METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari bulan Mei 2008 sampai dengan bulan Juli 2009 di kebun percobaan IPB Cikabayan. Analisis isozim dan pengujian kadar minyak dilaksanakan di Laboratorium Hayati, Pusat Studi Bioteknologi dan Sumberdaya Hayati IPB.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian adalah delapan genotipe biji jarak pagar yaitu IP-1A, IP-1M, IP-2P, Lombok Timur, Lombok Barat, Lombok Tengah, Sumbawa dan Bima. Teknik penanaman yang digunakan berdasarkan petunjuk teknis budidaya jarak pagar dari Pusat Penelitian dan Pengembangan Perkebunan (Mahmud et al. 2008).
Pupuk yang digunakan adalah pupuk kandang, urea, SP36 dan KCl. Peralatan yang digunakan di lapangan antara lain cangkul, cethok, alat pengukur (penggaris atau meteran), Munsel color chart, timbangan, label, jangka sorong dan alat tulis. Alat di laboratorium meliputi timbangan, labu takar, microwave,
magnetic stirrer, vacum, mortar penggerus dan alat elektroforesis.
Bahan untuk analisis isozim terdiri atas bahan untuk pembuatan gel pati yaitu gel pati, buffer gel (L-histidin monohidrat 5 mM), bahan ekstraksi enzim yaitu pasir kuarsa, buffer pengekstrak, untuk elektroforesis yaitu gel pati, buffer elektroda, bahan pewarnaan dan fiksasi yaitu larutan fiksasi dan pewarna Peroksidase (PER), Esterase (EST), Aspartat Aminotransferase (AAT), Malat dehidrogenase (MDH) dan Alkohol Dehidrogenase (ADH).
Metode Percobaan
Penelitian yang dilakukan terdiri atas dua percobaan, yaitu (1) Analisis karakter agronomi dan (2) Analisis Isozim. Percobaan dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan satu faktor yaitu genotipe jarak pagar dan diulang sebanyak tiga kali. Satu unit percobaan terdiri atas dua belas tanaman, tiap petak berukuran 6 m x 8 m. Jarak tanam yang
digunakan adalah 2 m x 2 m, dengan blok sebagai ulangan. Model persamaan linier untuk Rancangan Acak Kelompok (RAK) adalah:
Percobaan I : Analisis Karakter Agronomi
Pengamatan karakter agronomi terdiri atas karakter kualitatif dan karakter kuantitatif. Pengamatan dilakukan pada seluruh tanaman dari setiap genotipe pada masing-masing unit percobaan. Pelaksanaan pengamatan karakter agronomi mengikuti Panduan Pengujian Individual ubi kayu (Manihot esculenta Crantz.) (PVT 2007).
Karakter yang diamati sebagai berikut:
A. Pengamatan karakter kualitatif meliputi;
a) Pengamatan batang dilakukan saat tanaman berumur 6 bulan: - Tipe tanaman: tidak bercabang atau bercabang,
Tipe tanaman ini diamati pada semua tanaman dalam unit percobaan. - Warna batang muda: hijau muda, hijau, hijau abu-abu, coklat, coklat
kemerahan atau abu-abu,
Warna batang muda diamati menggunakan Munsel Color Chart yaitu dengan mengamati batang bagian atas yang dekat dengan pucuk.
- Warna batang tua: hijau, hijau abu-abu, hijau gelap, coklat kekuningan, coklat kemerahan atau abu-abu,
Warna batang tua diamati menggunakan Munsel Color Chart yaitu dengan mengamati batang bagian bawah.
- Bentuk batang: bulat atau bersegi,
b) Pengamatan daun dilakukan pada saat tanaman berumur 4 bulan: - Bentuk daun: bulat, perisai, jorong, memanjang atau lanset
ij j i ij Y = μ + τ + β + ε Dimana: i = 1, 2, …, 8 dan j =1, 2,3
Yij = Pengamatan pada perlakuan ke-i dan kelompok ke-j
μ = Rataan umum
τi = Pengaruh perlakuan ke-i
βj = Pengaruh kelompok ke-j
- Bentuk ujung daun: runcing atau tumpul - Tipe tulang daun: menyirip atau menjari - Bulu pada daun muda: tidak ada atau ada
Bulu pada daun muda diamati pada daun yang berada di bagian pucuk yang belum terbuka sempurna.
- Warna daun muda: hijau kekuningan, hijau muda, hijau, hijau keunguan, ungu muda, ungu atau coklat,
Warna daun muda diamati pada daun ke-2 dibagian pucuk yang belum membuka sempurna.
- Warna daun tua: hijau kekuningan, hijau atau hijau tua,
Warna daun tua diamati pada daun ke-15 yang berada pada batang bagian bawah.
Pengamatan warna daun dilakukan dengan menggunakan Munsel Color
Chart.
- Tekstur daun muda: licin, kasap atau berbulu
Tekstur daun muda diamati pada daun ke-2 pada bagian pucuk yang belum membuka sempurna.
- Tekstur daun tua: licin, kasap atau berbulu
Tekstur daun muda diamati pada daun ke-15 yang berada pada batang bagian bawah.
Tekstur daun diamati pada bagian permukaan atas dan pada bagian permukaan bawah daun.
c) Pengamatan bunga dilakukan pada saat bunga mulai mekar dengan menggunakan Munsel Color Chart:
- Warna kepala sari - Warna kepala putik d) Pengamatan buah:
- Warna buah muda
- Warna buah masak
Warna buah masak diamati pada saat buah telah masak dan siap panen. Warna buah diamati dengan menggunakan Munsel Color Chart.
- Bentuk buah: agak elips atau bulat
Bentuk buah diamati pada saat buah telah masak.
e) Pengamatan biji dilakukan pada saat panen: - Warna biji: coklat atau hitam
- Bentuk biji : agak elips atau bulat
B. Pengamatan karakter kuantitatif meliputi; a) Pengamatan batang:
Pengamatan pada karakter sudut cabang primer, diameter pangkal batang dan panjang ruas dilakukan pada saat tanaman berumur 6 bulan. Karakter jumlah cabang primer, jumlah cabang sekunder dan jumlah cabang produktif dihitung pada saat tanaman berumur 12 bulan.
- Sudut cabang primer
Sudut cabang primer diukur dengan menggunakan penggaris busur. Dilakukan dengan cara mengukur sudut cabang primer terhadap batang utama.
- Diameter pangkal batang
Diameter pangkal batang diamati dengan mengukur bagian pangkal batang 5 cm di atas permukaan tanah menggunakan jangka sorong. - Panjang ruas
Panjang ruas diamati dengan mengukur jarak antara ruas batang. - Tinggi tanaman pada saat muncul bunga pertama
Tinggi tanaman diukur pada saat muncul bunga pertama. - Jumlah cabang primer
- Jumlah cabang sekunder - Jumlah cabang produktif
Jumlah cabang produktif diamati dengan menghitung jumlah cabang yang menghasilkan buah.
b) Pengamatan daun:
Pengamatan daun pada karakter panjang tangkai daun, panjang daun dan lebar daun dilakukan pada saat tanaman berumur 5 bulan sebanyak 5 daun pada setiap tanaman.
- Panjang tangkai daun - Panjang daun
- Lebar daun
- Jumlah daun saat muncul bunga pertama
Jumlah daun dihitung pada saat muncul bunga pertama.
c) Pengamatan bunga:
Pengamatan bunga dilakukan pada semua bunga yang muncul di setiap malai pada tanaman.
- Umur berbunga
Umur berbunga diamati pada saat muncul bunga pertama. - Jumlah bunga jantan per malai
Jumlah bunga jantan per malai diamati pada saat bunga mulai mekar. - Jumlah bunga betina per malai
Jumlah bunga betina per malai diamati pada saat bunga mulai mekar. - Jumlah malai per tanaman
Jumlah malai per tanaman diamati dengan menghitung banyaknya malai per tanaman.
- Persentase bunga betina menjadi buah
Persentase bunga betina menjadi buah dengan membandingkan jumlah bunga betina menjadi buah dalam persen.
d) Pengamatan buah:
Pengamatan buah dilakukan pada semua buah yang terbentuk pada setiap malai. Karakter tebal daging buah, panjang buah masak dan diameter buah masak diukur dengan menggunakan jangka sorong.
- Tebal daging buah - Panjang buah masak - Diameter buah masak
- Umur buah panen
Umur buah panen dihitung dari mulai tanam hingga panen. (Dikakatan panen setelah 75% buah masak).
- Jumlah buah per tanaman
Jumlah buah per tanaman diamati dengan menghitung buah yang terbentuk selama periode 12 bulan.
- Jumlah buah per malai
Jumlah buah per malai diamati dengan menghitung jumlah buah yang terbentuk pada setiap malai pada saat panen.
- Bobot buah rata-rata
Bobot buah rata-rata diamati dengan menimbang masing-masing buah pada malai dan dibuat rata-rata.
e) Pengamatan biji:
Panjang biji dan tebal biji diukur dengan menggunakan jangka sorong pada seluruh biji sesaat setelah panen.
- Panjang biji - Tebal biji
- Jumlah biji rata-rata per buah
Jumlah biji per buah diamati dengan menghitung jumlah biji yang terdapat pada setiap buah sesaat setelah panen.
- Jumlah biji per tanaman
Jumlah biji per tanaman dihitung dengan mengalikan jumlah buah per tanaman dengan jumlah biji rata-rata per buah.
- Bobot basah biji
Bobot basah biji diukur dengan menimbang setiap biji dari buah yang dipanen dan dirata-ratakan.
- Bobot kering biji
Bobot kering biji diukur dengan menimbang sejumlah biji yang telah dikeringkan dan dirata-ratakan.
- Bobot 100 biji
Bobot 100 biji diukur dengan menimbang 100 biji kering (kadar air 7%) dengan tiga kali pengulangan untuk setiap genotipe.
- Bobot kering biji per tanaman
Bobot kering biji per tanaman dihitung dengan mengalikan bobot kering biji rata-rata dengan jumlah biji pertanaman.
- Bobot kering biji per petak (kg)
Bobot kering biji per petak dihitung dengan menjumlahkan bobot kering biji per tanaman dalam satu petak (ukuran petak 8 m x 6 m).
- Bobot kering biji per hektar (kg)
Bobot kering biji per hektar dihitung dengan mengkonversikan bobot kering biji per petak (luas petak 48 m2) ke dalam skala penanaman untuk
luasan 1 hektar.
- Kadar minyak biji (dengan kulit biji) - Kadar minyak kernel (tanpa kulit biji)
Pengujian kadar minyak dilakukan setelah panen. Pengukuran kadar minyak dilakukan dengan mengekstraksi minyak dari biji secara mekanis dengan menggunakan blender. Analisis kandungan minyak dilakukan dengam menggunakan metode soxhlet (BSN 1992). Prosedur analisis kandungan minyak jarak pagar dengan menggunakan metode soxhlet disajikan pada Lampiran 1:
a. analisis minyak berbasis biji (tanpa mengupas kulit biji)
Bobot lemak terekstrak
% kandungan minyak = x 100 % Bobot sampel kering (biji)
b. analisis minyak berbasis kernel (dengan mengupas kulit biji) Bobot lemak terekstrak
% kandungan minyak = x 100 % Bobot sampel kering (kernel)
Percobaan II : Analisis Isozim
Analasis isozim dari delapan genotipe jarak pagar dilakukan di laboratorium Hayati, Pusat Studi Bioteknologi dan Sumberdaya Hayati IPB. Kegiatan analisis isozim meliputi penyiapan bahan tanaman, pembuatan buffer pengekstrak, buffer gel, buffer elektroda, pembuatan gel pati, ekstraksi enzim, elektroforesis, pembuatan larutan pewarna, pewarnaan dan pencucian serta pengumpulan data.
a. Persiapan bahan tanaman
Bahan tanaman yang digunakan untuk analisis isozim adalah daun muda yang masih segar (daun yang berada di bagian pucuk yang merupakan daun kedua). Daun tanaman jarak pagar dipetik dari pohon di lokasi dan disusun pada kertas koran basah. Setelah itu masing-masing daun yang telah disusun dengan koran basah dimasukkan ke dalam kantong plastik dan diberi label. Selanjutnya di laboratorium contoh daun tersebut dipindahkan ke dalam refrigerator untuk digunakan sebagai bahan ekstraksi enzim.
b. Pembuatan buffer pengekstrak
Jaringan daun dianalisis berupa ekstrak bahan kasar, tanpa pemurnian protein yang rumit atau yang memerlukan tahapan-tahapan konsentrasi tertentu. Fungsi buffer pengekstrak ini adalah dapat membantu menghancurkan sel dalam suatu jumlah minimum tanpa menimbulkan panas terhadap ekstrak dan perubahan warna terhadap daun yang diekstrak. Buffer pengekstrak sebanyak 40 ml dibuat dengan melarutkan 0.07045 g L-asam askorbat, 0.1939 g L-sistein, 0.12 ml Triton-X-100, 0.25 g PVP-40 dan 0.54 g Na2HPO4.2H2O, pH buffer diatur
sampai 7.0.
c. Pembuatan buffer gel dan buffer elektroda
Larutan buffer gel dibuat dari L-Histidin monohidrat 1.048 g yang dilarutkan dengan aquadest sampai volume satu liter. Larutan buffer diatur keasamannya dengan menambahkan Tris hingga pH 6.0.
Buffer elektroda dibuat dengan melarutkan 10.5507 g asam sitrat monohidrat dan 18.1650 g tris hidroksimetil aminometan ke dalam aquadest hingga volume satu liter dan pH akhir diatur sampai pH 6.0.
d. Pembuatan gel pati
Pembuatan gel pati yang mengandung 10% pati kentang dilakukan dengan melarutkan 10 g pati kentang ke dalam 100 ml larutan buffer gel. Diawali dengan mencampur pati dengan sepertiga bagian buffer gel dan dua pertiga bagian dimasak terlebih dahulu dengan menggunakan hot plate sampai mendidih. Setelah mendidih diangkat dan dicampurkan dengan campuran sepertiga buffer gel dan pati kemudian dimasak lagi sampai terlihat bening. Gel divakum selama kurang lebih 30 detik. Setelah itu gel dituangkan ke dalam cetakan yang terlebih dahulu permukaan bagian atas telah diolesi parafin cair dan lubang pada kaki cetakan telah ditutup dengan selotip. Setelah gel dingin cetakan gel ditutup dengan plastik yang telah diolesi parafin dan disimpan pada suhu kamar.
e. Ekstraksi enzim
Daun jarak pagar yang masih segar ditimbang sebanyak 100 – 200 mg lalu digunting halus dan digerus sampai halus dalam mortar yang telah ditambahkan dengan 0.5 ml buffer pengekstrak dan pasir kuarsa, untuk mendapatkan ekstrak dari jaringan tanaman. Ekstrak jaringan ini kemudian diserapkan pada kertas saring yang berukuran ± 0.5 cm x 0.5 cm. Kertas saring kemudian disisipkan ke dalam gel pati sesuai dengan urutan lubangnya. Pada salah satu lubang yang paling pinggir disisipkan kertas saring yang telah diberi cairan bromophenol blue sebagai indikator mobilitas elektroforesis.
f. Elektroforesis
Selotip pada kaki cetakan gel dilepaskan, kemudian permukaan cetakan gel (yang telah disisipi kertas saring) ditutup dengan plastik bening yang telah diolesi parafin cair. Cetakan gel tersebut dimasukkan ke dalam tray yang telah diisi larutan buffer elektroda. Kaki cetakan harus terendam dalam buffer elektrode. Tray diletakkan dalam ruangan berpendingin atau lemari es pada suhu
antara 5-10 oC. Elektroforesis dilakukan dengan menghubungkan tray dengan bagian anoda dan katoda pada power supply. Elektroforesis awal berlangsung selama 1 jam pada tegangan listrik 50 volt, setelah 1 jam tegangan listrik dinaikkan menjadi 100 volt selama 4 jam.
g. Pembuatan larutan pewarna, pewarnaan dan pencucian
Setelah selesai elektroforesis, plastik penutup gel dibuka. Kertas saring yang telah disisipkan dikeluarkan dari lubang-lubangnya kemudian gel dibelah secara horizontal menjadi dua atau tiga lapisan (sesuai dengan ketebalannya). Lembaran gel dimasukkan ke dalam nampan kemudian diberi pewarna yang telah disiapkan.
Komposisi larutan pewarna untuk enzim Peroksidase (PER), Esterase (EST), Aspartat aminotransferase (AAT), Malat dehidrogenase (MDH) dan Alkohol dehidrogenase (ADH) disajikan pada Lampiran 2. Selanjutnya nampan ditutup dengan aluminium foil dan disimpan pada suhu ruang sampai muncul pita-pita pada gel yang cukup jelas. Perendaman dalam larutan pewarna memerlukan waktu antara satu sampai dua jam atau lebih. Dua jam kemudian gel dicuci dengan air bersih untuk menghilangkan sisa pewarna.
h. Interpretasi pola pita isozim
Gel diletakkan di atas plastik bening dan diletakkan di atas lampu pengamatan untuk diambil data dan difoto. Pola pita isozim yang tampak digambar pada plastik transparan, hasil foto diamati dan diukur jarak pergerakan pita dari titik awal. Hasil pengukuran jarak pergerakan ditentukan pola pada Rf (relative electrophoresis mobility) dengan perhitungan (Sastrosumarjo et al. 2006):
Rf = Jarak pergerakan pita dari tempat awal Jarak pergerakan warna pelacak dari awal
Analisis Data
Analisis Karakter Agronomi dan Parameter Genetik
Data yang diperoleh dianalisis sidik ragamnya sesuai dengan rancangan acak kelompok (RAK), jika berbeda nyata dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan pada taraf 5%. Perhitungan sidik ragam dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Analisis keragaman rancangan acak kelompok
Sumber Keragaman Derajat Bebas (db) Kuadrat Tengah (KT) Nilai Harapan
Ulangan ( r ) r-1
Genotipe (g) g-1 M2 σ2e + r.σ2g
Galat (e) (g-1)(r-1) M1 σ2e
Rumus parameter genetik yang digunakan adalah sebagai berikut (Singh dan Chaudhary 1979): M2 - M1 dimana: Vg = σ2g = ragam genotipe Vp = σ2p = ragam genotipe r = ulangan x = rataan umum
h2bs = heritabilitas arti luas
M1 = kuadrat tengah galat M2 = kuadrat tengah genotipe KKG = koefisien keragaman genetik KKP = koefisien keragaman fenotipe
Pengelompokan nilai heritabilitas arti luas menurut Stansfield (1983): rendah (h2 < 20%), sedang (20% < h2 < 50%) dan tinggi (50% < h2 < 100%). Kriteria KKG dan KKP relatif adalah rendah (0 < x < 25%), agak rendah (25% < x < 50%), cukup tinggi (50% < x < 75%), dan tinggi (75% < x ≤ 100%) (Moedjiono dan Mejaya 1994).
Untuk mengetahui keeratan hubungan antara dua karakter agronomi yang diamati digunakan analisis korelasi sederhana. Besarnya pengaruh langsung dan tidak langsung untuk masing-masing karakter terhadap hasil ditentukan dengan
r Vg = σ2g = Vp = σ2 p = σ2e + σ2g σ2g σ2p h2bs = KKG = [ √ σ2g ] . 100% x KKP = [ √ σ2p ] . 100% x
analisis lintas (path analysis) seperti yang dikemukakan oleh Singh dan Chaudhary (1979) (Gambar 2):
Gambar 2. Hubungan sebab akibat antara karakter tanaman (1,2,3,....k) terhadap hasil (Y)
P1g, P2g, P3g, ..., Pkg adalah koefisien lintas, yang menunjukkan pengaruh langsung
dari beberapa sifat tanaman (1,2,3,..., k) terhadap suatu sifat (Y); sedangkan Psg adalah koefisien lintas yang menunjukkan pengaruh langsung sifat-sifat yang lain (sisa) terhadap suatu sifat (Y).
Koefisien lintas P1g, P2g, P3g, ..., Pkg diestimasi melalui persamaan berikut:
dengan koefisien lintas Psg diestimasi melalui persamaan berikut :
1 = P2sg + P21g + ... + P2kg + ... + 2P1gr12P2g + ... + 2P1g r1k Pkg + ... +2P3gr3kPkg
Analisis Kekerabatan
Kemiripan antar genotipe dicari berdasarkan pada koefisien kesamaan (similarity coefficients). Analisis pengelompokan jarak genetik dilakukan dengan metode pengelompokan berdasarkan rata-rata aritmatik tidak terboboti (UPGMA) menggunakan program NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis
Analisis Kesesuaian
Kesesuaian pengelompokan genotipe berdasarkan karakter agronomi dan isozim dilakukan dengan menggunakan fungsi MxComp pada program NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) versi. 2.02 (Rohlf 1998). Kesesuaian pengelompokan ditentukan atas kriteria goodness of fit, berdasarkan nilai korelasi menurut Rohlf (1998) yaitu: sangat sesuai (r > 0.9), sesuai (0.8 < r < 0.9), tidak sesuai (0.7 < r < 0.8), sangat tidak sesuai (r < 0.7).
