Bioteknologi Akuakultur Teknik Elektropo docx

(1)

Pendahuluan

Transgenesis merupakan teknik rekayasa genetik yang dilakukan melalui introduksi gen pengode karakter unik pada suatu individu yang dapat memberikan nilai tambah bagi organisme target. Beberapa contoh yaitu transfer gen pengode hormon pertumbuhan (growth hormone, GH) untuk meningkatkan laju pertumbuhan ikan hingga beberapa kali lipat, dan gen cecropin atau lisozim untuk meningkatkan resistensi ikan terhadap bakteri pathogen .Teknologi ikan transgenik mampu menghasilkan benih ikan unggul, yaitu melalui perbaikan mutu genetik ikan yang akan dipelihara atau dibudidayakan. Perbaikan mutu genetik ini bermanfaat untuk meningkatkan produksi dan produktivitas ikan.

Keunggulan ikan hasil rekayasa ini antara lain pertumbuhan cepat, tahan terhadap serangan penyakit, dan tahan terhadap lingkungan yang cukup ekstrem. Pada tulisan ini akan dikaji mengenai pengertian transgenic pada ikan, bagaimana metode atau proses yang digunakan , serta bagaimana keunggulan dari ikan transgenetik tersebut. Elektroporasi adalah sebuah metode sel-sel dalam jaringan budaya dan menundukkan melibatkan sel untuk ledakan pendek impuls listrik. Keuntungan utama dari elektroporasi adalah tidak perlu menangani dan

memanipulasi telur secara individual. Elektroporasi telah dicoba pada telur ikan, tetapi kesulitan adalah bahwa telur cukup besar dan memiliki korion. Prinsip metode ini adalah penggunaan secara singkat dan cepat rangsangan listrik untuk menembus membran sel, sehingga memungkinkan masuknya molekul DNA ke dalam embrio. Metode ini memberikan harapan keberhasilan transfer gen ikan yang digunakan.

Keberhasilan menghasilkan ikan transgenik melalui teknologi biologi molekuler dengan karakter keunggulan tertentu memberikan harapan baru dalam budidaya ikan khususnya dalam menunjang peningkatan produksi dan kualitas. Meskipun rekayasa genetika bukan segalanya karena banyaknya keterbatasan dalam menghasilkan ikan transgenik (Parenrengi 2010). Teknologi transgenik dapat digunakan dala berbagai bidang dan fungsi antara lain untuk meningkatkan laju pertumbuhan ikan, kontrol kematangan seksual, kemandulan dan diferensiasi seks, meningkatkan kelangsungan hidup dengan meningkatkan ketahanan terhadap penyakit terhadap patogen, beradaptasi dengan lingkungan yang ekstrim seperti tahan terhadap suhu dingin, mengubah karakteristik biokimia dari dalam daging untuk meningkatkan kualitas gizi dan mengubah Laporan Praktikum Besar m.k Bioteknologi Akuakultur

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Ikan Departemen Budidaya Perairan

Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor

2016

Perlakuan Transgenesis Ikan Mas Metode Elektroporasi

Muhammad Fahrurrozi Absirin (C14140010), Jaka Prabowo Samudra (C14140025), Ayu Putri Frasetia (C14140032), Nuralim Paturakhman (C14140035), R M Arief Wirya Pranata (C14140046), Mauliza Yanti (C14140063), Rafi Himamana (C14140078), Anisa Septiani (C14140085), Fakih Zabar Suandi (C14140105), Intan Tri Mirmani (C14154001)

Kelompok 3

1_{Departemen Budidaya Perairan, FPIK, IPB}

ABSTRAK

Perbaikan pertumbuhan ikan budidaya dapat diupayakan dengan menerapkan metode rekayasa genetik, seperti pemijahan selektif (selective breeding) dan transgenesis/introduksi gen. Transgenesis merupakan teknik rekayasa genetik yang dilakukan melalui introduksi gen pengode karakter unik pada suatu individu yang dapat memberikan nilai tambah bagi organisme target. Beberapa contoh yaitu transfer gen pengode hormon pertumbuhan (growth hormone, GH) untuk meningkatkan laju pertumbuhan ikan seperti yang telah dilakukan pada praktikum kali ini. Rekayasa transgenesis memiliki beberapa kelebihan jika dibandingkan dengan pemijahan selektif, di antaranya dapat menghasilkan perbaikan genetik per generasi yang lebih tinggi, dan waktu pencapaian target yang lebih cepat. Ikan yang digunakan pada praktikum ini adalah ikan mas (Cyprinus carpio). Fekunditas telur dari ikan mas pada praktikum ini sebanyak 120690 telur/kg induk. Persentase FR, HR dan SR tertinggi berturut-turut yang telah diperoleh yaitu 28,79%, 20,34%, dan 100%. Motilitas awal memiliki nilai yang sama untuk masing-masing kelompok dengan skor 4 dan waktu 137 detik. Motilitas akhir terbaik ada pada kelompok 1 dengan skor 5 dan lama waktunya 187 detik. Terakhir, untuk viabilitas terbaik ada pada kelompok 5 dengan persentase 93,62%. Tujuan dari praktikum kali ini untuk memproduksi ikan mas transgenik penyandi hormon pertumbuhan. Ikan hasil elektrporasi yang telah di PCR menunjukkan hasil negatif. Hal ini dapat disimpulkan bahwa perlakuan transgenesis ikan mas menggunakan metode elektroporasi tidak berhasil atau dengan kata lain gagal.

(2)

jalur biokimia atau metabolik untuk meningkatkan pemanfaatan pangan (Tsai 2008). Tujuan dari praktikum kali ini untuk memproduksi ikan mas transgenik penyandi hormon pertumbuhan

Material dan Prosedur Alat dan bahan

Alat yang digunakan yakni cawan petri, mangkuk, tabung falkon, kuvet, gunting, jarum suntik, baskom, timbangan, micro pipet, micro tube, cover glass, kaca preparat, mikroskop,elektroporator, alat tulis, aerasi, batu aerasi, kakaban, kran aerasi, toples, selang aerasi, dan PCR. Bahan yang digunakan yakni induk ikan mas jantan dan betina, ovaprim, NaCl, plasmid, larutan giemsa 30%, akuabides, artemia, garam krosok, dan air. Prosedur

Persiapan Wadah

Akuarium yang dijadikan wadah pemeliharaan larva dibersihkan dan diklorinisasi dengan klorin NaCL 12% yang sebelumnya telah disetarakan dengan kebutuhan 5% CL. Lalu, akuarium diisi air dengan ketinggian 30cm. Wadah yang digunakan untuk pemeliharaan larva yang telah dielektroporasi berupa toples plastik yang di lubangi bagian tutupnya dan diberi selang aerasi guna pengisian oksigen di wadah pemeliharaan.

Penyuntikan Hormon

Ikan yang di alin ditimbang terlebih dahulu lalu dilakukan pengalinan guna pengecekan motilitas awal sperma. Selanjutnya, dilakuka penyuntika indukan oleh hormon. Hormon yang digunakan yakni hormon ovaprim dengan dosis 0,1 ml/ kg bobot induk jantan dan 0,5 ml/kg bobot induk betina. Pemberian hormon dilakukan secara injeksi langsung pada bagian otot punggung induk dan dimasukkan kembali ke dalam wadah indukan.

Pengalinan Induk Ikan Mas

Indukan yang telah disuntik, di alin. Setelah pengalinan, di ambil telur sebanyak 2 gram dan dipisahkan ke dalam 2 wadah (cawan petri dan mangkuk). Pada kedua wadah tersebut, di masukkan 1 gram telur ke cawan petri dan 1 gram telur ke mangkuk. Lalu, sperma yang di alin dimasukkan ke dalam tabung falkon dan diberi larutan pbs atau larutan fisiologis. Penghitungan Telur

Telur yang telah diletakkan di cawan petri dihitung jumlahnya untuk menentukan fekunditas induk ikan mas.

Elektroporasi

Elektroporasi dilakukan dengan menentukan jumlah dari zat yang digunakan. zat tersebut yakni NaCL 535,5 µl; plasmid 29,5 µl; dan sperma 25 µl. Ketiga zat ini dimasukkan dalam kuvet dengan kapasitas 590 µl. Lalu dilakukan elektroporasi di alat elektroporator dengan ketentuan voltase 100 v, 125 v, dan 150 v; lama kejutan 0,5 ms; jumlah kejutan 5; dan jeda masing-masing kejutan 0,1 s.

Uji Motilitas

Uji motilitas dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui skor atau tingkat kekuatan sperma bertahan setelah diberi perlakuan elektroporasi. Uji ini dilakukan dengan meneteskan sperma hasil elektroporasi oleh akuabides lalu diletakkan di kaca preparat dan ditutup cover glass. Setelah itu dilakukan pengamatan pergerakan sperma di bawah mikroskop.

Uji Viabilitas

Uji viabilitas dilakukan untuk mengetahui jumlah presentase sperma yang hidup setelah diberi perlakuan elektroporasi. Uji ini dilakukan dengan memberi larutan giemsa 30% di sperma dan didiamkan sampai larutan giemsa mengering. Setelah itu dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.

Perhitungan FR (Fertilization Rate)

Perhitungan fr atau yang juga dikenal dengan sebutan derajat pembuahan yakni jumlah telur yang berhasil dibuahi oleh sperma dengan ciri-ciri yakni berwarna bening mengkilap untuk telur yang terbuahi dan berwarna putih kusam untuk telur yang tidak terbuahi.

Rumus untuk perhitungan fr yakni :

FR=

Jumlah telur yang terbuahi

Jumlah telur keseluruhan

x

100

Perhitungan HR (Hatching Rate)

Perhitungan hr atau yang juga dikenal dengan sebutan derajat penetasan yakni jumlah telur yang berhasil menetas setelah dibuahi.

Rumus untuk perhitungan hr yakni :

HR=

Jumlah telur yang menetas

Jumlah telur yang dibuahi

x

100

Perhitungan SR (Survival Rate)

Perhitungan sr atau yang dikenal juga dengan sebutan derajat kelangsungan hidup yakni jumlah ikan atau larva ikan yang berhasil hidup setelah menetas.

Rumus untuk perhitungan sr yakni :

SR

=

Jumlah ikanatau larvaikan yang hidup

Jumlah ikanatau larvaikan yang menetas

x

100

Analisis PCR

Analisis pcr ini dilakukan untuk mengetahui keberadaan gen asing penyandi yang terdapat di dalam sperma maupun larva ikan mas yang telah diberi perlakuan. Sehingga dapat diketahui apakah ikan yang di elektoporasi memiliki gen penyandi dna asing yang dibawa oleh plasmid dari gen tiGH (tilapia Growth Hormone).

Penebaran Telur

Sperma beserta zat lain di dalam kuvet sebanyak 590 µl yang telah di beri perlakuan elektroporasi selanjutnya dilakukan uji motilitas (1 µl sperma); uji viabilitas (10 µl sperma); analisis pcr (50 µl sperma); dan sisanya (529 µl sperma) ditebar pada toples plastik yang telah dilubangi bagian tutupnya dan diberi aerasi.

(3)

Larva ikan mas hasil elektroporasi yang berhasil menetas dipelihara pada media toples plastik dan diberi makan berupa artemia sebanyak 1 gram perhari yang ditetaskan pada media botol plastik terbalik dengan 7,5 gram garam krosok dan 500 ml air yang diaerasi kencang serta setelah 24 jam dapat diberikan langsung sebagai pakan larva ikan mas transgen

Hasil

Berikut ini merupakan hasil pengamatan terhadap perlakuan elektroporasi pada masing-masing kelompok dengan parameter pengamatan FR, HR, SR, motilitas, dan viabilitas.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0

20 40 60 80 100 120

FR (%) HR (%) SR (%)

Grafik 1 FR, HR, dan SR pada larva hasil perlakuan elektroporasi.

Berdasarkan grafik diatas menunjukkan bahwa FR tertinggi ada pada kelompok 1 dengan persentase sebesar 28,79% dan terdapat kelompok dengan nilai persentase FR 0% yang ada pada kelompok 10. Persentase HR paling tinggi ada pada kelompok 1 dengan persentase sebesar 20,34% dan terdapat beberapa kelompok dengan persentase HR sebesar 0% yaitu kelompok 2,7,8,10.

Persentase SR sebesar 100% terdapat pada kelompok 3,4 dan 9.

Berikiut di bawah ini gambar hasil PCR pada ikan yang telah diberi perlakuan elektroporasi dan kontrol.

Gambar 1. Hasil PCR pada ikan yang telah diberi perlakuan elektroporasi dan kontrol.

Berdasarkan gambar diatas menunjukkan bahwa bagian band pada hasil PCR tidak ada yang muncul kecuali untuk sampel positif (sebagai ciri positif). Hal ini menunjukkan bahwa gen GH yang diintroduksikan ke ikan mas tidak tersisipi atau dengan kata lain gen GH yang di transfer tidak berintegrasi dengan tubuh larva ikan mas.

Berikut dibawah ini tabel hasil perlakuan elektroporasi dengan beberapa parameter. Tabel 1 Fekunditas, FR, HR, SR, motilitas, dan viabilitas hasil perlakuan elektroporasi

Kelo mpo k

Perlakuan

Fekunditas (jumlah telur/ kg iduk)

FR (%) HR (%) _(%)SR

Motilitas awal Motilitas akhir Viabilitas

Skor Waktu_(s) Skor Waktu_(s) Hidup Mati

1 kontrol 120690 28,79 20,34 73,84 4 137 5 187 56,31 43,68

2 100 120690 8,57 0,00 0 4 137 4 107 69,56 31,44

3 125 120690 21,79 1,26 100 4 137 3 22 48,45 51,54

4 150 120690 9,10 4,48 100 4 137 4 67 90,94 9,06

5 100 120690 16,95 4,13 51,71 4 137 2 81 93,62 6,38

6 125 120690 10,56 8,92 81,53 4 137 5 120 95 5

7 150 120690 9,24 0,00 0 4 137 3 130 76,63 23,37

8 100 120690 21,26 0,00 0 4 137 4 73 57,54 42,45

9 125 120690 9,34 0,14 100 4 137 4 53,8 75,44 24,56

10 150 120690 0,00 0,00 0 4 137 5 6 88,87 11,12

Berdasrkan tabel 1 di atas dapat diketahui bahwa nilai fekunditas pada masing-masing kelompok memiliki jumlah yang sama yaitu 120690 telur/kg induk.

(4)

masing-masing kelompok dengan skor 4 dan waktu 137 detik. Motilitas akhir terbaik ada pada kelompok 1 dengan skor 5 dan lama waktunya 187 detik. Terakhir, untuk viabilitas terbaik ada pada kelompok 5 dengan persentase 93,62% Pembahasan

Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetik. Salah satu kegunaan PCR adalah untuk melihat hasil analisis proses transgenesis dari ikan transgenik. Beberapa metode dalam transgenesis, salah satunya elektroporasi. Elektroporasi merupakan salah satu metode dalam transgenesis untuk menghasilkan ikan transgenik, beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam metode ini antara lain, lama kejut, voltase, jeda kejut dll. PCR dilakukan setelah ikan dari proses transgenesis sudah di elektroporasi. PCR dilakukan untuk melihat hasil dari ikan proses transgenesis, apakah mempunyai gen asing yang dibawa atau tidak, sehingga ketika berhasil terdapat ekspresi gen asing di DNA nya. Selain itu terdapat pula sisipan gen asing di urutan asam basanya. Individu ikan yang membawa gen asing diidentifikasi dengan menggunakan PCR dengan cetakan (template) DNA yang telah menentukan pula jumlah ikan dalam kelas usia ikan yang dipijahkan dengan kata lain, fekuinditas merupakan salah satu faktor yang berpengaruh terhadap tingkat produktivitas ikan (Nikolsky 1969). Pada praktikum ini dilakukan dengan menghitung jumlah telur yan dihasilkan dengan proses stripping dari masing-masing induk.

Menurut Nikolsky (1969) jumlah telur yang terdapat didalam ovari ikan disebut dengan fekuinditas individu, fekuinditas mytlak datau fekuinditas total. Fekuinditas individu sulit untuk diterapkan pada ikan yang waktu pemijahannya dilakukan beberapa kali dalam setahun, hal tersebut dikarenakan ikan mengandung telur dari berbagai tingkatan kematangannya, sehingga akan sulit untuk mengetahui dan menentukan telur yang nantinya akan dikeluarkan ditahun berikutnya. Menurut Royce (1972) Fekuinditas total merupakan jumlah telur yang dihasilkan dalam ikan selama siklus hidup ikan. Fekuinditas relative merupakan jumlah telur per satuan berat atau panjang. Pada umumnya ikan yang sudah tua dan memiliki ukuran yang relative besar fekuinditas relative lebih kecil. Fekuindita relative lebih tinggi dibandingkan fekuinditas individu. Fekuinditas relative akan menjadi maksimum pada golongan ikan yang masih muda (Nikolsky 1969 dalam Rose dkk 2001).

Berdasarkan data yang diperoleh jumlah fekuinditas sebesar 120690 telur/kg induk ikan. Jumlah fekuinditas tersebut sama totalnya untuk setiap kelompok

dan perlakuan yang dilakukan. Tinggi rendahnya jumlah telur dipengaruhi oleh bobot tubuh induk. Jumlah fekuinditas akan semakin tinggi jika penurunan bobot tubuh induk setelah memijah semakin tinggi dan diameter telur yang dihasilkan semakin kecil. Faktor lain yang mempengaruhi adalah perbedaan jumlah telur antara masing-masing spesise yang bergantung pada kemampuan individu untuk menghasilkan telur (Nikolsky 1969 dalam Rose dkk 2001).

Berdasarkan data hasil derajat pembuahan ikan Mas (Cyprinus carpio) memiliki hasil presentase berkisar 0 – 28,79 % dengan perlakuan kontrol pada kelompok 1 yang memiliki hasil derajat pembuahan paling tinggi dan perlakuan 150 volt pada kelompok 10 yang memiliki hasil derajat pembuahan paling rendah. Derajat pembuahan merupakan telur yang dibuahi pada ikan. Telur pada ikan yang telah dibuahi akan berwarna transparan sedangkan yang tidak terbuahi akan berwarna putih atau keruh (Sumantadinata, 1983). Faktor yang mempengaruhi derajat pembuahan pada telur ikan ialah kualitas telur, spermatozoa, media dan penanganan manusia. Pada telur ikan mas (Cyprinus carpio) yang telah diletakkan di air akan cepat mengembang dan akan mempercepat proses penutupan mikrofil dalam jangka dan spermatozoa tidak mampu masuk kedalam mikrofil dalam proses membuahi telur. Begitu juga sebaliknya, penambahan air yang terlalu banyak akan menyebabkan spermatozoa tidak bisa masuk atau akan lebih banyak meleset dari lubang mikrofil (Woynarovich dan Horvath 1980).

Hatching rate (HR) adalah daya tetas telur atau jumlah telur yang menetas. Telur ikan mas memiliki sifat menempel, dengan demikian penetasan telur-telur perlu dilakukan dalam wadah yang dilengkapi dengan kakaban. Hal tersebut bertujuan agar telur ikan mas tidak menumpuk di dasar wadah yang menyebabkan permukaan telur kekurangan oksigen dan mengakibatkan telur akan mati. Telur ikan mas akan menetas dalam waktu 48 jam pada suhu 290 _{C. Berdasarkan tabel 1}

(5)

memudahkan pathogen menyerang telur (Simbolon 2015).

Kelangsungan hidup (survival rate/SR) ikan adalah nilai yang menunjukkan persentase ikan pengamatan yang hidup pada akhir waktu pengamatan tertentu yang diperhitungkan terhadap jumlah total ikan pada awal pengamatan (Effendie, 1997). Berdasarkan hasil yang telah diperoleh, perlakuan kontrol memiliki persentase kelangsungan hidup sebsar 73,84%, sedangkan pada perlakuan dengan elektrporasi terdapat kelangsungan hidup larva mencapai 100%, hal ini menunjukkan bahwa tidak ada pengaruh nyata terhadap perlakuan elektroporasi dengan tingkat kelangsungan hidup larva.

Berdasarkan tabel 1 kita bisa mengetahui motilitas awal sperma sebelum perlakuan elektroporasi yaitu 137 detik dengan skor 4. Umumnya motilitas sperma akan mengalami penurunan, namun terjadi kenaikan motilitas sperma pada perlakuan kontrol (tanpa perlakuan) yaitu selam 187 detik dengan skor 5. Adapun motilitas akhir sperma terendah yaitu pada perlakuan voltase 125 yaitu selama 22 detik dengan skor 3.

Perlakuan elektroporasi dengan voltase yang berbeda mengakibatkan menurunnya tingkat motilitas spermatozoa, hal ini terjadi karena saat diberi pelakuan kejut listrik maka pori-pori membran permeabel pada spermatozoa akan terbuka. Semakin besar voltase pada metode elektroporasi maka semakin lebar membran melalui membran permeabel yang telah rusak sehingga kemampuan motilitas spermatozoa akan menurun (Faqih 2011).

Berdasarkan dari data hasil yang diperoleh tingkat viabilitas berkisaran antara 48,46-95%. Sedangkan viablitas kematian yaitu memperoleh nilai berkisaran sebesar antara 5-51,54%. Viabilitas sperma dihitung setelah pemberian pewarnaan giemsa. Pewarnaan giemsa dapat mempermudah untuk membedakan sperma yang hidup dan sperma yang mati. Viabilitas sperma dapat dipengaruh oleh suhu . semakin rendah suhu maka tingkat viabilitas sperma tersebut tinggi. Sedangkan semakin tinggi suhu tempat penyimpanannya, maka tingkat viabilitas sperma semakin rendah. Dari data diatas tingkat viabilitas sesudah di lakukan elektroporasi masih memiliki tingkat viabilitas yang cukup tinggi hingga mencapai 95% (Tsai 2000).

Berdasarkan hasil identifikasi menggunakan PCR, menunjukkan bahwa bagian band pada hasil PCR tidak ada yang muncul atau terekspresi kecuali untuk sampel positif (sebagai ciri positif). Hal ini menunjukkan bahwa gen GH yang diintroduksikan ke ikan mas tidak tersisipi atau dengan kata lain gen GH yang di transfer tidak berintegrasi dengan tubuh larva ikan mas. Hal ini dapat disebabkan karena umur induk yang belum siap untuk memijah, pematangan gonad yang belum cukup, serta kesalahan dalam metode dan prosedur pembuatan sampel (Faqih 2011).

Kesimpulan

Kelangsungan hidup larva ikan yang telah diberi perlakuan elektroporasi pada beberapa kelompok menunjukkan hasil SR yang cukup baik dibandingkan dengan kontrol yang tidak diberi perlakuan elektroprasi sehingga disimpulkan bahwa perlakuan kejut listrik tidak terlalu mempengaruhi kelangsungan hidup ikan. Meskipun demikian, hasil dari PCR menunjukkan hasil negatif pada setiap kelompok. Hal ini dapat disimpulkan bahwa perlakuan transgenesis ikan mas menggunakan metode elektroporasi tidak berhasil atau dengan kata lain gagal. Oleh sebab itu perlu adanya evaluasi kembali letak kegagalan dari praktikum ini.

Daftar Pustaka

Alimuddin, Yoshizaki G, Carman O, Takeuchi T. 2007. Efektivitas promoter hCMV, mEF1α dan mAct dalam mengatur ekspresi gen asing pada transgenik ikan zebra. Jurnal Akuakultur Indonesia. 6(1): 65-77.

Effendie MI. 1997. Biologi Perikanan. Yayasan Pustaka Nusantara. Yogyakarta.155 hal.

Faqih AR. 2011. Penurunan daya motilitas dan fertilitas sperma ikan lele dumbo (Clarias spp.) pada perlakuan stress kejutan listrik. J. Exp. Life Sci. 1(2):56-110.

Niklosky, G. V. 1969. Theory of Fish Populatio Dynamic, as the Biological Background of rational Explotation and the management of Fishery Resources.

Parenrengi, A. 2010. Peningkatan Resistensi Udang Windu Penaeus monodon terhadap Penyakit White Spot Syndrome Virus melalui Transfer Gen Penaeus Monodon Antiviral. Disertasi. IPB, 113 hlm

Rose, G. 2001. Visual Methodologies : An Introduction to the Interpretation of Visual Materials. London 3(4).

Sumantadinata, K. 1995. Present State of Common Carp (Cyprinus carpio L.) Stock in Indonesia. Aquaculture, 129 : 205-209.

Tsai H .2000. Electroporated sperm mediation of gen Transfer System For Finish and Shellfish. Molecular Reproduction and Development 56:281-284.

Tsai, H.J. 2008. Use of Transgenic Fish Possessing Special Genes as Model Organisms and Potential Applications. Journal of Genetics and Molecular Biology, 19(1):22-38.