1
ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS BAKTERI UNGU SULFUR PENURUN KADAR SENYAWA HIDROGEN SULFIDA
DI PERIRAN TAWAR
Fajar Firmansyah 1, Nina Hermayani Sadi M.Si 2, Dr. Oom Komala 3,
1 Mahasiswa Peneliti, 2 Pembimbing PUSLIT Limnologi LIPI, 3Dosen Pembimbing,
Program Studi Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pakuan
ABSTRAK
Hidrogen Sulfida merupakan salah satu masalah di perairan tawar karena dapat mengakibatkan kematian pada biota air. Gas H2S di perairan sangat beracun untuk biota air
meski dalam konsentrasi sangat rendah 0,1 mg/L. Oleh karena itu perlu adanya perombakan dengan cara metode bioremediasi. Bioremediasi senyawa H2S dilakukan dengan
menggunakan bakteri ungu sulfur yang dapat menyisihkan sulfida dan mengubahnya menjadi sulfur kembali. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat bakteri ungu sulfur yang potensial untuk penurunan H2S. Penelitian ini dilakukan dengan 3 tahap antara lain 1)
isolasi bakteri ungu sulfur, 2) identifikasi bakteri ungu sulfur 3) pengujian penyisihan sulfida. isolat diambil dari enam tempat perairan yang diduga terdapat bakteri ungu sulfur, yaitu kolam sidat, kolam lele, Situ Cibuntu, Situ Cilalay, Situ Pasar dan Situ Gedong. Sebanyak 7 isolat bakteri didapatkan dari metode pengenceran, yaitu L1, L2, CU1, CU2, GO, PS dan SD. Ke tujuh isolat termasuk Gram negatif dengan bentuk morfologi L1, L2, CU1 dan CU2 berbentuk basil, GO berbentuk cocobasil, PS dan SD berbentuk spiral. Uji pola spektral memperlihatkan ke tujuh isolat memiliki bakteriklorofil a dan karotenoid dengan fase eksponensial pada 10 jam setelah inkubasi. Ke tujuh isolat dapat menyisihkan sulfida sehingga dapat dipastikan termasuk bakteri ungu sulfur.
Kata kunci : Hidrogen sulfida, Bakteri ungu sulfur, penyisihan sulfida
PENDAHULUAN
Hidrogen sulfida merupakan
senyawa sulfur yang menjadi masalah di perairan karena dapat mengakibatkan
kematian pada ikan. Terjadinya
peningkatan konsentrasi senyawa
anorganik beracun H2S, merupakan akibat dari perombakan bahan organik yang
tertimbun di sedimen perairan.
Penimbunan bahan organik terjadi karena akumulasi sisa hasil metabolisme, sisa pakan dan limbah lain, yang kemudian membusuk dan tertumpuk didasar perairan (Bay 1986 dalam Triani dkk, 2005). Gas H2S di perairan ini sangat beracun untuk biota air meski dalam konsentrasi sangat rendah yaitu 0,1 mg/L (Boyd, 1984 dalam Triani dkk, 2005).
Apabila di suatu perairan banyak terkandung H2S maka perlu dilakukan suatu penanggulangan salah satunya
dengan cara metode bioremediasi.
Bioremediasi merupakan penggunaan
makhluk hidup yang telah dipilih untuk ditumbuhkan pada polutan tertentu sebagai upaya untuk menurunkan kadar polutan tersebut. Pada saat proses bioremediasi berlangsung enzim-enzim yang diproduksi
oleh mikroorganisme memodifikasi
struktur polutan beracun menjadi tidak komplek sehingga menghasilkan metabolit yang tidak beracun dan tidak berbahaya (Priadie, 2012).
Penanggulangan senyawa H2S di
perairan dapat dilakukan dengan
menggunakan bakteri pengoksidasi sulfur untuk bioremediasinya (Schlegel and
2
Schmidt, 1994). Menurut Friedrich et al, (2001) salah satu bakteri pengoksidasi sulfur adalah bakteri ungu sulfur. Bakteri ungu sulfur termasuk ke dalam kelompok bakteri fotosintetik anaerobik yang mampu
memanfaatkan senyawa H2S untuk
hidupnya. Bakteri tersebut dapat di isolasi dari air dengan kondisi lingkungan yang banyak mengandung bahan organik dan senyawa H2S. Bakteri ungu sulfur melalui aktivitas fotosintetik anoksigeniknya
memanfaatkan H2S sebagai sumber
elektron untuk memfiksasi CO2 sehingga
pada akhir fotosintesisnya tidak
menghasilkan oksigen melainkan sulfur. Oleh karena itu penelitian mengenai bakteri ungu sulfur perlu dilakukan untuk
mengetahui berapa besar pengaruh
kemampuan bakteri ungu sulfur dalam menurunkan kadar H2S. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat bakteri ungu sulfur yang potensial untuk penurunan kadar senyawa H2S di perairan tawar.
BAHAN DAN METODE
Penelitian ini dilakukan di laboratorium mikrobiologi Pusat Penelitian
Limnologi LIPI pada bulan April sampai Juli 2016. Penelitian ini dilakukan dengan 3 tahap antara lain 1) isolasi bakteri ungu sulfur, 2) identifikasi bakteri ungu sulfur 3) pengujian penyisihan sulfida.
Isolasi Bakteri Ungu Sulfur
Sampel diambil di enam tempat perairan yang diduga terdapat bakteri ungu sulfur, yaitu kolam sidat, kolam lele, Situ Cibuntu, Situ Cilalay, Situ Pasar dan Situ Gedong. Isolasi bakteri ungu sulfur
diawali dengan pengkayaan bakteri
menggunakan media Pfennig 2 cair (Tabel 1) pada beberapa konsentrasi salinitas. Media dan sampel air dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan perbandingan 1 ml sampel air : 2 ml paraffin cair : 9 ml media dengan perbedaan salinitas NaCl yaitu 0; 0,25‰; 0,5‰; 0,75‰; 1‰ ke dalam larutan media Pfennig 2. Perlakuan ini dilakukan untuk mengetahui salinitas optimum dalam menumbuhkan bakteri ungu sulfur. Di inkubasikan selama 14 hari pada suhu ruangan di tempat dengan kuat cahaya 200-1000 lux.
Tabel 1 : Komposisi Media Pfennig 2
Komposisi Media Padat Media Cair
Larutan 1 - Akuades - KH2PO4 - NH4Cl - MgSO4-7H2O - CaCl2-2H2O 950 ml 1 gr 0.5 gr 0.4 gr 0.05 gr 950 ml 1 gr 0.5 gr 0.4 gr 0.05 gr Larutan 2 - Vitamin B12 1 ml 1 ml Larutan 3 Element Solution SL 12 - Akuades - EDTA - FeSO4-7H2O - H3BO3 - CoCl2-6H2O - MnCl2-4H2O - ZnCl2 - NiCl2-2H2O - Na2MoO4-2H2O - CuCl2-2H2O 1 ml 1 L 2 gr 1,1 gr 300 mg 190 mg 50 mg 42 mg 24 mg 18 mg 2 mg 1 ml 1 L 2 gr 1,2 gr 300 mg 190 mg 50 mg 42 mg 24 mg 18 mg 2 mg Larutan 4 - NaOH 5% 30 ml 30 ml Larutan 5 - Na2S-9H2O 6% 6 ml 6 ml
3
Kultur yang tumbuh dari hasil dari pengkayaan pada media cair kemudian dimurnikan dengan cara menggunakan pengenceran bertingkat. Pemurnian isolat pada metode pengenceran bertingkat (Stainer et al, 1982) menggunakan media
Pfennig 2 cair, dengan tingkat
pengenceran yang digunakan hingga
antara 10-6 – 10-15. Pengenceran dilakukan dengan memindahkan secara aseptik 0,5 ml suspensi sampel ke dalam tabung yang berisi 4,5 ml larutan media Pfennig 2 cair, dan ditambahkan paraffin untuk kondisi
anaerob. Kultur hasil pengenceran
diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruangan di tempat dengan kuat cahaya 200-1000 lux.
Idetifikasi Bakteri Ungu Sulfur
Identifikasi dilakukan untuk mengetahui jenis bakteri tersebut. Pengamatan yang dilakukan dari tiap isolat meliputi warna kultur bakteri, bentuk sel
dan uji Gram (Cappuccino, 1983).
Identifikasi dilakukan dengan 3 cara yaitu 1) uji pewarnaan Gram, 2) uji pola spektral
3) pengukuran pola pertumbuhan.
Pewarnaan Gram dilakukan dengan
mengambil satu ose isolat bakteri, diletakkan pada kaca objek yang ditetesi 1 tetes air, disebar, kemudian difiksasi.
Pewarnaan dilakukan dengan
menggunakan larutan kristal violet. Setelah 1 menit dibilas dengan air perlahan, kemudian diberi iodine. Setelah itu ditambahkan aseton alkohol dan dibilas. Kemudian diteteskan larutan safranin sebagai zat warna tandingan dan dibiarkan satu menit. Dibilas dengan air dan dikeringkan perlahan dengan tissue. Selanjutnya diamati dibawah mikroskop terhadap bentuk dan warna penataan sel bakteri (Cappuccino, 1983).
Uji pola spektral menggunakan
spektrofotometer bertujuan untuk
mengetahui keberadaan bakterioklorofil dan karotenoid yang merupakan ciri khas dari bakteri ungu sulfur. Uji pola spektral
dilakukan pada rentang panjang
gelombang 300-950 nm (Cappelletti,
2011). Isolat berumur 3-4 hari yang ditumbuhkan dalam media padat Pfennig 2 cair diambil 1 ml kemudian dimasukkan kedalam 4 ml larutan sukrosa 60% dalam tabung reaksi. Sampel diaduk hingga
homogen setelah itu diukur nilai
absorbansinya menggunakan
spektrofotometer (Biebl and Drews, 1969 dalam Dworkin et al, 2006).
Pengamatan pola pertumbuhan
isolat unggul bertujuan untuk
mendapatkan data mengenai fase-fase pertumbuhan bakteri ungu sulfur. Uji pola pertumbuhan isolat ini dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 9 ml media Pfennig 2 cair dimasukan kedalam tabung Hach steril secara aseptik. Kemudian ditambahkan isolat sebanyak 1 ml dan paraffin cair steril. Inkubasi isolat bakteri dilakukan di tempat dengan kuat cahaya 200-1000 lux. Setiap 2 jam isolat dilakukan pengukuran absorbansi kultur
menggunakana spektrofotometer Hach
pada panjnag gelombang 600 nm hingga didapatkan fase stasioner (Schlegel and Schmidt, 1994).
Uji Penyisihan Sulfida
Uji aktivitas penyisihan sulfida pada bakteri ungu sulfur bertujuan untuk mempelajari kemampuan isolat yang diperoleh dalam menurunkan kosentrasi sulfida. kultur isolat diinokulasikan ke dalam media Pfennig 2 cair sebanyak 9 ml, dengan penambahan paraffin 1 ml untuk keadaan anaerob. Setiap kultur isolat dilakukan 3x ulangan. Kultur diinkubasi pada suhu ruang selama 3x24 jam di depan lampu 15 watt dengan kuat penyinaran 200-1000 lux. Setiap 24 jam dilakukan
pengujian kadar sulfida dengan
menggunakan plat tetes. Satu tetes kultur isolat dimasukkan ke dalam plat tetes dengan penambahan reagent yaitu reaksi amin H2SO4, larutan FeCl3, dan larutan (NH4)2HPO4 masing-masing setetes. Dilakukan pengamatan terhadap warna yang dihasilkan. Jika yang terbentuk warna biru menandakan adanya sulfida, sedangkan jika warna kuning dan bening
4
merah tidak terdapat sulfida. Kepekatan warna yang terbentuk kemudian di klasifikasikan. Warna kuning atau bening merah menunjukkan bahwa sulfida telah habis dan isolat yang demikian diberi nilai “+++” (penyisihan cepat); warna kuning kehijauan menunjukkan bahwa masih terdapat sulfida dengan konsentrasi rendah dan isolate diberi skor “++” (penyisihan sedang); warna biru muda menunjukkan sulfida masih cukup banyak dan isolate diberi skor “+” (penyisihan lambat); dan warna biru pekat menunjukkan bahwa tidak ada penurunan kosentrasi sulfida dan isolate diberi skor “-“ (tidak ada aktivitas penyisihan).
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Isolasi Bakteri Ungu Sulfur
Sebanyak 7 isolat bakteri
didapatkan dari metode pengenceran (Tabel 2), yaitu 2 isolat dari kolam lele (L1 dan L2), 2 isolat dari Situ Cibuntu (CU1
dan CU2), 1 isolat dari Situ Gedong (GO), 1 isolat dari kolam sidat (SD), dan 1 isolat dari Situ Pasar (PS) (Tabel 3). Isolat yang didapat dengan menggunakan metode
pengenceran bertingkat dipastikan
kemurniannya melalui pengamatan
terhadap sel bakteri dari kultur (Tabel 2). Isolat murni L1, L2, CU1, CU2, dan GO diperoleh dari tingkat pengenceran 10-6, sedangkan isolat SD dan PS diperoleh dari tingkat pengenceran 10-15. Pengenceran lebih banyak pada Situ Pasar dan kolam sidat dikarenakan sel bakteri yang terlihat masih tercampur pada pengenceran 10-6. Oleh karena itu pengenceran lanjutan dilakukan untuk mendapatkan bakteri dengan bentuk bakteri yang sama yaitu hingga 10-15. Isolat murni yang diperoleh dari metode pengenceran selanjutnya dikulturkan ke dalam media Pfennig 2 cair baru untuk dilakukan dalam proses pengujian-pengujian selanjutnya.
Tabel 2 : Hasil Pemurnian Bakteri Ungu Sulfur menggunakan Metode Pengenceran.
Sampel Kode Isolat Tingkat
Pengenceran Warna Isolat
Kolam Lele L1 10-6 Merah muda
L2 10-6 Merah muda
Situ Cibuntu CU1 10-6 Merah kecoklatan
CU2 10-6 Merah kecoklatan
Situ Gedong GO 10-6 Merah kecoklatan
Situ Pasar PS 10-15 Merah kecoklatan
Kolam Sidat SD 10-15 Merah kecoklatan
Uji Pewarnaan Gram
Hasil pengujian pewarnaan Gram menunjukkan bahwa ke tujuh isolat termasuk kedalam Gram negatif (Tabel 3). Hasil ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Kumar et al (2011), yang mengatakan kebanyakan bakteri ungu sulfur termasuk kedalam Gram negatif. Menurut Pelezar (2008) dalam Apriani
(2015) bakteri Gram negatif akan
kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol, sehingga dapat menyerap zat warna tandingan merah safranin yang
diberikan ditahap berikutnya. pengamatan bentuk sel diketahui bahwa ke 4 isolat berbentuk basil (L1, L2, CU1, dan CU2), 1 isolat berbentuk cocobasil (GO) dan 2 isolat berbentuk spiral (PS dan SD) (Tabel 3). Menurut Dworkin et al (2006), bakteri ungu sulfur memiliki bentuk sel berbeda seperti cocus, cocobasil, basil, dan spiral dengan warna isolat yang khas (Gambar 7). Morfologi bentuk bakteri ungu sulfur berbeda setiap spesiesnya dan menjadikan ciri khas untuk identifikasi (Imhoff et al. 1998)
5
Tabel 3 : Hasil Pewarnaan Gram Kultur Isolat.
Sampel Kode Isolat Pewarnaan
Gram Bentuk sel
Kolam Lele L1 Negatif Basil
L2 Negatif Basil
Situ Cibuntu CU1 Negatif Basil
CU2 Negatif Basil
Situ Gedong GO Negatif Cocobasil
Situ Pasar PS Negatif Spiral
Kolam Sidat SD Negatif Spiral
Uji Pola Spektral
Hasil pengujian pola spektral (tabel 4) bakteri menujukkan bahwa semua isolat
memiliki bakterioklorofil jenis
bakterioklorofil a. Hal ini ditandai dengan adanya panjang gelombang maksimum pada 375, 595, 805,855 dan 870 nm. Menurut Pfennig et al dalam Dworkin et al (2006), mengatakan bakterioklorofil a akan menunjukkan panjang gelombang maksimum pada 375, 590-600, dan 800-900 nm. Pigmen karotenoid ke tujuh isolat
teridentifikasi pada panjang gelombang 440, 460 dan 490 termasuk jenis spirilloxanthin. Terdapat 5 jenis karatinoid sebagai pigmen penangkap cahaya bakteri,
yaitu lycopene, rhodopin,
anhydrobodovibrin, rhodovibrin dan
spirilloxanthin, yang menjadi cirri khas bakteri fotosintetik. Spirollaxanthin memiliki penyerapan panjang gelombang maksimum 440-490 nm (Horibe et al, 2012).
Tabel 4: Hasil Uji Pola Spektral Kultur Isolat
Kode Isolat
Puncak Panjang Gelombang Jumlah
Puncak Panjang Gelombang Bchl 1 2 3 4 5 6 7 8 GO 375 440 460 490 595 805 855 - 7 a CU1 375 440 460 490 - 805 - 870 6 a CU2 375 440 460 490 595 805 - 870 7 a L1 375 440 460 490 - 805 - 870 6 a L2 375 440 460 490 595 805 - 870 7 a SD 375 440 460 490 - 805 855 - 6 a PS 375 440 460 490 - 805 855 - 6 a
Gambar 1 menunjukkan pola pertumbuhan isolat bakteri ungu sulfur. Pada 10 jam awal pertumbuhan bakteri belum terdeteksi. Hal ini diduga bakteri
melakukan penyesuaian terhadap
lingkungan atau medium setelah inokulasi. Pada fase adaptasi ini terjadi peningkatan ukuran sel bakteri, dan mengalami sedikit
pembelahan (Agustien dkk, 2010). Fase eksponensial terjadi pada awal 10 jam setelah inkubasi dengan puncak fase eksponensial jam ke 48. Fase eksponensial merupakan fase pembentukan metabolit
primer yang dihasilkan oleh
6
Gambar 1: Pola Pertumbuhan Ketujuh Isolat Selama 72 Jam. Fase eksponesial pada bakteri ungu
sulfur ini dapat dijadikan informasi, untuk penggunaan bakteri ungu sulfur yang baik pada 10 jam setelah inkubasi. Menurut Dwidjuseputro (1998) dalam Agustien dkk (2010), pertumbuhan bakteri pada fase eksponesial berlangsung paling cepat. Bakteri pada fase ini baik untuk dijadikan inokulum, untuk produksi senyawa yang diinginkan.
Uji Penyisihan Sulfida
Hasil pengujian penapisan awal berupa uji kualitatif dengan menggunakan plat tetes, didapatkan bahwa ketujuh isolat dapat menyisihkan sulfida (Tabel 5).
Tabel 5: Uji Kualitatif Penyisihan Sulfida Menggunakan Plat Tetes
Keterangan : +++ = Cepat
++ = Sedang
+ = lambat
Isolat L1, L2, dan CU1
menyisihkan sulfida lebih cepat, diikuti CU2 dan GO dengan peyisihan sedang, serta PS dan SD yang paling lambat menyisihkan sulfida. Menurut Schlegel
and Schmidt (1994) ciri khas bakteri ungu sulfur pada waktu pertumbuhan senyawa sulfida dengan cepat dioksidasi didalam sel dan mempercepat pertumbuhan bakteri. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 2 4 8 10 12 24 28 32 48 52 72 A b sor b an Waktu/jam
POLA PERTUMBUHAN
L1 L2 CU1 CU2 GO PS SD KodeIsolat Penurunan Sulfida OD
L1 +++ 0.611 L2 +++ 0.540 CU1 +++ 0.603 CU2 ++ 0.518 GO ++ 0.623 PS + 0.547 SD + 0.287
7 KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Dari ke enam sampel sumber dapat diisolasikan tujuh isolat bakteri ungu sulfur sebanyak 7 isolat dari perairan tawar yaitu L1 & L2 (kolam lele), CU1 & CU2 (Situ Cibuntu), GO (Situ Gedong), PS (Situ Pasar), dan SD (kolam sidat) dengan
menggunakan metode pengenceran
(dilution method). Isolat-isolat yang didapat tersebut memiliki bachterioklorofil
a dan pigmen karotenoid jenis
spirilloxanthin. Pola pertumbuhan ke tujuh isolat bakteri ungu sulfur menunjukkan awal fase eksponensial terjadi 10 jam setelah inkubasi. Puncak fase eksponensial terjadi pada 48 jam setelah inkubasi. Ke tujuh isolat termsuk bakteri ungu sulfur setelah dilakukan pengujian penyisihan
sulfida, Isolat L1, L2, dan CU1
menyisihkan sulfida lebih cepat, diikuti CU2 dan GO dengan peyisihan sedang, serta PS dan SD yang paling lambat menyisihkan sulfida.
Saran
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan ini, maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui spesies bakteri isolat-isolat tersebut. Perlu dilakukan pengujian terhadap dampak yang diperoleh pada lingkungan setelah
menggunakan bakteri ungu sulfur,
sehingga isolat yang diperoleh dapat dipergunakan untuk skala lapang.
DAFTAR PUSTAKA
Agustien. A. Jetty N. Linar Z. 2010. Pingkan A. produksi protease alkali dan karatinase dari brevibacillus agri A-03 termofilik. Jurnal riset kimia. Vol 4 (1).
Apriani Ike. (2015). Isolasi, Seleksi dan Karakterisasi Bakteri Mannolitik
yang Berasal dari Serasah
Tanaman Sawit. Bioilmi. Vol 1. No 1.
Cappelletti Martina. 2011.
Characterization of Anoxygenic Phototrophs that Grow Using
Infrared Radition (>800 nm)
(sampling Location: Little
Sippewissett Marsh, Woods H ole, Ma). Microbial Diversity course marine Biological Laboratory. Universitas of Bologna.
Cappucino JG. 1983. Microbiology: A Laboratory Manual. Addison Wesley Publishing Company. Dworkin M, Stanley F, Eugens K,
Karl-Heinz S, and Erko S. 2006. The Prokaryotes. Springer. Volume : 6. 846-870.
Friedrich, C.G., D. Rother, F.
Bardischewsky, A. Quentmeier, & J. Fischer. 2001. Oxidation of reduced inorganic sulfur compound by bacteria: emergence of a
common mechanism? Appl.
Environ Microbial. 67 (7) : 2873-2882.
Horibe. T., Katsunori. N., Toshiyuki. K., Ritsuko. F., Richard. J., Codgell., Mamoru. N., Hideki. H., 2012. Polarization Angle Dependence of Strak Absorption Spectra of Spirilloxanthin Boundd to The
Reconstituted LH1 Complexes
Using LH1-subunits Isolated from
The Purple Photosynthetic
Bacterium Rhodospirillum rubrum. Biochimica Polonica. Vol 59, No 1.
Kumar. R. S., Ranjani., Uday. C.K., Mahmood. S., Vanaja., Uma. D., 2011. Isolation of Photosynthetic Sulfur Bacteria from The Soil
Samples of Elevated CO2
Chamber. International Journal of
Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences. Vol 3 (3).
Priadie Bambang. 2012. Teknik
Bioremediasi Sebagai Alternatif
Dalam Upaya Pengendalian
Pencemaran Air. Jurnal Ilmu lingkungan. Vol(10) : 38-48. Schlegel, H.G., and K. Schmidt. 1994.
Mikrobiologi umum.Edisi keenam
Yogyakarta. Gadjah Mada
8
Stainer, R.Y., Adelberg. E.A., & Ingraham, J. (1982). The Microbial World. New Jersey. Pratice Hall Inc. Englewood Ciffs.
Triani, Wiwik. Artini P. Okid P.A. 2005. Populasi Bakteri Pengoksidasi
Sulfur Anorganik dan Kadar H2S di Tambak Udang Putih (Penaeus vannamei Boone) Sistem Intensif. BioSMART. Volume 7,Nomor 1. Hal 23-26.
