23
BAB III
PENGEMBANGAN MARKA SIMPLE SEQUENCE REPEAT (SSR) UNTUK Jatropha spp.
Abstrak
Pemuliaan tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.) untuk menghasilkan kultivar berdaya hasil dan berkadar minyak tinggi perlu dilakukan. Penggunaan marka molekuler dapat membantu mempercepat tercapainya tujuan pemuliaan tanaman jarak pagar. Marka simple sequence repeat (SSR) merupakan marka ko-dominan yang efektif untuk mendukung program pemuliaan tanaman, tetapi penerapannya pada jarak pagar masih terbatas. Penelitian yang dilakukan bertujuan: (i) mendesain primer spesifik SSR menggunakan aksesi DNA jarak pagar yang tersedia di GenBank DNA database dan (ii) mengevaluasi efektivitas pasangan primer yang didesain untuk menghasilkan marka SSR yang polimorfik untuk jarak pagar dan J. multifida. Dua puluh delapan pasang primer spesifik SSR telah berhasil didesain menggunakan aksesi DNA asal jarak pagar yang ada di GenBank DNA database. DNA genomik jarak pagar dan J. multifida yang diisolasi dapat digunakan sebagai templat untuk amplifikasi PCR. Dari 28 pasang primer yang dikembangkan, semuanya mampu menghasilkan marker SSR dari genom jarak pagar dan hanya 14 pasang primer yang menghasilkan marker SSR dari genom J.
multifida. Dari 19 pasangan primer spesifik SSR yang dievaluasi mampu dihasilkan 44 alel dengan ukuran produk amplifikasi berkisar antara 100 bp – 360 bp. Sebanyak 35 alel (79.5%) yang diamati merupakan alel yang polimorfik.
Marker SSR yang didapatkan tidak polimorfik intra-aksesi jarak pagar atau intra- aksesi J. multifida tetapi polimorfik untuk inter-aksesi kedua spesies. Karena marker SSR yang dihasilkan bersifat polimorfik untuk aksesi jarak pagar dengan aksesi J. multifida maka dapat digunakan sebagai marka untuk mendeteksi hasil persilangan F1 inter-spesies J. curcas x J. multifida.
Kata kunci : jarak pagar, Jatropha curcas L., DNA berulang, desain primer
24
Development of Simple Sequence Repeats (SSRs) Markers for Jatropha spp.
Abstract
Breeding of physic nut (Jatropha curcas L.) to obtain new cultivars that have high yield and high oil content need to be conducted. Molecular marker could be used to assist breeding of physic nut. Simple sequence repeat (SSR) marker is a co- dominant marker and theoretically it could be used to support physic nut breeding program. However, only limited information were available regarding molecular analysis of physic nut. The objectives of this research were: (i) to design SSR specific primer based on DNA sequences available in the GenBank DNA database and (ii) to evaluate effectiveness of the primer pairs to produce polymorphic SSR markers for J. curcas and J. multifida. Twenty eight primer pairs were designed and developed using physic nut DNA available in the GenBank DNA database.
Total genomic DNA isolated from J. curcas and J. multifida could be used as DNA templates for PCR amplification. The 28 primer pairs developed in this research yielded SSR marker using J. curcas genomic DNA, while only 14 out of 28 primer pairs developed yielded SSR markers using J. multifida genomic DNA. As many as 44 alleles with the size of amplified products ranged from 100 bp – 360 bp were identified. Thirty five alleles (79.5%) out of 44 identified ones were polymorphic.
Results of analysis indicated that identified SSR markers generated using the designed primers were not polymorphic intra accession of J. curcas nor intra- accession of J. multifida. However, the generated SSR markers were polymorphic for inter-accession of the two Jatropha species. Since the generated markers were only polymorphic for J. curcas and J. multifida, they could be used as marker for identifying interspecific F1 hybrids derived from crossing between J. curcas and J.
multifida.
Keywords: physic nut, Jatropha curcas L., DNA repeat sequence, primer design
25 Pendahuluan
Jarak pagar (Jatropha curcas L.) adalah tanaman tahunan multifungsi, yang merupakan anggota Euphorbiaceae. Pada awalnya jarak pagar digunakan sebagai tanaman obat. Beberapa tahun terakhir ini jarak pagar lebih dikenal sebagai tanaman penghasil minyak yang dapat digunakan untuk biodiesel. Jarak pagar berasal dari Mexico dan Amerika Tengah yang kemudian menyebar ke daerah tropis maupun subtropis. Tanaman jarak pagar pada awalnya ditanam sebagai pagar pengaman atau untuk keperluan tradisional lainnya (Heller, 1996).
Pada beberapa tahun terakhir ini nilai ekonomi jarak pagar sebagai penghasil biodiesel meningkat pesat (Fairless, 2007). Hal penting yang harus dilakukan untuk dapat menggunakan jarak pagar sebagai penghasil biodiesel adalah pengembangan kultivar yang memiliki hasil biji dan kadar minyak tinggi serta dapat beradaptasi dengan baik pada berbagai kondisi lingkungan (Divakara et al., 2010).
Plasma nutfah jarak pagar telah dikoleksi dan dianalisis di Brazil, Indonesia, dan Cina (Ou et al., 2009; Tatikonda et al., 2009).Jarak pagar memiliki genom heterosigot dan beberapa penelitian menunjukkan nilai interaksi genetik dan lingkungan yang cukup besar (Makkar et al., 1997; Kaushik et al., 2007) sehingga program pemuliaan konvensional tidak akan efektif. Strategi pemuliaan berbasis genom sangat penting dilakukan. Sampai saat ini pemetaan genetik jarak pagar belum dilakukan dan informasi genetik berdasarkan marka molekuler masih sangat sedikit ketersediaannya.
Marka SSR masih dianggap sebagai marka yang paling efisien tetapi penggunaannya masih terbatas karena memakan banyak waktu dan tenaga dalam pengembangannya. Ada dua strategi umum yang digunakan untuk mengakses daerah yang mengandung SSR dan membuat markanya yaitu : (1) penelusuran sekuen yang mengandung SSR pada basis data yang telah tersedia atau (2) konstruksi dan skrining pustaka genom dengan pelacak yang berkaitan dengan SSR. Cara pertama dinilai sangat hemat, sederhana dan relatif cepat (Rakoczy et al., 2004). Strategi ini telah berhasil dikembangkan pada tanaman cabai (Sanwen et al., 2000) dan buncis (Guerra-Sanz, 2004). Marka SSR menarik dikembangkan
26
khususnya pada spesies yang menunjukkan variasi genetik rendah, pada populasi inbred dan populasi yang diperoleh dari daerah-daerah berdekatan sehingga sulit dipilah-pilahkan dengan pendekatan lain (Röder et al., 1995). Keuntungan SSR secara alami adalah: (i) multipel alel SSR dapat dideteksi pada lokus tunggal menggunakan penapisan berbasis PCR, (ii) SSR biasanya terdistribusi pada seluruh genom, (iii) sifatnya ko-dominan, (iv) jumlah DNA yang dibutuhkan hanya sedikit, dan (v) analisis dapat dilakukan secara semi otomatis (Robinson et al., 2004).
Jarak pagar di Indonesia berpotensi besar sebagai penghasil bahan bakar nabati sehingga perlu dilakukan penelitian untuk mengoptimalkan keberadaan plasma nutfah tersebut dengan program pemuliaan tanaman. Sampai saat ini belum ada penelitian yang memanfaatkan marka SSR untuk evaluasi keragaman genetik jarak pagar Indonesia. Penelitian ini dilakukan untuk mengawali langkah- langkah pemuliaan tanaman pada jarak pagar dengan basis marka SSR.
Tujuan penelitian ini adalah adalah untuk: (i) mendesain primer spesifik SSR menggunakan aksesi DNA jarak pagar yang tersedia di GenBank DNA database dan (ii) mengevaluasi efektivitas pasangan primer yang didesain untuk menghasilkan marka SSR yang polimorfik untuk jarak pagar dan J. multifida L.
Marka-marka SSR yang ditemukan pada penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan bagi percepatan kegiatan pemuliaan tanaman jarak pagar untuk mendapatkan varietas unggul baru.yaitu melalui evaluasi keragama genetik.
Bahan dan Metode
Analisis molekuler dan penelusuran serta analisis menggunakan perangkat lunak online dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, IPB. Penelitian dilakukan dari bulan Mei sampai dengan bulan Nopember 2008.
Bahan tanaman untuk percobaan berasal dari Kebun Induk Jarak Pagar (KIJP) Pakuwon, Sukabumi yang terdiri atas lima aksesi jarak pagar dari berbagai daerah yang berbeda dan dua individu J. multifida dari Bogor dan Sukabumi.
27
Aksesi J. multifida digunakan untuk mengevaluasi peluang penggunaan primer yang dievaluasi pada spesies Jatropha yang masih sekerabat dengan jarak pagar.
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA pertama kali dilakukan dengan metode CTAB standar yang dikembangkan oleh Doyle dan Doyle (1990) dan digunakan untuk ekstraksi jarak pagar oleh Basha dan Sujatha (2007). Modifikasi dilakukan dengan meningkatkan konsentrasi NaCl pada buffer ekstraksi dari 1.4 M menjadi 3.5 M dan menambahkan NaCl hinga konsentrasi 2 M pada saat presipitasi bersamaan dengan penambahan isopropanol sesuai dengan metode yang dikembangkan oleh Sudheer et al. (2009). Metode modifikasi selengkapnya diuraikan sebagai berikut.
Sebanyak 0.1 g daun muda (daun berwarna keunguan, sedikit transparan dengan lebar sekitar 2-3 cm) dari tanaman sampel yang ditumbuhkan di lapangan, digerus dengan 500 µL buffer ekstraksi (CTAB 2%, 100 mM Tris HCl pH 8, 3.5 M NaCl, 0.5 M EDTA) dan 1% polyvinylpolypyrolydone (PVP). Ekstrak daun kemudian dipindahkan ke dalam tabung mikro berukuran 2.000 µL, ditambahkan 1.5% β- merkaptoetanol dan diinkubasi pada suhu 65o
Total DNA genomik yang didapat dikuantifikasi menggunakan spektrofotometer UV (Shimadzu UV - 1800) pada λ 260 nm dan kemurniannya ditentukan dengan menghitung rasio absorban pada λ 260 dan 280 nm sesuai dengan prosedur oleh Sambrook et al. (1989). Konsentrasi dan kemurnian DNA C selama 90 menit. Setelah inkubasi, ke dalam campuran ditambahkan kloroform : isoamil alkohol (24:1) dengan volume sebanding dan dikocok perlahan selama 10 menit.
Campuran disentrifugasi 8.000 rpm selama 8 menit pada suhu ruang. Fase cair bagian atas dipindahkan ke tabung yang baru dan ditambahkan 2M NaCl dengan volume sebanding. Ke dalam campuran tersebut ditambahkan isopropanol sebanyak 0.6 kali volume akhir dan diinkubasi pada suhu ruang selama 60 menit.
Alkohol 80% sebanyak 2 x dari volume akhir ditambahkan pada campuran tersebut dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Selanjutnya campuran disentrifugasi 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu ruang. Pelet dicuci dengan alkohol 70% kemudian dikeringkan dan dilarutkan pada 200 µL buffer TE.
28
juga dicek dengan perbandingan hasil elektroforesis sampel DNA dengan standar pada gel agarosa 1%.
Desain primer SSR
Penelusuran aksesi DNA jarak pagar yang ada di GenBank database dilakukan secara online pada situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Setiap aksesi DNA jarak pagar yang diperoleh dari basis data DNA, dievaluasi ada tidaknya runutan nukleotida yang merupakan simple sequence repeat (SSR). Panjang sekuen serta posisi SSR dievaluasi untuk melihat mungkin atau tidaknya primer didesain. Selain itu, agar tidak duplikasi, semua aksesi dianalisis kesamaan runutan nukleotidanya dengan multiple alignment (Higgins et al.,1996) menggunakan perangkat lunak online ClustalW yang tersedia di situs http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. Selanjutnya, dari aksesi DNA yang unik dan positif teridentifikasi membawa SSR, didesain primer spesifik yang mengapit runutan nukleotida SSR-nya. Desain primer SSR dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Primer3 (Rozen et al., 2000) yang tersedia secara online pada situs http://frodo.wi.mit.edu/. Primer yang berhasil didesain digunakan untuk mengamplifikasi sampel DNA jarak pagar dan J. multifida.
Amplifikasi DNA dan separasi hasil amplifikasi
DNA yang telah diekstraksi diamplifikasi PCR menggunakan primer yang berhasil didesain. Volume reaksi amplifikasi PCR yang digunakan adalah 25 µL, yang masing-masing terdiri atas 1X buffer reaksi, 0.1 µM dNTPs, 1 unit Real Taq DNA Polymerase (Real Biotech Corporation) dan 20 ng templat DNA. Reaksi amplifikasi PCR dilakukan menggunakan GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer) dengan denaturasi awal pada 95oC selama 5 menit; diikuti dengan 35 siklus yang masing-masing siklus terdiri atas tahapan denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik, penempelan primer (primer annealing) pada suhu yang sesuai untuk masing-masing pasangan primer selama 1 menit, pemanjangan primer (primer elongation) pada suhu 72oC selama 1 menit. Pada akhir reaksi ditambahkan satu siklus final extension pada suhu 72o
DNA hasil amplifikasi dievaluasi dengan dua sistim elekktroforesis, yaitu elektroforesis gel agarosa (1.5%) yang digunakan untuk konfirmasi keberadaan
C selama 5 menit.
29
hasil amplifikasi dan PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) yang digunakan untuk skoring alel SSR. Hasil elektroforesis gel agarosa divisualisasi dengan menggunakan pewarnaan etidium bromida dan difoto di bawah penyinaran UV menggunakan UV transluminescent. Elektroforesis dengan gel akrilamid digunakan untuk memperoleh resolusi yang lebih baik sehingga komposisi alel SSR yang muncul dapat teridentifikasi. Analisis menggunakan PAGE (40%
akrilamid/bis-akrilamid, 10% amonium persulfat, 5X buffer TBE, urea dan TEMED) dilakukan dengan Dedicated Height Sequencer (Cole-Parmer) menggunakan buffer TBE 1X pada tegangan konstan 1.100 V selama 3 jam.
Volume hasil PCR yang dianalisis adalah 1.8 µL dengan 60 sampel per gel. Hasil PAGE divisualisasi dengan pewarnaan menggunakan pewarnaan perak (silver staining). Marka DNA berukuran kelipatan 100 bp (100 bp ladder) digunakan untuk membantu menentukan ukuran potongan DNA hasil amplifikasi PCR.
Hasil Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA tanaman sampel (Tabel 1) dengan metode CTAB standar menghasilkan DNA yang kurang baik dan tidak konsisten. Pengujian sampel DNA total pada gel agarosa menunjukkan sinyal yang kurang jelas bahkan dua sampel (2 dan 4) hampir tidak menunjukkan sinyal sama sekali. Intensitas pengotor sangat tinggi tampak pada bagian bawah gel (Gambar 3A). Ekstraksi dengan metode yang dikembangkan oleh Sudheer et al. (2009) menghasilkan DNA yang cukup baik. Pengujian dengan gel agarosa menunjukkan sinyal yang terang, jernih serta konsisten dan intensitas pengotor lebih sedikit (Gambar 3B).
Pengukuran kuantitas DNA total mendapatkan hasil sekitar 100 – 150 ng/µL.
Desain primer SSR
Kata kunci umum Jatropha curcas digunakan untuk penelusuran awal pada situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov dan dihasilkan 157 aksesi yang merupakan aksesi cDNA dan fragmen DNA genomik asal jarak pagar serta DNA lain-lain.
Kata kunci lebih khusus yaitu Jatropha curcas + microsatellite digunakan dan didapatkan 39 aksesi DNA. Beberapa aksesi yang mempunyai tingkat kemiripan
30
runutan DNA tinggi hanya dipilih satu sebagai representasi kelompoknya agar tidak terjadi duplikasi lokus yang diamplifikasi. Pemilihan pasangan primer yang akan dievaluasi juga mempertimbangkan kesesuaian melting point antara pasangan primer forward dan reverse-nya, yaitu dipilih yang melting point-nya sama atau paling berdekatan (Dieffenbach et al., 1993). Setelah semua faktor yang diperlukan dijadikan pertimbangan, 28 pasang primer SSR spesifik telah terpilih sebagai hasil akhir kegiatan (Tabel 2).
Tabel 1 Aksesi jarak pagar dan kerabatnya yang digunakan untuk evaluasi primer SSR yang dikembangkan dalam penelitian
No. Genotip/ Aksesi Asal provenan 1. J. multifida / # 2 Sukabumi 2. J. multifida / # 1 Bogor 3. J. curcas /PT 26-2 Lampung 4. J. curcas /IP -1A-2 NTB 5. J. curcas /HS 49-2 NTT
6. J. curcas /SP 6-3 Sulawesi Selatan 7. J. curcas /IP-M-3 Jawa Timur
Gambar 3 High molecular weight DNA hasil ekstraksi dengan protokol (A) CTAB standar dan (B) protokol modifikasi. Kolom (1-5) - aksesi J.
curcas dan kolom (6-7) – aksesi J. multifida.
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
A B
31
Tabel 2 Daftar 28 pasang primer spesifik untuk mengamplifikasi SSR yang didesain menggunakan aksesi DNA jarak pagar dari GenBank DNA database
No No
aksesi* Sekuen primer
Produk PCR (bp)
Ta
(o Pola ulangan C)
1. EU586348 F GGGCTGGGATTTTGTCTCTT
246 55 (GT)12(AG)23 R GGCATGACCCTTGTGACTCT
2. EU586340 F GAAAAGGTAAAGCATGGCTGA
252 54 (TG)6..(TG)4 R TGTTCAGAAATGGATAGGGAAGA
3. EU586346 F GGTGCTACTGTCGGATGGTT
193 55 (TG)4..(TG)4 R TGAATCCTGGAATGGGGATA
4. EU586347 F GAAAAGGTAAAGCATGGCTGA
252 54 (GT)3..(TG)2.(GT)3 R TGTTCAGAAATGGATAGGGAAGA
5. EU586343 F CATGAAGTTTGCTGGCAATG
129 54 GT(4)..(GA)5 R AAAGGTCATCTGGTAAAGCCATA
6. EU586344 F ATCTTGATGGGTGATGAGACG
218 54 (TG)3..(TA)4 R TCCACAACCACAACCTTTGA
7. EU586345 F AAAAATTGAGGATATTACAGCATGAA
193 54 (TG)4..(TG)2..
(GT)3..(GT)4 R GGCAACATGCCTAAAAATCAA
8. EF612741 F GGCATTTCCTTGCATTTTCA
489 55 (TAA)10..(A)8 R CTGAGCAAACGGGGAAGTAA
9. EF612739 F GGCATTTCCTTGCATTTTCA
620 54 (TAA)10 R GAAGGGCAGAGGCTTCACTA
10. EU099518 F CTCATGAACAACAAGAATTT
137 55 (TA)3(TG)18..(TA)6 R CAGATTCTAATGAAGGTACG
11. EU099519 F TTTTTCTTGAAAGTTTTTGT
104 44 (CA)21 R TAGTTCGTCTTGAAGCTTAG
12. EU099520 F AACTGTAACGTTGTGAGTTC
106 44 (CA)10 R CTGATTTCTGGTCTCAATAG
13. EU099521 F TAAAATGCCAACTTTTACT
149 44 (TA)3(C)6..(C)7 (A)3(CA)5 R ACATATCGAAGATAGGGAAT
14. EU099522 F CAAATAGATTCCTCAATCC
122 44 (TC)16 R GGGACCCAAAGAAACAAT
15. EU099523 F GTCGGATGACTAGATTGATA
128 44 (GT)11 R AGAGATATTGGGCTAAAACT
16. EU099524 F ATTCATGTACCAGTCAAGTC
109 44 (C)6..(C)5(AC)5 R TGCTAAAACTCTGGTTCTCT
17. EU099525 F AACTAGAAAGGTTGTTTTTC
104 44 (AC)10 R TTATGTCTCTTTTCCATGTC
18. EU099526 F GTATATGTGGTCAAGCATTT
146 44 (CA)18 R AAAACAGCATAATACGACTC
19. EU099527 F CTAAAGCCACTTTATCAATC
139 44 (CA)12..(CA)2..
(CA)3 R TAACCGAATAGTTCTTACCA
20. EU099528 F CAAGCATAGATGTAGAAAAAC
145 44 (TA)5(CA)2..
(CA)17 R TTATGTCTCTTTTCCATGTC
21. EU099529 F CTTTATAAGGTCAACTCCAA
113 44 (CTT)4..(CTT)3..
(CTT)2 R CAAGTAAGAAGTGAAGAAAAA
22. EU099530 F CTAAAATGATTCGAGTTTTC
150 44 (CA)13 R TGACTTTTTCTGAGTTCTGT
23. EU099531 F TGCTAAAACTATGGTTCTCT
109 44 (G)3(GT)5(G)5..
(G)6 R ATTCATGTACCAGTCAAGTC
24. EU099533 F ATTGAAGAAGTGGAGTGTG
120 45 (GT)15 R TCATCTAAAATGCTCTGGT
25. AF469003 F CATCTTATGAAACTGTCGTT
145 45 (TAA)8 R TACTTACAAAGAAAGCGAGA
26. EU586351 F TAGAAGTTTTGTGATTAGGT
105 44 (GT)5 R GACTGCGTACCAATTCAT
27. EU586349 F CAAAATAAGTCGAAACAAAC
143 44 (A)6..(A)8..(CA)4 R TATAGGCTCTTGCATAAATC
28. EU099534 F AGAAGAAAGAGGCGACAGGA
150 54 (GAA)7 R AAATTCTTGTTGTTCATGAGGATG
Keterangan : * sumber : http://www.ncbi.nlm.nih.gov; F = primer forward, R = primer reverse, Ta = temperatur annealing
32
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Semua aksesi sekuen DNA yang digunakan untuk mendesain primer SSR berasal dari DNA genom jarak pagar. Dua puluh lima aksesi adalah DNA genomik yang mempunyai mikrosatelit di dalamnya dengan panjang antara 129- 415 bp. Dua askesi merupakan bagian dari promoter gen ribosom inactivating protein (489 bp [EF612741] dan 620 bp [EF612739]) sedangkan satu aksesi sisanya adalah gen curcin precursor dengan panjang 1.802 bp (AF469003).
Berdasarkan runutan nukleotida aksesi DNA yang digunakan, pola ulangan mikrosatelit yang ditemukan adalah dinukleotida tunggal TG (6 aksesi), CA (5 aksesi), GT (3 aksesi) dan TC (1 aksesi), trinukleotida tunggal CTT, GAA, atau TAA (masing-masing satu aksesi) atau pola ulangan kombinasi antara dua dinukleotida (GT-AG, TA-TG, TA-CA), dinukleotida dan mononukleotida (TA- CA-C-A, AC-C, GT-G, CA-A) serta trinukleotida dan mononukleotida (TAA-A).
Panjang primer hasil desain berkisar antara 18 – 26 bp. Suhu penempelan primer (primer annealing) bervariasi antara 44oC, 45oC, 54oC atau 55oC. Primer yang telah didesain terbukti berhasil mengamplifikasi genom jarak pagar dengan konfirmasi pada gel agarosa 1.5% (Gambar 4).
Gambar 4 Elektroferogram hasil evaluasi produk amplifikasi PCR dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Pewarnaan gel agarosa dilakukan dengan ethidium bromide dan foto gel diambil di bawah pencahayaan sinar UV. Hasil amplifikasi PCR dengan menggunakan templat genom jarak pagar dan pasangan primer (1) EF612741, (2) EU586345, (3) EF612739, (4) EU586340, (5) EU586343, (6) EU586344, (7) EU586346, (8) EU586347, dan (9) EU586348
33 1 2 3 4 5 6 7
EU586340
M EU586348
1 2 3 4 5 6 7
200 bp 400 bp
300 bp
EU586344 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
EU586347 EU099522 1 2 3 4 5 6 7 M
200 bp 400 bp
300 bp
Hasil pemisahan ukuran produk amplifikasi dengan PAGE menunjukkan bahwa 28 pasangan primer yang dievaluasi menghasilkan produk amplifikasi dengan templat DNA genomik jarak pagar. Sembilan belas pasang primer diuji pada templat DNA genomik J. multifida dan 14 di antarnya teramplifikasi. Jumlah pita DNA hasil amplifikasi PCR yang muncul terdiri atas satu atau dua pita.
Terdapat 12 pasang primer yang menunjukkan polimorfisme dengan ukuran pita berbeda antara aksesi jarak pagar dengan aksesi J. multifida. Empat belas primer menunjukkan polimorfisme yaitu hanya muncul pada J. curcas (Gambar 5).
Gambar 5 Representasi elektroferogram pemisahan hasil amplifikasi PCR dengan menggunakan PAGE untuk lima aksesi tanaman jarak pagar dan dua aksesi J. multifida dengan lima primer spesifik SSR. M: Marka DNA (100 bp ladder), Aksesi tanaman: (1) J. multifida # 2, (2) J. multifida
# 1, (3) J. curcas PT 26-2, (4) IP -1A-2, (5) HS 49-2, (6) SP 6-3, dan (7) IP-M-3.
34
Hasil running PAGE menunjukkan bahwa dari 19 pasang primer yang digunakan dapat menghasilkan 44 alel di mana 35 di antaranya (80%) merupakan alel polimorfik dengan ukuran produk amplifikasi berkisar antara 100 bp – 360 bp. Polimorfisme hanya terjadi antar alel-alel pada J. curcas dengan alel-alel J.
multifida. Sebaliknya, antar lima aksesi jarak pagar yang dievaluasi menunjukkan pola pita yang sama. Kesamaan pola pita DNA hasil amplifikasi juga diamati untuk kedua aksesi J. multifida yang diuji. Polimorfisme antara alel-alel yang muncul di antara aksesi J. curcas dengan yang muncul di antara aksesi J. multifida dapat berupa perbedaan ukuran pita DNA hasil amplifikasi atau berupa adanya hasil amplifikasi untuk aksesi jarak pagar dan tidak ada hasil amplifikasi (null alele) untuk aksesi J. multifida (Tabel 3).
Tabel 3 Konstitusi genetik berdasarkan hasil skoring alel marker SSR yang diamplifikasi dari templat lima aksesi J. curcas dan dua aksesi J.
multifida dengan menggunakan 19 pasangan primer SSR yang didesain dalam penelitian
No Primer J. curcas J. multifida
1 2 3 4 5 6 7
1. EU586348 13 13 13 13 13 24 24
2. EU586340 13 13 13 13 13 12 12
3. EU586346 12 12 12 12 12 12 12
4. EU586347 13 13 13 13 13 12 12
5. EU586343 12 12 12 12 12 22 22
6. EU586344 22 22 22 22 22 11 11
7. EF612741 12 12 12 12 12 12 12
8. EU099521 12 12 12 12 12 11 11
9. EU099522 12 12 12 12 12 - -
10. EU099523 11 11 11 11 11 22 22
11. EU099524 12 12 12 12 12 - -
12. EU099526 11 11 11 11 11 - -
13. EU099529 11 11 11 11 11 - -
14. EU099530 12 12 12 12 12 - -
15. EU099531 11 11 11 11 11 22 22
16. EU099533 14 14 14 14 14 23 23
17. EU586351 13 13 13 13 13 22 22
18. EU586349 33 33 33 33 33 12 12
19. EU099534 12 12 12 12 12 11 11
Catatan: (-) null alele, pasangan primer SSR yang digunakan tidak menghasilkan produk amplifikasi dengan tempat DNA J. multifida. Individu dengan konstitusi genetik yang direpresentasikan oleh dua angka yang sama (contoh: 11, 22, atau 33) berarti homosigot untuk masing-masing alel sedangkan jika dua angka yang berbeda (contoh: 12, 13, 14, 23 dan 24) diduga berarti heterosigot.
35 Pembahasan
Ekstraksi DNA
Metode ekstraksi DNA yang digunakan pada penelitian ini dimulai dengan mengacu pada metode CTAB standar (Doyle dan Doyle, 1990) yang telah digunakan untuk jarak pagar (Basha dan Sujatha, 2007), tetapi ternyata sulit dilaksanakan karena tidak berhasil menghilangkan kontaminasi klorofil. Molekul DNA yang berupa benang-benang putih tidak didapatkan dan muncul endapan berupa serbuk putih. Selain itu, hasil ekstraksi yang didapat menggunakan protokol yang digunakan Basha dan Sujatha (2007) sulit dilarutkan dalam buffer TE dan molekul DNA genomik yang didapatkan juga mempunyai kualitas rendah.
Sampel DNA juga terlihat banyak tertinggal pada sumur gel agarosa, yang mengindikasikan tingginya kontaminan protein, polisakarida atau metabolit sekunder pada sampel DNA (Do dan Adams, 1991; Sharma et al., 2002).
Jarak pagar dan J. multifida termasuk dalam famili Euphorbiaceae yang banyak menghasilkan getah sehingga diduga kualitas serta kuantitas DNA yang kurang bagus dari hasil ekstraksi ini berkaitan keberadaan kontaminan tersebut.
Berdasarkan penelusuran pustaka diperoleh metode modifikasi untuk ekstraksi DNA tanaman yang mengandung banyak protein dan polisakarida yaitu dengan meningkatkan konsentrasi NaCl pada buffer ekstraksi dan penambahan NaCl konsentrasi tinggi pada saat presipitasi (Sudheer et al., 2009). Modifikasi dalam prosedur isolasi DNA ini telah diterapkan, yaitu dengan meningkatkan konsentrasi NaCl pada buffer ekstraksi dari 1.4 M menjadi 3.5 M dan menambahkan NaCl hinga konsentrasi 2 M pada saat presipitasi bersamaan dengan penambahan isopropanol.
Berbagai modifikasi tahapan isolasi DNA yang digunakan tersebut masih belum sepenuhnya dapat menghilangkan kontaminan yang terbawa selama proses ekstraksi DNA, namun demikian kualitas DNA yang didapat sudah memadai untuk keperluan amplifikasi PCR. Penggunaan marka SSR tidak menuntut kualitas DNA sangat tinggi untuk pelaksanaannya (Semagn et al. 2006). Jika hasil ekstraksi DNA tanpa purifikasi telah memadai untuk proses amplifikasi PCR maka langkah ini dapat dilewati untuk efisiensi.
36 Desain primer
Aksesi yang diperoleh dengan pencarian menggunakan kata kunci umum Jatropha curcas ternyata tidak semua menghasilkan sekuen yang berasal dari jarak pagar. Pengembangan primer dalam penelitian ini dimaksudkan untuk mendapatkan primer spesifik yang berasal dari jarak pagar sehingga kata kunci pencarian dipersempit. Kata kunci Jatropha curcas + microsatellite digunakan dan mendapatkan 39 aksesi sekuen DNA. Dari jumlah luaran pencarian yang diperoleh mengidikasikan penelitian tentang jarak pagar khususnya yang berkaitan dengan marka SSR masih sangat sedikit. Aksesi-aksesi yang diperoleh ini sebagian besar berasal dari penelitian tahap awal untuk mengidentifikasi SSR pada jarak pagar. Sebagian besar aksesi yang diperoleh mempunyai SSR di dalamnya karena kata kunci yang digunakan sudah sangat spesifik, tetapi tidak semua dapat didesain primernya.
Primer SSR baru dapat didesain dari sekuen DNA jika sekuen yang bersangkutan memiliki flanking region minimal 20 bp. Primer terbaik didesain dengan beberapa pertimbangan di antaranya adalah GC content atau perbandingan kandungan nukleotida G dan C dalam primer sehingga panjang 20 bp pada sisi- sisi forward dan reverse SSR seringkali tidak mencukupi untuk dapat dibuat primer. Beberapa aksesi yang ditemukan tidak dapat didesain primernya karena sekuen yang terlalu pendek. Posisi SSR dari sekuen yang ditemukan juga menentukan bisa atau tidaknya sebuah primer didesain. SSR yang berada pada ujung sekuen menyebabkan primer tidak dapat didesain dari sekuen yang bersangkutan.
Pengujian pasangan primer spesifik SSR yang didapat untuk melakukan amplifikasi PCR menggunakan templat DNA jarak pagar mengindikasikan bahwa semua pasangan primer mampu menghasilkan produk amplifikasi. Ini paling tidak mengindikasikan dua hal, yaitu bahwa kualitas dan kuantitas DNA yang diekstraksi cukup memadai untuk digunakan sebagai templat dan pasangan primer hasil desain yang dilakukan mampu menghasilkan produk amplifikasi PCR.
Kemunculan dua pita pada aksesi tanaman jarak pagar (Gambar 5) dapat diartikan bahwa pada genom tanamannya terdapat satu lokus (misalnya lokus EU586347) dan dalam lokus EU586347 yang dianalisis terdapat dua alel. Dengan demikian,
37
konstitusi genetik aksesi yang dianalisis bersifat heterosigot (misalnya dengan pasangan alel 12), mengingat bahwa SSR adalah marka ko-dominan (Robinson et al., 2004) yang mampu membedakan individu heterosigot (12) dari yang homosigot (11 atau 22). Sebagai alternatif, kemunculan dua pita pada aksesi tanaman jarak pagar yang diuji juga dapat mengindikasikan kemungkinan adanya lebih dari satu lokus di dalam genom tanaman (duplikasi) dan masing-masing lokusnya mempunyai konstitusi alel dalam kondisi homosigot (misalnya lokus EU586347-1 dengan alel 11 dan lokus EU586347-2 dengan alel 22). Pembuktian terhadap dua kemungkinan ini dapat dilakukan dengan mengevaluasi segregasi pita DNA hasil amplifikasi PCR dengan menggunakan primer terpilih pada populasi tanaman jarak pagar F1 hasil selfing.
Jika dua pita yang dihasilkan merupakan alternatif alel dalam satu lokus yang sama (misalnya lokus EU586347 dengan pasangan alel 12), maka pada populasi tanaman jarak pagar F1 diharapkan terjadi segregasi tanaman F1 dengan konstitusi alel pada lokus EU586347 sebagai 11 (homosigot, proporsi 25%), sebagai 12 (heterosigot, proporsi 50%) dan sebagai 22 (homosigot, proporsi 25%).
Sebaliknya, jika dua pita tersebut merupakan representasi dari dua lokus (lokus EU586347-1 dan lokus EU586347-2) dan konstitusi alel untuk kedua lokus tersebut homosigot (lokus EU586347-1 dengan alel 11 dan lokus EU586347-2 dengan alel 22) maka semua individu F1 yang dievaluasi akan mempunyai produk amplifikasi dengan dua pita yang sama sebagaimana tetua yang digunakan untuk menghasilkan tanaman F1.
Selfing beberapa individu jarak pagar telah dilakukan oleh peneliti lain. Dari hasil analisis yang dilakukan terhadap 16 individu F1 hasil selfing (aksesi J.
curcas no 4) yang telah dilakukan menunjukkan bahwa dua pita yang muncul pada tetua juga dijumpai pada F1 . Di antara 16 individu F1 yang diuji, tidak diamati adanya segregasi dari pita-pita DNA hasil amplifikasi. Hal tersebut mengindikasikan bahwa dua pita yang didapatkan dari hasil amplifikasi PCR menggunakan pasangan primer spesifik SSR tersebut merepresentasikan dua lokus yang berbeda (duplikat lokus) dengan alel yang homosigot dan bukan satu lokus yang heterosigot. Representasi hasil amplifikasi PCR menggunakan tujuh pasang primer dan templat empat individu F1 dapat dilihat pada Gambar 6.
38
Gambar 6 Representasi elektroferogram pemisahan hasil amplifikasi PCR dengan menggunakan poliakrilamid gel elektroforesis (PAGE) untuk empat individu tanaman jarak pagar F1
Berdasarkan hasil evaluasi, pasangan primer spesifik SSR yang didesain dalam penelitian ini tidak polimorfik untuk sejumlah aksesi tanaman jarak pagar yang dievaluasi. Deteksi tingkat polimorfisme yang rendah menggunakan pasangan primer yang dikembangkan dapat menjadi indikator rendahnya tingkat keragaman genetik tanaman yang diuji atau tingginya tingkat konservasi bagian genom yang digunakan untuk mendesain primer.
Polimorfisme yang rendah bisa terjadi sebagai akibat sampling pada bagian genom dengan tingkat konservasi runutan DNA yang tinggi. Akibat tingginya tingkat konservasi bagian genom yang diamplifikasi dengan primer spesifik SSR, meskipun aksesi yang dievaluasi mempunyai keragaman genetik yang tinggi maka akan tetap menghasilkan produk amplifikasi yang monomorf untuk semua aksesi jarak pagar yang dievaluasi.
(A-D), dengan menggunakan pasangan primer (1) EU586345, (2) EU586343, (3) EF612741, (4) EU586347, (5) EF612739, (6) EU586346, dan (7) EU586340.
Salah satu keuntungan penggunaan marka SSR adalah sifatnya yang dapat diamplifikasi menggunakan templat tanaman sekerabat (cross specific amplification ability) (Rossetto et al., 1999; Park et al., 2009). Pasangan primer yang didesain dalam penelitian ternyata mampu menghasilkan produk amplifikasi dan polimorf antara jarak pagar dengan J. multifida. Dengan demikian, pasangan primer tersebut paling tidak akan dapat digunakan untuk identifikasi hasil persilangan F1 inter-spesies antara J. curcas x J. multifida atau kemungkinan
1 2 3 4 5 6 7
A
1 2 3 4 5 6 7
B
1 2 3 4 5 67
D
1 2 3 4 5 6 7
C
39
dengan spesies lain. Evaluasi lebih lanjut pemafaatan primer spesifik SSR yang telah dikembangkan untuk menganalisis lebih banyak aksesi J. curcas, aksesi J.
multifida, dan aksesi Jatropha spp. lainnya masih perlu dilakukan untuk mengetahui efektivitas pemanfaatan primer spesifik SSR yang telah dikembangkan.
Kesimpulan
DNA jarak pagar dapat terekstraksi dengan baik menggunakan protokol CTAB yang dimodifikasi yaitu dengan penambahan konsentrasi NaCl pada buffer ekstraksi dan pada saat presipitasi. Dua puluh delapan pasang primer spesifik SSR telah berhasil didesain menggunakan aksesi DNA genomik asal jarak pagar yang ditemuka n pada basis data GenBank DNA. DNA genomik asal jarak pagar dan J.
multifida dapat digunakan dengan efektif sebagai templat untuk amplifikasi PCR.
Primer yang didesain dalam penelitian ini tidak menghasilkan pita hasil amplifikasi yang polimorfik antar aksesi jarak pagar yang diuji atau antar aksesi J.
multifida. Marker SSR yang dihasilkan bersifat polimorfik untuk aksesi jarak pagar dengan aksesi J. multifida sehingga dapat digunakan sebagai marka untuk mendeteksi hasil persilangan F1
Do N, Adams RP. 1991. A simple technique of removing plants polysaccharides contaminants from DNA. Biotechniques. 10:162-166
inter-spesies J. curcas x J. multifida.
Daftar Pustaka
Asbani N, Heliyanto B. 2008. Kompatibilitas persilangan interspesifik Jatropha curcas x J. integerrima. Infotek Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) 3(2):7 Basha SD, Sujatha M. 2007. Inter and intra-population variability of Jatropha
curcas L. characterized by RAPD and ISSR markers and development of population-specific SCAR markers. Euphytica 156:375–386
Dieffenbach CW, Lowe TM and Dveksle GS. 1993. General concepts for PCR primer design. Genome Res. 3: S30-S37
Divakara BN, Upadhyaya HD, Wani SP, Laxmipathi Gowda CL. 2010. Biology and genetic improvement of Jatropha curcas L.: A review. Applied Energy 87:732-742
40
Doyle JJ, Doyle JL. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13–
15
Fairless D. 2007. Biofuel: The little shrub that could maybe. Nature 449:652-655 Guerra-Sanz JM. 2004. New SSR markers of Phaseolus vulgaris from sequence
databases. Plant Breeding 123: 87-89
Heller J. 1996. Physic nut Jatropha curcas L. Promoting the conservation and use of under utilized and neglected crops. International Plant Genetic Resources Institute. Rome
Higgins DG, Thompson JD, Gibson TJ. 1996. Using CLUSTAL for multiple sequence alignments. Methods Enzymol 266:383-402
Kaushik N, Kumar K, Kumar S, Kaushik N, Roy S. 2007. Genetic variability and divergence studies in seed traits and oil content of Jatropha (Jatropha curcas L.) accession. Biomass and Bioenergy 31:497-502
Makkar HPS, Becker K, Sporer F, Wink M. 1997. Studies on nutritive potential and toxic constituents of different provenances of Jatropha curcas. J.
Agric. Food Chem. 45:3152-3157
Ou WJ, Wang WQ, Li KM. 2009. Molecular genetic diversity analysis of 120 accessions Jatropha curcas L. germplasm. Chinese Journal of Tropical Crops 30:287-292
Park YJ, Lee JK, Kim NS. 2009. Simple sequence repeat polymorphisms (SSRPs) for evaluation of molecular diversity and germplasm classification of minor crops. Molecules 2009, 14, 4546-4569
Rakoczy-Trojanowska M. 2004. Characteristics and a comparison of three classes of microsatellite-based markers and their application in plants. Cellular &
Molecular Biology Letters 9:221-238
Robinson AJ, Love CG, Batley J, Barker G, Edwards D. 2004. Simple sequence repeat marker loci discovery using SSR primer. Bioinformatics Application Note 20(9):1475-1476
Röder MS et al. 1995. Abundance, variability and chromosomal location of microsatellites in wheat. Mol. Gen. Genet. 246: 327-333
Rosado TB et al. 2010. Molecular marker reveal limited genetic diversity in a large gerplasm collection of the biofuel crop Jatropha curcas L. in Brazil.
Crop Science 50:2372-2382
Rossetto M, Shepherd M, Cordeiro GM, Harriss FCL, Lee LS and Henry RJ.
1999. Cross species amplification of microsatellite loci: a valuable tool for genetic studies in plants. Paper presented to the Plant and Animal Genome VII Conference, San Diego, California, USA, 17-21 January
41
Rozen S, Skaletsky HJ. 2000. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Di dalam: Krawetz S, Misener S. editor.
Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology.
Humana Press, Totowa, NJ. hlm 365-386
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA
Sanwen H et al. 2000. Development of pepper SSR markers from sequence databases. Euphytica 117:163–167
Semagn K, Bjørnstad Å, Ndjiondjop MN. 2006. An overview of molecular marker methods for plants. African Journal of Biotechnology 5(25):2540- 2568
Sharma AD, Gill PK, Sigh P. 2002. DNA isolation from dry and fresh samples of polysaccharides-rich plants. Plant Mol Biol Rep. 20: 415 a-f
Sudheer PDVNS, Meenakshi, Sarkar R, Boricha G, Reddy MP. 2009. A simplified method for extraction of high quality genomic DNA from Jatropha curcas for genetic diversity and molecular marker studies. Indian Journal of Biotechnology 8:187-192
Tatikonda L, Suhas WP, Seetha K. 2009. AFLP-based molecular characterization of an elite germplasm collection of Jatropha curcas L. a biofuel plant.
Plant Science 176:505-513
