aktivitas antimikrob ekstrak propolis dipengaruhi oleh metode ekstraksi, lamanya proses perendaman, dan suhu ekstraksi (Woo 2004).
Beberapa artikel menunjukkan bahwa propolis dapat berfungsi sebagai antibakteri alami dengan aktivitas yang tinggi. Beberapa penelitian ilmiah menunjukkan bahwa propolis memiliki aktivitas penghambatan terhadap beberapa spesies Streptococcus yang dapat menyebabkan karies gigi. Propolis dapat melindungi serangan Streptococcus mutans (bakteri kariogenik) dan beberapa spesies Streptococcus lainnya. Selain itu, propolis juga dapat melawan Staphylococcus aureus, bakteri yang berbahaya karena sering menyebabkan kematian, infeksi, keracunan darah, dan beberapa tipe peneumenia. Menurut Chinthapally (1993) ekstrak propolis dengan etanol mempunyai efek sinergis terhadap aktivitas anti-Staphylococcus pada antibiotik streptomisin dan siklosiklin dan memberikan sedikit efek tersebut pada beberapa antibiotik lainnya.
Analisis kimia sering dilakukan untuk mengetahui hubungan antara aktivitas biologi dengan komposisi senyawa kimia dalam contoh propolis, pada awal milenium ketiga. Teknik analisis yang umum digunakan yaitu dengan kromatografi gas dengan spektrofotometri massa dan kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT). Beberapa peneliti juga melakukan penyelidikan aktivitas senyawa penyusun propolis dengan prinsip Bioassay (Bankova 2005).
Hasil penyelidikan tersebut diantaranya; senyawa turunan asam kafeat yang berhasil diisolasi oleh Banskota et al. dalam Bankova (2005) dari propolis Belanda yang menunjukkan aktivitas antiproliferasi pada cell line kanker. Propolis Belanda mengandung asam kafeat yang dapat menghambat oksidasi nitrat. Berdasarkan bebarapa penelitian dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan komposisi senyawa propolis tergantung daerah asal propolis. Fakta ini diperkuat oleh hasil penelitian bahwa semua sampel propolis dari berbagai daerah asal menunjukkan aktivitas antibakteri
meskipun terdapat perbedaan komposisi senyawa kimia (Bankova 2005).
Karies Gigi
Karies gigi dapat didefinisikan sebagai pembusukan gigi atau gigi berlubang. Karies gigi merupakan penyakit infeksi dengan kerusakan struktur gigi. Penyakit ini menimbulkan nyeri, gigi tanggal, infeksi, bau nafas tidak sedap, dan terganggunya indera pengecap. Infeksi dapat menyebar ke jaringan lunak sekitar gigi yang dapat mengancam keselamatan jiwa, pada karies yang sangat parah. Penyakit ini memiliki sejarah yang panjang dan sudah ada sejak zaman neolitikum. Meratanya peningkatan kasus karies gigi disebabkan perubahan pola makan yaitu meningkatnya konsumsi gula. Saat ini, karies gigi masih menjadi penyakit umum yang terjadi di seluruh dunia (Anonim 2002). Munculnya noda pucat pada permukaan gigi merupakan tanda atau gejala awal terjadinya karies gigi. Munculnya noda tersebut menandakan adanya demineralisasi enamel gigi. Demineralisasi tersebut dapat menimbulkan noda cokelat yang akhirnya dapat menimbulkan lubang pada gigi. Noda tersebut tetap ada meskipun demineralisasi telah berhenti. Proses awal sebelum terjadinya lubang merupakan proses yang dapat balik. Sejak terbentuknya lubang, proses selanjutnya merupakan proses yang tidak dapat balik (Anonim 2002).
Diagnosis umum yang dilakukan meliputi pemeriksaan seluruh permukaan gigi menggunakan cermin gigi, senter, dan alat penjelajah gigi. Radiograf gigi juga dapat digunakan pada diagnosis karies intraproksimal yang sulit dilihat dengan mata telanjang. Karies gigi yang besar dapat dilihat dengan mata telanjang, namun karies yang kecil sulit dilihat dengan mata telanjang. Karies gigi yang kecil dapat ditemukan dengan menggunakan alat pemeriksa gigi, namun tekanan dari alat tersebut dapat menimbulkan lubang (Anonim 2002).
Menurut Yuyus et al. (1991), terdapat empat faktor utama yang saling mempengaruhi yang bertanggung jawab atas terjadinya karies gigi. Faktor tersebut digambarkan sebagai empat lingkaran yang saling berinteraksi. Lingkaran tersebut secara berurutan adalah faktor host meliputi gigi dan saliva, faktor mikroorganisme, faktor substrat, dan faktor waktu.
Faktor host dipengaruhi oleh tingkat kepedulian seseorang terhadap kesehatan gigi.
Pengamatan yang dilakukan oleh Situmorang (2004) menunjukkan bahwa hanya 96,58% sukarelawan di dua kecamatan Medan yang menyikat gigi pada waktu yang tepat. Kariogenitas jenis Streptococcus khususnya S. mutans bertanggung jawab atas kemampuannya membentuk koloni pada permukaan gigi, membentuk atau bergabung dengan plak gigi, dan memproduksi asam (Hardie dan Whiley 1991).
Karies akut menunjukan kecepatan perkembangan karies gigi sangat cepat dan dapat berubah menjadi kronis jika keadaan tersebut dibiarkan terlalu lama. Karies hanya mempengaruhi lapisan enamel gigi pada awal perkembangannya. Ketika karies mencapai lapisan dentin akar gigi dapat terpapar atau terlihat dari mulut dan pada kondisi itu lapisan cementum akan dipengaruhi. Jika bagian syaraf gigi sudah terpapar maka akan timbul rasa nyeri yang sangat kuat. Nyeri dapat bertambah parah dengan makanan atau minuman yang panas, dingin, dan manis (Anonim 2002).
Studi epidemologi menunjukkan bahwa kasus karies berbeda-beda antara kelompok-kelompok penduduk. Perbedaan pola makan dijadikan faktor utama terjadinya perbedaan kasus karies pada tiap kelompok disamping faktor genetik. (Rusiawati 1991). Kelompok penduduk dengan diet tinggi karbohidrat rentan terjadi karies. Hal ini disebabkan mikroorganisme mampu memfermentasi sukrosa atau glukosa menjadi asam yang berperan dalam permulaan terbentuknya karies gigi. Peningkatan fermentasi karbohidrat dapat mengubah populasi flora dalam plak gigi secara cepat. Masyarakat dengan asupan sukrosa yang tinggi menunjukkan peningkatan jumlah bakteri Streptococcus dan Lactobacillus dalam plak. Penurunan asupan sukrosa pada masyarakat Eropa dan Jepang setelah Perang Dunia II menyebabkan menurunnya kecepatan pembentukan karies gigi (Walter 1986).
Streptococcus mutans
Umumnya spesies Streptococcus menunjukkan kegemaran untuk berkoloni pada bagian mulut. Streptococcus merupakan genus paling besar dari total populasi bakteri pada plak gigi. Streptococcus dapat diidentifikasi menjadi beberapa spesies, yaitu S. mutans, S. sanguis, S. mittior, S. salivanus, S. bovis, dan S. mileri. Setiap spesies memiliki kemampuan menempel selektif pada bagian mulut. S. mutans menempel pada permukaan gigi dan baru muncul setelah
munculnya gigi. Penelitian taksonomi menyatakan bahwa spesies ini bersifat non motil, uji katalase negatif dan termasuk bakteri gram positif (Hamada dan Slade1980). Sebanyak 94% penderita karies gigi, air liurnya mengandung bakteri S. mutans (Beighton 1977). S. mutans dapat dibedakan dari jenis lainnya dengan melihat kemampuannya memfermentasi manitol. Hal ini dikarenakan hanya S. mutans dan S. bovis yang mampu memfermentasi manitol dan membentuk glukan. S. bovis tidak dapat memfermentasi sorbitol dan menghidrolisis pati sehingga dapat dibedakan dengan S. mutans (Coykendall 1989).
Dinding selnya mengandung polimer umum yaitu peptidoglikan, kelompok polisakarida spesifik, protein dan gliserol membentuk asam teikoat dan asam liposeikoat. Adanya struktur mozaik pada polimer tersebut memungkinkan terjadinya reaksi pada permukaan sel. Peptidoglikan S. mutans mengandung asam glutamat, alanin, lisin, glukosamin dan asam muramat dengan rasio massa secara berurutan 1:2-4:1:1:1. Strain S. mutans mengandung ikatan silang peptidoglikan dengan jembatan interpeptida yang terdiri atas L-alanin oligopeptida dan treonil-alanil peptida (Hamada dan Slade 1980).
S. mutans dapat memproduksi enzim ekstraseluler glukosiltransferase (GTase) dan fruktosiltransferse (FTase). S. mutans dapat mensintesis polisakarida ekstraseluler yaitu glukan dan fruktan oleh enzim GTase dan FTase. Polisakarida ini terutama glukan sangat penting dalam pembentukan plak gigi dan patogenesis karies gigi. Umumnya S. mutans memproduksi cadangan intraceluler iodine-staining polysaccharides (IPS) dari beragam gula dengan konsentrasi tinggi. Sifat patogenitas S. mutans salah satunya disebabkan kemampuannya dalam membentuk IPS (Hamada dan Slade1980).
Antimikrob
Antimikrob merupakan obat pembasmi mikrob khususnya mikrob yang merugikan manusia (Ganiswarna et al. 1995). Antimikrob yang digunakan harus memiliki tingkat toksisitas selektif setingggi mungkin. Toksisitas selektif itu sendiri artinya, obat tersebut haruslah bersifat sangat toksik pada mikroba patogen namun relatif aman bagi hospes.
Berdasarkan toksisitas selektif, terdapat dua jenis antimikrob yaitu antimikrob bersifat bakterisidal dan bakteriostatik (Ganiswarna et
al. 1995). Jika suatu antibakteri mampu membunuh bakteri patogen maka antibakteri tersebut memiliki aktivitas bakterisidal. Jika antibakteri hanya mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen antibakteri tersebut memiliki aktivitas bakteriostatik. Aktivitas antimikrob tertentu dapat meningkat dari bakteriostatik menjadi bakterisidal jika konsentrasi antimikrobanya ditingkatkan. Terdapat beberapa faktor yang dapat mempengaruhi penghambatan mikrob oleh antimikrob. Faktor tersebut adalah konsentrasi zat antimikrob, jumlah mikroorganisme, spesies mikroorganisme, suhu, dan adanya bahan organik (Pelczar dan Chan1988).
Waktu kontak antara mikrob dengan antimikrob dalam konsentrasi optimum juga berpengaruh terhadap pengaruh yang diberikan oleh antimikrob (Ganiswara et al. 1995). Antimikrob dapat dikelompokkan menjadi lima berdasarkan mekanisme kerjanya. Mekanisme tersebut adalah menghambat pembentukan dinding sel (kerusakan dinding sel), merubah permeabilitas membran sel, merubah protein dan asam nukleat, menghambat sintesis protein dan asam nukleat, dan menghambat kerja enzim (Pelczar dan Chan 1988).
BAHAN DAN METODE
Bahan dan AlatBahan-bahan yang dibutuhkan adalah 150 gram propolis kasar Trigona spp. yang berasal dari peternakan lebah di Pandeglang Banten, bakteri S. mutans, media cair PYG (pepton, yeast, glukosa), media padat PYG, etanol 70%, propilen glikol teknis, natrium fluorida (NaF), larutan natrium klorida 0,9%, pereaksi-pereaksi uji fitokimia, dan akuades. Alat-alat yang digunakan adalah autoklaf, shaker, rotavapor, spektofotometer UV, laminar air flow cabinet, inkubator, mikropipet, neraca analitik, alat penghitung koloni, vortex, jangka sorong, mortar, jarum ose, cawan petri, dan beberapa alat gelas lainnya.
Metode Penelitian Ekstraksi propolis
Propolis diekstraksi menggunakan metode Harbone (1987) dan Matienzo dan Lamorena (2004). Ekstraksi dilakukan secara maserasi dengan pelarut alkohol 70% dengan satu kali pengulangan. Sebanyak 150,68 gram propolis kasar Trigona spp. direndam dengan 500 mL etanol 70%. Suspensi tersebut ditutup dan
dikocok dengan shaker di ruang gelap selama satu minggu. Setelah itu, suspensi tersebut disaring, filtratnya diambil dan residunya dimaserasi kembali. Selanjutnya filtrat tersebut diambil setiap hari selama enam hari. Setelah enam hari, filtrat terakhir yang dihasilkan berwarna jernih dan teknik maserasi diakhiri.
Setelah seluruh filtrat hasil maserasi terkumpul, filtrat tersebut dipekatkan dengan menggunakan rotavapor pada suhu 40 oC.
Ekstrak pekat yang diperoleh ditimbang untuk mendapatkan nilai rendemennya, kemudian ekstrak tersebut dilarutkan dengan propilen glikol sebanyak satu kali volumenya yang disebut ekstrak propolis 100% (EP 100%). Selanjutnya ekstrak tersebut dilakukan uji fitokimia dan uji aktivitas antibakteri.
Analisis Fitokimia
Analisis fitokimia merupakan uji kualitatif untuk mengetahui keberadaan golongan senyawa-senyawa aktif yang terkandung dalam eksktrak propolis. Analisis fitokimia dilakukan berdasarkan metode Harbone (1987). Identifikasi yang dilakukan adalah uji alkaloid, uji tanin, uji flavonoid, uji saponin, uji steroid, dan uji minyak atsiri. Sampel propolis yang digunakan adalah ekstrak propolis 100% dan propolis merk X yang telah diencerkan dengan akuades.
Uji Alkaloid. Sampel propolis dengan pengenceran 1:2 sebanyak 0,3 mL ditambahkan 1,5 mL kloroform dan 3 tetes ammonia, kemudian fraksi kloroform diasamkan dengan 2 tetes asam sulfat. Bagian asamnya diambil dan ditambahkan reagen Dragendrof, Meyer, dan Wagner. Keberadaan alkaloid dalam sampel ditandai dengan terbentuknya endapan merah dengan penambahan reagen Dragendrof, endapan putih dengan reagen Meyer, dan endapan putih dengan reagen Wagner.
Uji Tanin. Sampel propolis dengan pengenceran 1:10 dididihkan selama 5 menit. Selanjutnya 3 tetes sampel dipindahkan ke dalam papan uji dan ditambahkan 3 tetes FeCl3 1% (v/v). Keberadaan senyawa tanin
dalam sampel ditandai dengan terbentuknya warna biru tua atau hijau kehitaman.
Uji Flavonoid. Sampel propolis dengan pengenceran 1:2 sebanyak 0,3 mL dicampur dengan 1,5 mL metanol dan dipanasi pada suhu 50 oC selama 5 menit. Kemudian 5 tetes
larutan tersebut dipindahkan ke dalam papan uji dan ditetesi 5 tetes asam sulfat pekat. Warna merah yang terbentuk menunjukkan sampel mengandung senyawa flavonoid.
