BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancang Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental untuk menentukan
formula yang optimal terhadap karakteristik fisik sediaan pasta gigi ekstrak kayu siwak (Salvadora persica L.) dan ekstrak daun sirih merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav.) dengan menambahkan berbagai konsentrasi Na-CMC
untuk stabilitas.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah variasi konsentrasi Na-CMC. 2. Variabel Tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah sifat fisik sediaan pasta gigi dan diameter zona hambat pasta gigi terhadap pertumbuhan bakteri
Streptococcus mutans.
3. Variabel Terkendali
Variabel terkendali pada penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak kayu siwak (Salvadora persica L.) dan ekstrak daun sirih merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav.) serta metode pembuatan sediaan pasta gigi.
C. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Teknologi Farmasi dan
Laboratorium Biologi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto serta Laboratorium Mikrobiologi dan Virologi Fakultas Biologi Universitas Muhammadiyah Purwokerto yang dilakukan selama 5 bulan.
D. Alat dan Bahan
1. Bahan penelitian
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah batang kayu siwak dan daun sirih merah , etanol 70% no.batch 870170201 diproduksi
oleh PT.Brataco Cikarang, Gliserin, Na-CMC kualitas farmasi dikemas ulang PT.Brataco, kalsium karbonat light (CaCO3 light) kadar
98.5-100.5% batch orginal 62525 ex. Konoshima chemical co. ltd (Jepang) dikemas ulang oleh PT.Brataco , Na-Lauril sulfat, Na-sakarin, oleum menthae piperitae, metil paraben dan propil paraben diproduksi oleh PT.Brataco, Aquadest, HCL pekat, FeCl 1 %, Nutrien Agar dan Nutrien Borth, dan bakteri Streptococcus mutans dari laboratorium mikrobiologi Universitas Jenderal Soedirman.
2. Alat penelitian
Alat yang digunakan adalah Oven UM-300 memmert dan Oven memmert tipe UM-400 made in jerman, Gelas ukur Pyrex® 10ml; 100ml, Timbangan analitik shimadzu model TXB622L dan model ATX224, Cawan porselen, pH 0-14 Universal indicator werck merck KGaA 64217 darmstadt germany, Rotary evaporator (vacobrand CVC 3000 IKA®HB10 model RV 10 8599 made in IKA), H-3F-27L Water bath model XMTD-204, Mortir dan Stamper, Slides microscope made in china, Centrifuge OLC Series PLC-03, Viskometer Brookfield tipe DV2T LV spindel, Jarum ose tumpul, Spektrofotometri uv-vis tipe 9100 merk palintest-UK, Cawan petri herma 100x15 mm dan petridish glass 60x15mm, Lampu spiritus,
Centrifuge merk table top centrifuge pic03 230 VAC produksi germany industrial Corp, Sumuran, Hot plate IKA C-MAG HS 7, Autoklaf All American Electric Sterilizer 75X dan Horizontal Laminar Air Flow
mascotte model LH S.
E. Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi ini dimaksudkan untuk menetapkan atau memastikan kebenaran dari sampel yang digunakan dalam penelitian yaitu benar kayu siwak (Salvadora persica L.) dan daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) yang dimaksud. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman.
2. Pembuatan simplisia tanaman
Tanaman kayu siwak (Salvadora persica L.) diperoleh di Toko Herbal Arab di kawasan kota Cirebon Jawa Barat yang telah di determinasi kemudian dibersihkan dengan air mengalir agar tidak ada debu atau kotoran yang menempel. Daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) diperoleh dikawasan Majenang, Jawa Tengah, daun sirih merah yang telah di determinasi kemudian dibersihkan dari kotoran-kotoran yang menempel dengan cara dicuci dengan air mengalir sampai bersih.
Kayu siwak (Salvadora persica L.) dan daun sirih merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav.) yang telah bersih dan bebas dari sisa air cucian
dikeringkan dalam lemari pengering selama 3 hari dengan tujuan untuk mengurangi kadar air dan menghentikan proses reaksi enzimatik dalam kayu siwak (Salvadora persica L.) dan daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.), sehingga mencegah penurunan mutu atau rusaknya kandungan simplisia. Setelah itu simplisia kering dibersihkan kembali dari kotoran yang mungkin tidak hilang pada saat pencucian. Tahap selanjutnya simplisia kering diblender sehingga menjadi simplisia serbuk untuk memperkecil ukuran partikel kayu siwak (Salvadora persica L.) dan daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) sehingga luas permukaan partikel daun yang nantinya kontak dengan pelarut akan maksimal pada proses maserasi, setelah itu serbuk simplisia diayak dengan menggunakan ayakan, kemudian disimpan dalam wadah bersih dan tertutup rapat.
3. Penetapan susut pengeringan
Ekstrak kayu siwak (Salvadora persica L.) dan ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) masing-masing ditimbang seksama lebih kurang 1 g, dalam botol kaca dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan dengan suhu 105 ºC selama 30 menit dan telah ditara. Masing-masing ekstrak diratakan dalam botol kaca dengan menggoyangkan botol. Botol dimasukkan ke dalam oven, tutupnya dibuka, panaskan pada suhu 105 ºC selama 1 jam. Botol didinginkan dalam desikator selama 15 menit, kemudian ditimbang hingga bobot tetap (Moerfiah, 2011).
4. Metode ekstraksi
Pembuatan ekstrak kayu siwak (Salvadora persica L.) dan ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) dilakukan dengan metode maserasi. Perbandingan antara serbuk dengan larutan penyari yaitu 1:10 (b/v). Serbuk simplisia dimaserasi dengan etanol 70% sebagai pelarut, pemilihan etanol 70% dikarenakan penyari tersebut tidak beracun, absorbsinya baik, panas yang diperlukan untuk pemekatan lebih sedikit dan dapat menyari zat aktif. Maserasi dilakukan selama 5 hari dengan cara serbuk simplisia kayu siwak (Salvadora persica L.) dan daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) yang telah ditimbang masing masing dimasukkan ke toples besar, kemudian ditambahkan pelarut etanol 70%, dan diaduk selama 2 jam setiap harinya. Proses pengadukan dilakukan agar penyari tidak menjadi jenuh, karena apabila penyari menjadi jenuh maka akan sulit untuk menyari zat aktif. Perendaman ini dilakukan pada suhu kamar (28-32 ºC). Setelah 5 hari kemudian disaring dengan kain flanel (Andini et al., 2014).
Proses maserasi diperoleh maserat yang diuapkan dengan rotary
evaporator dan menggunakan water bath pada suhu 60 ⁰C. Proses penguapan dilakukan selama 5 hari dimana 1 hari untuk rotary evaporator dan 4 hari untuk penguapan di water bath sampai dihasilkan ekstrak kental. Penguapan dilakukan untuk menghilangkan penyari di dalam maserat. Ekstrak dikemas setelah bobot konstan (Karima, 2015).
Ekstrak kayu siwak (Salvadora persica L.) dan ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) yang telah kental dimasukkan ke dalam wadah tertutup rapat dan disimpan di dalam lemari pendingin dengan suhu 2-8 °C. Penyimpanan ekstrak berfungsi untuk menjaga kualitas dari ekstrak dan untuk menghindari kerusakan zat aktif serta untuk menghindari dari jamur atau mikroba. Kemudian ekstrak kayu siwak (Salvadora persica L.) dan ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) yang di dapat dihitung bobot rendemennya dengan cara bobot ekstrak dibagi dengan bobot serbuk dikali 100%.
5. Identifikasi senyawa
a. Saponin (Depkes RI, 1979)
Sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 10 ml
air, kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 menit. Positif jika terbentuk buih kurang dari 10 menit.
b. Flavonoid (Harbone, 1987)
Sampel dicampur dengan 5 ml etanol, dikocok, dipanaskan, dikocok lagi kemudian disaring, dan ditambahkan Mg 0,2 g serta 3 tetes HCL pekat pada masing-masing filtrat. Terbentuknya warna merah pada lapisan etanol menunjukkan adanya flavonoid.
c. Tanin (Rahman, 2009)
Sebanyak 10 g serbuk ditambah 10 ml air, didihkan selama 15 menit, setelah dingin kemudian di saring dengan kertas saring. Filtrat ditambah 1-2 tetes FeCl 1%, terbentuknya warna biru, hijau atau hitam menunjukkan adanya senyawa golongan tanin.
6. Pembuatan sediaan pasta gigi a. Komponen formula
Tabel 3.1. Komponen Formula
Bahan Formula
1 2 3 4
Ekstrak kayu siwak 5 % 5% 5% 5%
Ekstrak daun sirih merah 5% 5% 5% 5%
Na-CMC 0,5% 1,0% 1,5% 2,0%
CaCO3 30% 30% 30% 30%
Gliserin 25% 25% 25% 25%
Na-Lauril sulfat 2% 2% 2% 2%
Na-sakarin 0,2% 0,2% 0,2% 0,2%
Oleum menthae piperitae 0,5% 0,5% 0,5% 0,5%
Metil paraben 0,18% 0,18% 0,18% 0,18%
Propil paraben 0,02% 0,02% 0,02% 0,02%
Akuades ad 100% ad 100% ad 100% ad 100%
(Nursal, 2010)
b. Pembuatan formulasi
Formula pasta gigi ekstrak kayu siwak (Salvadora persica L.) dan ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) sebanyak 50 g. Kemudian timbang semua bahan yang akan digunakan, panaskan mortir dan stamper. Kemudian Na-CMC dimasukkan dengan cara ditaburkan diatas gliserin secukupnya didalam mortir panas sehingga homogen dan
tidak terdapat gumpalan, selanjutnya melarutkan metil paraben dan propil paraben dengan gliserin secukupnya di atas kaca arloji kemudian masukan ke dalam campuran. Ekstrak kayu siwak (Salvadora persica L.) dan ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) dimasukkan kedalam campuran diaduk sampai halus dan homogen, tambahkan CaCO3 sedikit demi sedikit dengan akuades kemudian aduk
sampai halus dan homogen. Na-Sakarin yang telah dilarutkan dengan sisa gliserin dimasukkan ke dalam campuran sampai homogen. Na-Lauril sulfat yang telah dilarutkan dengan sisa gliserin dimasukkan kedalam campuran sediaan dan diaduk dengan kecepatan rendah. Oleum menthae piperatae ditambahkan ke dalam campuran tersebut lalu diaduk hingga homogen, sediaan yang telah jadi kemudian dimasukkan ke dalam wadah, setiap formula direplikasi 3 kali (Nursal, 2010).
7. Evaluasi pasta gigi a. Organoleptis (SNI)
Pemeriksaan sediaan pasta dilakukan uji organoleptis meliputi pemeriksaan warna, bau, homogenitas sediaan. Sediaan dapat dikatakan stabil jika bau, warna dan homogenitas secara visual sama seperti setelah pembuatan dan tidak ditumbuhi jamur, diamati selama 28 hari (Sanja., 2011).
b. Homogenitas
Pasta gigi dioleskan di atas kaca objek, ditutupi dengan cover glass, diamati secara visual. Homogenitas sediaan diamati dari permukaan yang terbentuk pada kaca objek.
Pasta pada masing-masing formula diambil 1 g dan dioleskan pada plat kaca, diraba, dan digosokkan. Masa pasta harus menunjukkan susunan homogen yaitu tidak terasa adanya bahan padat pada kaca (Sanja., 2011).
c. Pengukuran pH
Sebanyak 0,5 g pasta diencerkan dengan 5 ml akuades, kemudian pH stik dicelupkan selama 1 menit. Perubahan warna yang terjadi pada pasta menunjukkan nilai pH dari pasta (Naibaho et al., 2013).
d. Pengukuran tinggi busa (Rieger., 1985)
1) Pengukuran tinggi busa dalam air suling (Akuades)
Tinggi busa dari 0,1% larutan sediaan dalam air suling, dapat diukur menggunakan gelas ukur. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan metode sederhana yang akan menghasilkan hasil yang dapat disamakan dengan tes Ros miles antara lain: 25 ml larutan dimasukkan ke dalam gelas ukur 100 ml, kocok dengan cara membalikkan gelas ukur lebih dari 5 kali, lalu segeralah amati tinggi busa yang dihasilkan.
2) Pengukuran tinggi busa dalam air sadah
Prosedur serupa dengan pengukuran tinggi dan stabilitas busa dalam air suling. Namun air yang digunakan merupakan air sadah yang dibuat dengan melarutkan 0,233 g kalsium karbonat dan 0,116 g magnesium karbonat dalam air suling sedikit demi sedikit dan ditambahkan HCL setetes demi setetes hingga larut dalam labu ukur 1000 ml, dan ditambahkan akuades hingga tanda pada labu ukur. e. Uji pemisahan fase (Lachman et al., 1994)
1) Metode sentrifugasi
Sampel dimasukkan di dalam tabung sentrifugal, kemudian alat diatur dengan kecepatan 3750 rpm selama 5 jam.
2) Metode freeze thaw (Uji Stabilitas)
Siklus pemisahan fase dengan metode freeze thaw pada sediaan pasta gigi dilakukan selama 6 siklus. Uji ini dilakukan dengan menyimpan sediaan sebanyak 8 g pada suhu 4 °C selama 24 jam, kemudian sediaan dipindahkan ke suhu 45 °C selama 24 jam (1 siklus).
f. Viskositas (Lachman et al., 1994)
Viskositas sediaan pasta gigi diukur dengan menggunakan Viskometer Brookfield pada kecepatan 50 rpm dengan menggunakan spindle nomor 64 (Olii, 2013). Hasil viskositas dicatat setelah viskotester menunjukkan angka yang stabil. Viskositas diukur selama 28 hari.
8. Uji aktivitas antibakteri a. Sterilisasi alat dan bahan
Sterilisasi merupakan proses penghilangan semua jenis mikoorganisme hidup (protozoa, fungi, bakteri, mikoplasma, virus) yang terdapat di dalam suatu benda. Pada uji antibakteri perlakuan harus dalam keadaan steril, sehingga semua alat dan bahan yang akan dipergunakan juga harus dalam keadaan steril. Kesterilan dari alat dan bahan harus dijaga agar media yang digunakan tidak terkontaminasi oleh mikrorganisme lain yang dapat mempengaruhi hasil uji aktivitas antibakteri. Cara untuk mensterilkan alat dan bahan yaitu dengan sterilisasi basah menggunakan autoklaf. Autoklaf dapat membunuh mikroorganisme pada suhu 121 °C pada tekanan 1 atm selama 15 menit. Selain dengan autoklaf, ose disterilkan dengan pembakaran menggunakan api langsung (Ari, 2008).
b. Pembuatan media NA (Nutrien Agar)
Media NA (Nutrien Agar) digunakan sebagai media padat pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans. Membuat media agar NA yaitu sebanyak 2,3 g serbuk NA dimasukkan kedalam erlenmeyer lalu dilarutkan dalam 100 ml akuades. Lalu dipanaskan diatas hot plate sambil diaduk sampai mendidih kemudian masukkan kedalam tabung reaksi masing-masing tabung berisi 7 ml, disterilkan dengan menggunakan autoklaf dengan suhu 121 ⁰C selama 15 menit dengan tekanan 2 atm, lalu didiamkan dalam suhu kamar sampai membeku sebagian pada posisi miring. Dan sebagian pada posisi tegak, kemudian disimpan dalam lemari pendingin (Kaliyah, 2015).
c. Pembuatan media NB (Nutrien Broth)
Media NB (Nutrien Broth) digunakan sebagai media cair untuk
pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans pada pembuatan suspensi bakteri. Membuat media NB yaitu masing-masing tabung berisi sebanyak 0,8 g serbuk NB dimasukkan kedalam erlenmeyer lalu larutkan dalam 100 ml akuades, lalu dipanaskan diatas hot plate sambil diaduk sampai mendidih, lalu disterilkan dengan menggunakan autoklaf dengan suhu 121 ⁰C selama 15 menit, kemudian masukkan kedalam tabung reaksi masing-masing 7 ml, lalu didiamkan dalam suhu kamar sampai membeku pada posisi miring, kemudian disimpan dalam lemari pendingin (Kaliyah, 2015).
d. Peremajaan isolat bakteri
Penanaman isolat Streptococcus mutans dalam medium NB
dilakukan dengan cara isolat Streptococcus mutans yang berasal dari stok diambil dengan jarum ose steril lalu disuspensikan kedalam tabung reaksi yang berisi NB secara aseptik, kemudian di inkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 24 jam. Inkubasi dilakukan pada suhu optimum yaitu 37 ⁰C selama 24 jam. Inkubasi merupakan suatu teknik perlakuan bagi mikroorganisme yang telah diinokulasi pada media. Bakteri yang diinkubasi disimpan didalam inkubator pada suhu tertentu. Pada hal ini penyimpanan dilakukan pada suhu 37 ⁰C karena pada suhu tersebut bakteri Streptococcus mutans akan tumbuh pada waktu 18-24 jam. Apabila penyimpanan tidak sesuai dengan suhu yang dikehendaki biasanya bakteri tidak akan tumbuh (Hadioetomo, 1985).
e. Pembuatan suspensi isolat bakteri Streptococcus mutans
Bakteri yang dibiakan pada media agar diambil dengan
menggunakan jarum ose steril kemudian ditanam pada media pertumbuhan NA miring dan diinkubasi pada 37 ⁰C selama 24 jam. Bakteri Streptococcus mutans diambil satu sampai dua ose dilarutkan dalam media cair yaitu media NB (Nutrien Broth) yang dilakukan di dalam Laminar Air Flow. Kemudian diinkubasi pada suhu optimum yaitu 37 ⁰C selama 24 jam. Media NB (Nutrien Broth) merupakan
media cair untuk pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans. Pada pembuatan suspensi bakteri, media NB (Nutrien Broth) yang sudah ditanam selama 24 jam, bakteri uji diukur serapannya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm sampai memberikan absorbansi 0,1 (setara dengan 1,5x108 CFU/ml) (Tiara, 2014).
f. Uji aktivitas antibakteri
Sebagai ukuran aktivitas anti mikrobanya maka dilakukan
pengukuran zona hambat berupa area bening disekitar sumuran dengan menghitung diameter hambatnya menggunakan jangka sorong. Lakukan replikasi sebanyak 3 kali. Semakin besar atau luas zona hambatnya maka semakin kuat aktivitas antibakterinya.
Pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi agar dengan sumuran. Suspensi bakteri ditambahkan kedalam media padat NA, lalu diputar supaya homogen, didinginkan dan menjadi padat dalam cawan petri steril, kemudian dibuat sumur dengan diameter 6 mm dengan menggunakan perforator, setelah itu dimasukkan 50 mg masing-masing sampel dan pembanding. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C. Diameter hambat diamati setelah periode inkubasi. Semakin besar atau luas zona hambat maka semakin kuat aktivitas antibakterinya. Lakukan replikasi 3 kali (Fulviana, 2013).
9. Analisis hasil
Berdasarkan data dari hasil uji sifat fisik organoleptis, homogenitas
analisis yang digunakan adalah analisis deskriptif. Uji tinggi busa, uji pemisahan fase, uji pH, uji viskositas, dan uji aktivitas antibakteri menggunakan analisis statistik yang digunakan adalah analisis statistik one
way ANOVA pada taraf kepercayaan 95% (α= 0,05) untuk melihat adanya
