OPTIMASI MEDIA PRODUKSI BAKTERIOSIN DARI
Bacillus sp. GALUR LTS 40 ASAL TAMBAK UDANG
PUJI PURWANTI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
ABSTRAK
PUJI PURWANTI. Optimasi Media Produksi Bakteriosin dari Bacillus sp. Galur LTS 40 Asal Tambak Udang. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan NISA RACHMANIA MUBARIK.
Permintaan dan kebutuhan udang sebagai komoditi ekspor perikanan semakin meningkat dari tahun ke tahun. Namun, dewasa ini banyak terserang penyakit Vibriosis yang disebabkan oleh bakteri berpendar Vibrio harveyi. Bakteri probiotik dapat dijadikan sebagai kontrol untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen di tambak. Isolat Bacillus sp. LTS 40 merupakan kandidat bakteri probiotik karena mampu menghasilkan bakteriosin untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Produksi bakteri probiotik secara massal memerlukan biaya yang cukup besar. Untuk itu, perlu dicari media produksi yang murah. Media produksi yang digunakan sebagai sumber karbon ialah molase dan sebagai sumber nitrogen yaitu pupuk NPK, TSP, ZA, dan Urea. Tujuan dari penelitian ini untuk mendapatkan media produksi yang terbaik bagi petumbuhan
Bacillus sp. LTS 40 asal tambak udang. Dari uji aktivitas penghambatan menunjukkan Bacillus sp.
LTS 40 mampu menghambat V. harveyi dengan indeks penghambatan sebesar 1, 08. Uji kompetisi dalam kultur cair juga menunjukkan bahwa terjadi penghambatan hingga mencapai 100% pada rasio 1:10 pada inkubasi ke-24 jam, ke-48 jam, dan ke-72 jam. Isolat Bacillus sp. LTS 40 mempunyai pertumbuhan terbaik pada kombinasi media molase dengan NPK pada konsentrasi 0,2%. Fermentor modifikasi volume kerja 10 liter menunjukkan bakteriosin diproduksi pada saat fase eksponensial dan produksi optimum pada jam ke-36 dengan zona hambat sebesar 15, 25 mm. Hal ini menunjukkan bahwa Bacillus sp. LTS 40 dapat dijadikan bakteri probiotik untuk menanggulangi permasalahan kematian massal udang pada tingkat larva akibat serangan V.
harveyi.
Kata kunci: Bacillus sp., V. harveyi, bakteriosin
ABSTRACT
PUJI PURWANTI. Optimizing media for Bacteriosin Production by Bacillus sp. Strain LTS 40 Isolated from Shrimp Pond. Under supervision of IMAN RUSMANA and NISA RACHMANIA MUBARIK.
Export demand on shrimp as fishery commodity has increased. However, nowadays Vibriosis diseases caused by fluorescent bacterium Vibrio harveyi have decreased shrimp production. Probiotic bacteria can be used as biocontrol to inhibit the growth of V. harveyi in ponds. Bacillus sp. LTS 40 as a probiotic candidate was able to produce bacteriosin inhibiting the growth of V. harveyi. Production of bacterial probiotics should be low cost using a cheap media. Media production of bacterial probiotics commonly use molase as carbon sources and fertilizers such as NPK, ZA, and urea as a source of nitrogen. The aim of this research was to get the best media composition for growth of Bacillus sp. LTS 40 in producing bacteriosin. Antimicrobial activity test showed that Bacillus sp. LTS 40 could inhibit the growth of V. harveyi with inhibition index of 1,08. Competition assay in liquid culture also showed that Bacillus sp. LTS 40 could inhibit V. harveyi up to 100% at 24 hours, 48 hours, and 72 hours of incubation. Bacillus sp. LTS 40 had a good growth on media composition of 0,2% molase and NPK. In 10 liter fermentor, bacteriosin was produced during exponential phase and optimum production was at 36 hours of incubation with inhibition zone of 15.25 mm. This result showed that Bacillus sp. LTS 40 can be used as probiotics to reduce mortality of shrimp larvae caused by V. harveyi in shrimp cultures. Key words: Bacillus sp., V. harveyi, bacteriosin
OPTIMASI MEDIA PRODUKSI BAKTERIOSIN DARI
Bacillus sp. GALUR LTS 40 ASAL TAMBAK UDANG
PUJI PURWANTI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul
:
Optimasi Media Produksi Bakteriosin dari Bacillus sp. Galur LTS 40
Asal Tambak Udang
Nama
: Puji Purwanti
NIM
: G34052487
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
(Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si)
(Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si)
NIP 196507201991031002
NIP 196711271993022001
Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. Drh. Hasim, DEA
NIP 196103281986011002
PRAKATA
Alhamdulillahirobbil’alamin, puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT yang telah memberi rahmat dan kemudahan dalam menyelesaikan karya ilmiah ini. Tema penelitian penulis yaitu tentang media produksi bakteriosin dari genus Bacillus, dengan judul Optimasi Media Produksi Bakteriosin dari Bacillus sp. Galur LTS 40 Asal Tambak Udang. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari sampai Mei 2009 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Ibu Dr. Nisa Rachmania Mubarik selaku pembimbing atas saran dan bimbingannya dalam pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Dr. M. Jusuf atas saran dan masukan yang diberikan pada ujian karya ilmiah. Terima kasih juga kepada Kartika Findy, Bonardo Tigor S, Nurlia V, Dina Dwi A, Ade Satria, Ibu Maya dan Pak Umar atas bantuan yang telah diberikan selama penelitian. Teman-teman seperjuangan di laboratorium dan keluarga besar Laboratorium Mikrobiologi atas semangat dan kebersamaannya. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada sahabat-sahabatku tercinta Ety N, Putri Utami S, Uzainah A, Monika N, Yohana, Sang Ayu, Ayu S dan Biologi 42 atas segala dukungan dan bantuan yang telah diberikan. Ucapan terima kasih setinggi-tinginya penulis sampaikan kepada kedua orang tua, kakak, adik, dan keluarga besar terutama Lek Sam atas do`a, dukungan, dan segala cintanya. Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada M. Muslim yang senantiasa memberikan semangat, do’a, dan cintanya.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Agustus 2009
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor Jawa Barat pada tanggal 19 Februari 1987 dari ayahanda Suwarto dan ibunda Suparti. Penulis merupakan anak kedua dari empat bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Cibinong dan lolos seleksi masuk IPB melalui Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB) pada Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar Tingkat Persiapan Bersama IPB pada tahun 2008-2009 dan Mikrobiologi Dasar, Departemen Biologi, FMIPA, IPB pada tahun 2009. Penulis juga menjadi pengajar B’Expert Biologi tahun 2008. Penulis melakukan Praktik Kerja Lapang di PT. Bio Farma (Persero) Bandung dari bulan Juli sampai Agustus 2009 dengan judul Uji Stabilitas Master Seed Haemophilus influenzae Tipe b dengan Menggunakan Phadebact Kit di PT. Bio Farma (Persero) Bandung.
1
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR TABEL ... vi DAFTAR GAMBAR ... vi DAFTAR LAMPIRAN ... vi PENDAHULUAN 1 Latar Belakang ... 1 Tujuan ... 1Waktu dan Tempat ... 1
BAHAN DAN METODE 1
Bahan ... 1
Penyiapan Media ... 2
Peremajaan Isolat ... 2
Aktivitas Penghambatan Isolat Bacillus sp. LTS 40 ... 2
Pertumbuhan Bacillus sp. LTS 40 pada Media Kombinasi ... 2
Uji Kompetisi terhadap Bakteri Indikator ... 2
Waktu Optimum Produksi Bakteriosin Isolat Bacillus sp. LTS 40 Kultur 10 Liter ... 2
HASIL 3
Aktivitas Penghambatan Isolat Bacillus sp. LTS 40 ... 3
Pertumbuhan Bacillus sp. LTS 40 pada Media Kombinasi ... 3
Uji Kompetisi terhadap Bakteri Indikator ... 3
Waktu Optimum Produksi Bakteriosin Isolat Bacillus sp. LTS 40 Kultur 10 Liter ... 4
PEMBAHASAN ... 4 SIMPULAN ... 7 SARAN ... 7 DAFTAR PUSTAKA ... 8 LAMPIRAN ... 10
1
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Aktivitas penghambatan Bacillus sp. LTS 40 terhadap bakteri indikator
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Vibrio harveyi dengan
metode double layer... 3 2 Pertumbuhan bakteri Bacillus sp. LTS 40 dalam berbagai konsentrasi dan
kombinasi media... 3 3 Aktivitas penghambatan bakteriosin Bacillus sp. LTS 40 terhadap
V. harveyi... 4
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Fermentor modifikasi... 3 2 Persentase penghambatan Bacillus sp. LTS 40 terhadap bakteri
V. harveyi pada inkubasi jam ke-24, 48, dan 72 ... 4 3 Aktivitas bakteriosin supernatan bebas sel Bacillus sp. LTS 40 terhadap
V. harveyi ... 4
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1 Komposisi media yang digunakan ... 11 2 Komposisi kimia molase (Paturau 1982) ... 11 3 Komposisi pupuk yang digunakan ... 11
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Permintaan dan kebutuhan udang sebagai komoditi ekspor perikanan semakin meningkat dari tahun ke tahun karena udang dapat dimanfaatkan sebagai bahan makanan yang memiliki nilai gizi tinggi. Udang juga merupakan salah satu konsumsi kegemaran masyarakat hampir di seluruh dunia. Oleh karena itu, peluang dalam mengembangkan perikanan budi daya udang guna memenuhi permintaan dunia sangat besar. Namun, dewasa ini banyak tambak udang terserang penyakit vibriosis yang disebabkan oleh bakteri berpendar Vibrio harveyi (Moriatty 1999). Bakteri ini merupakan penyebab utama serangan bakteri penyakit pada udang yang dapat terjadi mulai pada tingkat larva (Silaban 2007). Ruangpan et al. (1998) menyatakan bahwa salah satu penyebab kematian massal pada udang budi daya yaitu penyakit vibriosis yang sebagian besar disebabkan oleh bakteri
Vibrio sp.
Selain kuantitas produksi, tantangan lain yang harus dihadapi dalam pasar dunia bagi komoditi ekspor perikanan budi daya udang ialah kualitas atau mutu udang yang siap diekspor (Isramilda 2007). Residu antibiotik, bakteri patogen, biotoksin atau residu pestisida juga harus mendapatkan perhatian serius guna menjaga mutu dan keamanan produk.
Peraturan pemerintah melarang menggunakan antibiotik untuk budi daya udang tertuang dalam UU No. 31 tahun 2004 tentang perikanan yang menyatakan bahwa melarang para pengusaha perbenihan udang di Indonesia menggunakan antibiotik nitrofurans dalam proses perbenihan udang. Menurut Verschuere et al. (2000) penggunaan antibiotik untuk mencegah dan mengobati penyakit dapat menimbulkan masalah baru yaitu, terakumulasinya antibiotik pada lingkungan dan spesies yang dibudidayakan serta timbulnya resistensi mikrob patogen.
Alternatif pengendalian penyakit udang yang disebabkan bakteri patogen di tambak udang ialah dengan memanfaatkan bakteri probiotik. Probiotik ialah makhluk hidup yang memberikan pengaruh menguntungkan pada inang dengan memodifikasi komunitas mikrob atau berasosiasi dengan inang, memperbaiki nilai nutrisi, memperbaiki respon inang terhadap penyakit, atau memperbaiki
lingkungan kualitas ambangnya (Verschuere
et al. 2000).
Bakteri probiotik menghasilkan senyawa metabolit yang mempunyai efek bakterisida dan bakteriostatik untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen atau bakteri yang dapat menurunkan kualitas udang selama dibudidayakan.
Bakteri probiotik dapat dijadikan sebagai kontrol untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen di tambak. Isolat
Bacillus sp. LTS 40 merupakan kandidat
bakteri probiotik karena mampu menghasilkan bakteriosin untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Bakteriosin merupakan senyawa antimikrob yang terdiri atas protein atau polipeptida yang disintesis oleh ribosom dan umumnya menghambat spesies bakteri yang berkerabat dekat dengan bakteri penghasil bakteriosin (Jack et al. 1995).
Produksi bakteri probiotik secara massal memerlukan biaya yang cukup besar. Sebelumnya telah digunakan kombinasi molase dengan fishmeal dan soymeal, namun kenaikan harga fishmeal dan soymeal yang terus meningkat mengakibatkan biaya produksi yang meningkat pula. Untuk itu, perlu dicari media produksi yang lebih murah. Media produksi yang umum digunakan sebagai sumber karbon ialah molase dan sebagai sumber nitrogen yaitu pupuk NPK, ZA, TSP, dan urea.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mendapatkan media produksi bakteriosin yang terbaik bagi petumbuhan Bacillus sp. LTS 40 asal tambak udang.
Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan pada bulan Februari hingga Mei 2009 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan diantaranya Media
sea water complete (SWC) (Lampiran 1),
isolat Bacillus sp. galur LTS 40, bakteri indikator Escherichia coli, Staphylococcus
2
Metode
Penyiapan Media. Media yang
digunakan ialah media yang berisi molase (Lampiran 2) yang dikombinasikan dengan pupuk NPK, ZA, TSP dan urea (Lampiran 3) (w/v) 1:1 dengan konsentrasi 0.2%, 0.1%, 0.05%, dan 0.02%.
Peremajaan Isolat. Peremajaan isolat
dilakukan dengan menumbuhkan isolat bakteri Bacillus sp. LTS 40 pada media agar-agar sea water complete (SWC) 50% dengan metode gores kuadran dan diinkubasi pada suhu ruang (28-31oC) selama dua hari.
Aktivitas Penghambatan Isolat Bacillus sp. LTS 40. Isolat Bacillus sp. LTS 40 diuji
aktivitas penghambatannya terhadap bakteri indikator E. coli, S. aureus, dan V. harveyi dengan menggunakan metode double layer (Lisboa et al. 2006). Sebanyak 500 µl bakteri indikator disuspensikan ke dalam 50 ml SWC semisolid. Kemudian dituang ke dalam media padat SWC, dan didiamkan hingga beku. Setelah itu, isolat Bacillus sp. LTS 40 yang telah berumur dua hari ditotolkan dan diinkubasi pada suhu 30oC selama 48 jam. Bakteri yang memiliki kemampuan untuk menghasilkan zat antimikrob ditunjukkan dengan luasnya zona bening di sekitar koloni yang kemudian dihitung indeks penghambatannya. Indeks Penghambatan (IP) dihitung dengan menggunakan persamaan: IP = Ф zona bening (mm) – Ф koloni (mm)
Ф koloni (mm) Keterangan : Ф = Diameter
Pertumbuhan Bacillus sp. LTS 40 pada Media Kombinasi. Satu lup inokulan kultur
isolat ditumbuhkan pada 100 ml media cair SWC 50% kemudian diinkubasi di atas inkubator berpenggoyang pada suhu ruang (28-31oC) selama dua hari. Sebanyak 1 ml kultur isolat ditumbuhkan pada media dengan kombinasi molase dan pupuk NPK, molase dan pupuk ZA, molase dan pupuk TSP dan urea dengan masing-masing konsentrasi 0.2%, 0.1%, 0.05%, dan 0.02%. Kultur diinkubasi selama dua hari di atas inkubator berpenggoyang pada suhu ruang dan dilakukan pengukuran pertumbuhan selnya melalui metode pencawanan. Masing- masing perlakuan kombinasi media ulang sebanyak dua kali.
Uji Kompetisi terhadap Bakteri
Indikator. Penghambatan isolat Bacillus sp.
LTS 40 terhadap bakteri indikator dilakukan dalam media SWC cair. Pada lima erlenmeyer berisi 50 ml media SWC cair masing-masing disuspensikan 100 µl inokulum bakteri indikator umur 24 jam dengan kepadatan sekitar 107 sel/ml. Pada erlenmeyer I, II, III, IV, dan V masing-masing ditambahkan 100 µl, 200 µl, 400 µl, dan 1000 µl inokulum
Bacillus sp. LTS 40 sehingga diperoleh kultur
campuran V. harveyi dengan Bacillus sp. LTS 40 dengan rasio 1:1, 1:2, 1:4, dan 1:10, sedangkan erlenmeyer kultur bakteri indikator (tanpa inokulum Bacillus sp. LTS 40) sebagai kontrol negatif dan satu erlenmeyer yang disuspensikan 100 ml inokulum Bacillus sp. LTS 40 digunakan sebagian kontrol positif. Pada jam ke 24 dan 48 dihitung jumlah sel
Bacillus sp. LTS 40 dan bakteri indikator
dengan metode cawan sebar pada media agar-agar SWC lalu dihitung jumlah sel dan persentase penghambatannya. Penentuan persentase penghambatan terhadap bakteri indikator dengan menggunakan persamaan:
% Penghambatan = A – B x 100% A
Keterangan :
A=Jumlah sel bakteri indikator pada kontrol B=Jumlah sel bakteri indikator pada perlakuan
Waktu Optimum Produksi Bakteriosin
Bacillus sp. LTS 40 Kultur 10 Liter. Sebanyak 100 ml Bacillus sp. LTS 40 dari biakan pemula diinokulasikan ke dalam 10 liter media kombinasi terpilih atau terbaik dalam fermentor modifikasi (Gambar 1). Aerasi dilakukan dengan memompakan udara steril dengan menggunakan aerator dan filter udara. Suhu dipertahankan pada suhu ruang dan pH awal diatur pada pH netral (6.8 – 7). Inkubasi dilakukan selama 3 hari dan pengambilan contoh dilakukan secara aseptik setiap 12 jam menggunakan syringe dan diukur jumlah selnya juga aktivitas penghambatannya melalui metode cakram
double layer (Saraswati 2003). Sebanyak 10
ml sampel di ambil dari fermentor modifikasi, kemudian 1 ml dimasukkan ke dalam tabung mikro dan 9 ml untuk persiapan pengenceran. Pengenceran dilakukan untuk memperoleh kepadatan sel 10-9 sel/ml yang selanjutnya digunakan dalam metode pencawanan setiap 12 jam dengan menyebar 100 µl bakteri ke dalam media SWC padat, selanjutnya diinkubasi dan dihitung jumlah selnya. Biakan bakteri di dalam tabung mikro dari setiap
3
pengambilan contoh selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 4500 g selama 15 menit kemudian dilakukan pemisahan supernatan dari filtrat selnya untuk diuji aktivitas mikrobnya terhadap bakteri indikator dengan menggunakan metode double layer. Pada metode double layer, 50 µl bakteri indikator dengan kepadatan sel 108 sel/ml disuspensikan ke dalam 50 ml SWC dan didiamkan hingga beku. Uji aktivitas supernatan bebas sel
Bacillus sp. LTS 40 dilakukan dengan
meneteskan supernatan sebanyak 20 µl pada kertas cakram berdiameter 6 mm dan dibiarkan mengering terlebih dahulu kemudian cakram diletakkan pada permukaan media SWC double layer. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam dan dilakukan pengukuran diameter zona hambat yang terbentuk di sekitar kertas cakram. Zona hambat yang paling luas menunjukkan waktu produksi antimikrob yang optimum (Suparnika 2007)
.
Gambar 1 Fermentor modifikasi.
HASIL
Aktivitas Penghambatan Isolat Bacillus sp. LTS 40
Isolat Bacillus sp. LTS 40 penghasil bakteriosin yang diisolasi dari tambak udang memiliki morfologi koloni bulat, tepian tak beraturan, elevasi timbul, dan berwarna putih susu. Berdasarkan hasil uji Bacillus sp. Galur LTS 40 memiliki aktivitas penghambatan terhadap ketiga bakteri indikator dengan indeks penghambatan sebesar 1,08 terhadap V.
harveyi, 1,02 terhadap E. coli, dan terbesar
1,30 terhadap S. aureus (Tabel 1).
Tabel 1 Aktivitas penghambatan Bacillus sp. LTS 40 terhadap bakteri indikator
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Vibrio harveyi dengan
metode double layer
Keterangan IP = Indeks Penghambatan
Pertumbuhan Bacillus sp. LTS 40
Isolat Bacillus sp. LTS 40 ditumbuhkan dalam kombinasi media molase dan pupuk NPK, molase dan pupuk ZA, molase dan pupuk TSP serta urea dengan perbedaan masing-masing konsentrasi 0.2%, 0.1%, 0.05%, dan 0.02%. Kombinasi molase dan NPK pada konsentrasi 0.2% menunjukkan hasil yang terbaik yaitu diperoleh jumlah sel bakteri sebanyak 5,4x1011 sel/ml. Selanjutnya kombinasi molase dan ZA dan molase TSP dan urea berturut-turut sebanyak 2,64x1011 sel/ml dan 5,4x1010 sel/ml pada konsentrasi yang sama yaitu 0.2% (Tabel 2).
Tabel 2 Pertumbuhan bakteri Bacillus sp. LTS 40 dalam berbagai konsentrasi dan kombinasi media
Uji
Kompetisi terhadap Bakteri IndikatorAktivitas penghambatan Bacillus sp. LTS 40 terhadap bakteri V. harveyi dalam kultur campuran menunjukkan bahwa Bacillus sp. LTS 40 mampu menghambat pertumbuhan
V. harveyi dengan daya hambat yang tidak
berbeda nyata pada inkubasi ke-24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Hal ini terlihat dari jumlah sel bakteri indikator yang dikompetisikan dengan Bacillus sp. LTS 40 lebih rendah dibandingkan dengan kontrol negatif (bakteri
Bakteri indikator
Aktivitas Penghambatan Isolat
Bacillus sp. LTS 40 Ф Koloni (mm) Ф Zona bening (mm) IP V. harveyi 5.1 10.63 1.08 E. coli 6.2 12.5 1.02 S.aureus 6.2 14.25 1.30 Kombinasi media
Jumlah sel (x 1010 sel/ml) Konsentrasi 0.20% 0.10% 0.05% 0.02% Molase + NPK 54 40.2 3.79 3.14 Molase + ZA 26.4 15.1 3.2 2.1 Molase + TSP + Urea 5.4 4.9 2.1 0.56 Kontrol 1.1 0.51 0.42 0.24
4
indikator tanpa isolat Bacillus sp. LTS 40). Pada rasio 1:10, isolat Bacillus sp. LTS 40 memiliki daya hambat paling tinggi dengan persen penghambatan mencapai 100% pada semua lama waktu inkubasi (Gambar 2).
0 20 40 60 80 100 120 1 : 1 1 : 2 1 : 4 1 : 10 Rasio inokulum % P e n g h a m b a ta n
24 Jam 48 Jam 72 Jam
Gambar 2 Persentase penghambatan Bacillus sp. LTS 40 terhadap bakteri V.
harveyi pada inkubasi jam ke-24,
48, dan 72 dengan menggunakan SWC cair 50%.
Waktu Optimum Produksi Bakteriosin Isolat Bacillus sp. Galur LTS 40 Kultur 10 Liter
Pertumbuhan Bacillus sp. LTS 40 pada fermentor modifikasi dengan volume kerja 10 liter menunjukkan peningkatan dari jam ke-12 hingga jam ke-36. Hal ini ditunjukkan dari jumlah selnya yang semakin bertambah pada jam tersebut sebesar 1,8x1011 sel/ml (Gambar 3). Pada akhir jam ke-36 hingga jam ke-72 pertumbuhan bakteri memasuki stasioner.
Produksi bakteriosin dan uji aktivitas penghambatan supernatan isolat Bacillus sp. LTS 40 yang dipanen setiap 12 jam ditunjukkan dengan luasnya zona hambat dengan metode double layer. Hasil uji aktivitas bakteriosin yang dihasilkan Bacillus sp. LTS 40 terhadap V. harveyi menunjukkan terjadi penghambatan maksimum pada jam ke 36 dengan indeks penghambatan sebesar 15,42 (Tabel 3).
Tabel 3 Aktivitas penghambatan bakteriosin Bacillus sp. LTS 40 terhadap V. harveyi Waktu (Jam) Presentase Penghambatan Ф Kertas cakram (mm) Ф Zona bening (mm) IP 12 6 9,75 6,25 24 6 11,25 8,75 36 6 15,25 15,42 48 6 14 13,33 60 6 11,38 8,96 72 6 9,25 5,42 Keterangan IP = Indeks Penghambatan
Hasil perhitungan jumlah sel yang diplotkan terhadap selang waktu inkubasi, diperoleh kurva pertumbuhan isolat Bacillus sp. LTS 40 (Gambar 4). Jumlah sel paling tinggi terjadi pada jam ke-36 dengan jumlah sel mencapai 1, 8x1011 sel/ml.
Aktivitas penghambatan terhadap V.
harveyi ditunjukkan oleh supernatan isolat Bacillus sp. LTS 40. Senyawa bakteriosin
mulai diproduksi pada fase eksponensial pertumbuhan yaitu pada waktu inkubasi 12 sampai 36 jam dengan aktivitas bakteriosin tertinggi ialah pada inkubasi ke-36 jam dengan zona hambat 15,25 mm. Zona hambatan paling luas menunjukkan waktu produksi bakteriosin yang optimum (Gambar 3). 0 50 100 150 200 0 12 24 36 48 60 72 Waktu (jam) J u m lah s e l (x 1 0 9 se l/ m l) 0 5 10 15 20 Z o n a h am b at ( m m )
Jumlah sel Zona hambat
Gambar 3 Aktivitas bakteriosin supernatan bebas sel Bacillus sp. LTS 40 terhadap V. harveyi.
PEMBAHASAN
Isolat Bacillus sp. galur LTS 40 merupakan hasil isolasi dari sedimen sifon tambak udang (Lestari 2008) yang dapat menghasilkan bakteriosin (Isramilda 2007).
Bacillus sp. merupakan bakteri umum
ditemukan pada sedimen laut dan saluran pencernaan udang (Moriarty 1999). Penggunaan isolat yang diisolasi dari lingkungan tambak sebagai bakteri kandidat probiotik akan lebih menguntungkan, karena isolat tersebut akan lebih mudah beradaptasi, mempertahankan diri, dan berkembang dalam lingkungan perairan (Isnansetyo 2005). Oleh karena itu, isolat Bacillus sp. LTS 40 ditumbuhkan pada media sea water complete (SWC) 50% untuk mengkondisikan seperti keadaan alamiahnya di tambak.
Berdasarkan uji aktivitas penghambatan dengan metode double layer, Bacillus sp. LTS 40 mampu menghambat dengan baik pada semua bakteri indikator terutama pada bakteri Gram positif S. aureus. Hal ini sama dengan yang dilaporkan Aslim (2002) yang menyatakan bahwa aktivitas antimikrob dari galur Bacillus memiliki penghambatan paling
5
baik terhadap bakteri Gram positif dari pada bakteri Gram negatif.
Pola pertumbuhan Bacillus sp. LTS 40 pada ketiga kombinasi menunjukkan hasil yang lebih tinggi dibandingkan kontrol, membuktikan bahwa kombinasi media tersebut mampu meningkatkan pertumbuhan
Bacillus sp. LTS 40. Pertumbuhan terbaik
terdapat pada kombinasi media molase dengan NPK pada konsentrasi 0.2% sedangkan pada konsentrasi 0.1%, 0.05%, dan 0.02% menunjukkan pertumbuhan yang lebih rendah (Gambar 2). Hal yang sama pada kombinasi media molase dengan ZA, dan molase dengan TSP dan urea terbaik pada konsentrasi 0,2% (Gambar 2). Hal ini disebabkan oleh adanya perbedaan konsentrasi N yang didapat dari masing-masing kombinasi media. Kombinasi media molase dengan NPK menjadi kombinasi formula media yang terbaik karena Pupuk NPK memiliki kandungan nitrogen, fosfor dan kalium dalam bentuk ion, masing-masing 15% sehingga tanpa diurai dapat langsung digunakan untuk pertumbuhan bakteri. Sedangkan Pupuk ZA dan urea hanya menyediakan nitrogen masing-masing 11% dan 46% untuk pertumbuhan bakteri. Pupuk ZA memiliki unsur N yang lebih kecil dibandingkan dengan NPK dan tidak terdapat unsur fosfor sehingga pertumbuhan Bacillus sp. LTS 40 lebih sedikit dibandingkan kultur di dalam NPK. Berbeda dengan kombinasi molase dengan TSP dan urea, meskipun nitrogen di dalam urea cukup tinggi dan tersedia fosfor namun tidak menghasilkan pertumbuhan yang tinggi pula. Diduga karena fosfor yang terdapat dalam kombinasi tersebut dalam bentuk senyawa P2O5, sehingga
membutuhkan waktu dan mekanisme untuk memecah senyawa tersebut agar fosfor dapat digunakan. Selain itu ketersediannya yang hanya 11%, lebih sedikit dibandingkan dengan NPK membuat pertumbuhan Bacillus sp. LTS 40 pada media kombinasi ini lebih kecil. Ketersediaan fosfor merupakan salah satu unsur penting dalam pertumbuhan bakteri. Bakteri memerlukan fosfor terutama dalam bentuk fosfat yang sebagai komponen struktur sel dan sebagai simpanan energi (Volk & Wheeler 1984). Menurut Goldman dan Dennett (2000) perbedaan rasio C:N yang ideal bagi pertumbuhan bakteri marin bervariasi tergantung pada keterbatasan nutrisi (karbon dan nitrogen).
Rachmawati (2007) melaporkan bahwa rasio C:N pada kombinasi molase dengan
fishmeal dan molase dengan soymeal terbaik
pada rasio 1:1. Pertumbuhan sel bakteri lebih
tinggi pada kombinasi molase dengan
fishmeal dari pada kombinasi molase dengan soymeal dengan jumlah sel bakteri sebesar
12.3x108 sel/ml. Hasil ini menunjukkan bahwa kombinasi molase dengan pupuk NPK, ZA, TSP, dan urea lebih baik dari pada penggunaan kombinasi molase dengan
fishmeal atau soymeal dengan jumlah sel
bakteri maksimum mencapai 5,4x1011 sel/ml pada kombinasi molase dengan NPK.
Lim (1998) menyatakan bahwa setiap bakteri memerlukan sumber karbon bagi pertumbuhannya dengan cara mengubah karbon tersebut menjadi material sel melalui proses asimilasi, bakteri heterotrof menggunakan senyawa organik sebagai sumber karbonnya. Sumber karbon yang dapat digunakan oleh bakteri ini diantaranya terdapat pada molase. Molase masih mengandung kadar gula sekitar 45 – 58% yang tersusun dari sukrosa, glukosa, fruktosa dan komponen lainnya sehingga masih dapat digunakan sebagi sumber karbon yang baik bagi pertumbuhan bakteri (Paturau 1982).
Kemampuan mikroorganisme untuk memperoleh energi pada kondisi heterotrof tergantung pada kemampuan metabolismenya untuk mengoksidasi senyawa karbon (bahan organik) sebagai sumber energi utama. Senyawa karbon dalam metabolime berperan untuk menghasilkan energi melalui oksidasi senyawa tersebut dan menyediakan unsur C untuk pembentukan material sel (Prescott et
al. 2000).
Dari uji kompetisi, persentase penghambatan dengan rasio inokulum 1:1 sudah cukup bagi Bacillus sp. LTS 40 untuk menghambat pertumbuhan V. harveyi pada ketiga waktu inkubasi dengan persentase 82,9% pada jam 24, 82,8% pada jam ke-48, dan 83% pada jam ke-72. Peningkatan persentase terjadi bersamaan dengan peningkatan rasio inokulum Bacillus sp. LTS 40 terhadap V. harveyi. Daya hambat paling tinggi dengan persen penghambatan mencapai 100% terjadi ketika rasio 1:10 pada semua lama waktu inkubasi (Gambar 3). Uji kompetisi dalam kultur cair ebih efektif dalam menghambat bakteri indikator karena bakteriosin dapat berkontak langsung dengan bakteri indikator. Hal ini menunjukkan bahwa
Bacillus sp. LTS 40 dapat dijadikan sebagai
bakteri probiotik untuk menanggulangi permasalahan dalam tambak udang yang mengakibatkan kematian massal udang pada tingkat larva akibat bakteri V. harveyi.
Bakteri Vibrio sp. merupakan bakteri Gram negatif, bersifat motil, oksidase positif,
6
berbentuk sel tunggal, batang pendek bengkok atau lurus, berukuran panjang 1,4 -5,0 µm dan lebar 0,3–1,3 µm, fermentatif terhadap glukosa, berpendar dan mempunyai flagella di salah satu kutubnya, tidak membentuk asam dari glukosa dan dapat menggunakan sukrosa sebagai sumber energinya (Lavilla-Pitogo et
al. 1990).
Vibrio ditemukan pada hampir seluruh
habitat, seperti air tawar, estuaria, air laut, tanah dan merupakan agen penyebab penyakit pada manusia, ikan dan crustacean (Singleton 1992). Masuknya Vibrio patogen dalam usaha budi daya udang ditambak dapat berasal dari air laut dan benur (larva) yang digunakan. Boer et al. (1993) melaporkan bahwa induk udang yang berasal dari air laut positif membawa bakteri berpendar sehingga dapat menularkan pada benur (larva) dan akhirnya terbawa masuk ke tambak.
Kehadiran Vibrio sp. pada pemeliharaan udang tidak selalu menyebabkan kematian, bakteri ini bersifat oportunistik. Tingkat kepadatan tertentu serta kondisi hidup udang yang kurang baik menyebabkan Vibrio berubah menjadi patogen dan menginfeksi udang (Rukyani 1993). Beberapa bakteri vibrio yang sering menyebabkan kematian pada benih udang ialah V. vulvinicus, V.
algiolyticus, V. fluvialis, V. anguillarus, dan V. harveyi (Boer & Zafran 1992). Jenis yang
sering menimbulkan masalah serius dalam budi daya ialah V. harveyi, larva yang terinfeksi terlihat bercahaya pada kondisi gelap sehingga penyakit yang ditimbulkan penyakit ini sering disebut penyakit kunang-kunang atau luminescent vibriosis.
Luminescence terjadi karena bakteri memiliki enzim luciferase yang dapat mengkatalis reaksi yang memancarkan cahaya dengan menggunakan substrat berupa senyawa aldehid yang disebut luciferin (Meighen 1991).
Isolat Bacillus sp. LTS ditumbuhkan pada kombinasi media terbaik yaitu molase dengan NPK pada konsentrasi 0,2% yang berada dalam fermentor yang telah dimodifikasi (Gambar1). Fermentor modifikasi dikondisikan seperti fermentor kecil yang telah diberi aerasi dengan memompakan udara steril. Aerasi berfungsi sebagai penyuplai oksigen untuk sel Bacillus sp. LTS 40, laju oksigen yang disuplai ke dalam fermentor modifikasi dijaga stabil. Laju alir oksigen yang tidak stabil dapat menurunkan daya kerja fermentor karena laju transfer oksigen yang tidak tetap dapat mengganggu metabolisme sel Bacillus sp. LTS 40. Selain aerasi,
fermentor modifikasi juga dilengkapi dengan batu aerasi yang berfungsi sebagai pemecah gelembung-gelembung udara agar gelembung udara yang tebentuk berukuran kecil sehingga laju difusi oksigen ke dalam larutan lebih cepat dan meningkatkan kadar oksigen terlarutnya. Selain itu terdapat filter udara steril yang berfungsi sebagai penyaring udara dari luar yang masuk ke dalam fermentor yang berisi media sehingga terhindar dari kontaminan mikrob yang lain (Rachmawati 2007).
Tipe kultur yang digunakan dalam penelitian ini adalah sistem batch (sistem tertutup). Pada sistem batch ini, media hanya dimasukkan pada awal proses kultur sehingga tidak ada penambahan media baru. Pertumbuhan Bacillus sp. LTS 40 pada fermentor modifikasi dengan volume kerja 10 liter menunjukkan peningkatan dari jam ke-12 hingga jam ke-36. Hal ini ditunjukkan dari jumlah selnya yang semakin bertambah pada jam tersebut yaitu 1,7x1011 sel/ml pada jam ke-12, 1,75x1011 sel/ml pada jam ke-24, dan 1,8x1011 sel/ml pada jam ke-36 (Gambar 4). Pada akhir jam ke-36 hingga jam ke-72 pertumbuhan bakteri memasuki stasioner. Hal yang sama dilaporkan oleh Baruno (2008) bahwa bakteriosin dari kultur Bacillus sp. Galur LTC8 dihasilkan pada jam ke-12 dan produksi maksimum pada jam ke-36. Hal tersebut mengindikasikan bahwa bakteriosin mulai dihasilkan pada fase pertumbuhan. Fase stasioner merupakan fase dimana sel-sel mulai tidak tumbuh lagi. Hal ini disebabkan oleh menyusutnya nutrien dalam media, keterbatasan oksigen dan akumulasi produk metabolisme yang toksik bagi organisme. Laju pertumbuhan bakteri pada fase ini melambat atau terhenti sedangkan jumlah mikrob yang hidup konstan.
Aktivitas supernatan bebas sel isolat
Bacillus sp. LTS 40 yang dipanen setiap 12
jam menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap V. harveyi maksimum pada jam ke-36 dengan zona hambat sebesar 15,25 mm (Tabel 2). Hasil tersebut berbeda dengan hasil yang telah dilaporkan Isramilda (2007) yang menyatakan bahwa bakteriosin yang dihasilkan isolat LTS 40 memiliki zona penghambatan sebesar 30 mm terhadap V.
harveyi. Hal ini dapat disebabkan oleh
beberapa faktor yang mempengaruhi aktivitas bakteriosin sebagai senyawa antimikrob, antara lain: 1) jenis, jumlah, umur, dan latar belakang kehidupan bakteri, 2) konsentrasi zat antimikrob, 3) suhu dan waktu kontak, 4) sifat fisiko-kimia substrat seperti pH, kadar air, dan
7
tegangan permukaan (Frazier & Westhoff 1981).
Mekanisme kerja bakteriosin dalam menghambat pertumbuhan bakteri dapat dilakukan melalui hambatan terhadap pembentukkan dinding sel target, menghambat pembentukan asam nukleat atau menghambat pembentukan protein. Selanjutnya terjadi pembentukan pori-pori pada membran sel target sehingga permeabilitas membran sel terganggu (William et al. 1996). Hurst (1981) menyatakan bahwa mekanisme kerja bakteriosin diketahui bergantung pada konsentrasi bakteriosin, kemampuan ionisasi, suhu, pH, dan fase pertumbuhan sel target. Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa pada inkubasi ke-48 jam terjadi penurunan aktivitas penghambatan yang ditunjukkan dengan penurunan luas zona hambat. Hal ini karena inkubasi yang dilakukan lebih dari waktu optimum produksi senyawa bakteriosin dalam media. Dajani dan Wannamaker (1969) melaporkan bahwa inkubasi yang terlalu lama menyebabkan aktivitas bakteriosin menurun. Isramilda (2007) menyatakan bahwa pada inkubasi lebih dari tiga hari akan menyebabkan aktivitas antimikrob menurun. Hal ini disebabkan oleh diproduksinya inaktivator atau enzim pencernaan dan adanya reabsobsi terhadap senyawa antimikrob yang diproduksi sel. Hal yang sama dikemukakan oleh Jo et al. (1996) bahwa jika waktu inkubasi diperpanjang maka aktivitas bakteriosin menurun, hal ini karena terbebasnya protease dari sel autolisis, karena bakterioisn merupakan molekul protaneus sehingga mudah terdegradasi.
Fase eksponensial terjadi pada waktu inkubasi ke-12 jam sampai ke-48 jam. Berdasarkan kurva pertumbuhan dapat diketahui bahwa senyawa antimikrob yang paling tinggi diproduksi pada fase eksponensial pertumbuhan. Berdasarkan ciri tersebut membuktikan bahwa senyawa antimikrob yang dihasilkan isolat Bacillus sp. LTS 40 tersebut merupakan bakteriosin (Gambar 4). Hal ini sesuai dengan yang dilaporkan oleh Torkar & Matijasic (2003) bahwa produksi bakteriosin B. thuringiensis dihasilkan pada fase eksponensial. Bakteriosin dapat dihasilkan oleh bakteri Gram positif maupun Gram negatif (Jack et al. 1995). Sebagian besar bakteriosin dihasilkan oleh bakteri Gram positif terutama yang paling banyak diteliti ialah dari genus Bacillus.
Bakteriosin dapat dibedakan dari antibiotik diantaranya dari proses produksinya
yaitu pada saat pertumbuhan bakteri mencapai fase logaritmik, sedangkan antibiotik diproduksi pada saat fase stasioner (Jack et al. 1995). Selain itu, bakteriosin memiliki sisi pengikatan yang spesifik terhadap bakteri target, hal ini membedakan bakteriosin dari aktivitas zat antimikrob yang lain (Tagg et al. 1976).
Menurut Gonzales et al. (1996) mekanisme aktivitas bakterisida beberapa bakteriosin secara umum ialah : 1) molekul bakteriosin mengalami kontak langsung dengan membran sel, 2) proses kontak ini mampu mengganggu potensial membran berupa ketidakstabilan membran sitoplasma sehingga sel menjadi tidak kuat, 3) ketidakstabilan membran memberikan dampak pembentukan lubang atau pori pada membran sel melalui gangguan terhadap gaya gerak proton, 4) terbentuknya lubang pada membran sel dapat menyebabkan perubahan gradien potensial membran dan pelepasan molekul intraseluler atau pun masuknya substansi ekstraseluler, akhirnya pertumbuhan sel menjadi terhambat dan menghasilkan proses kematian pada sel yang sensitif terhadap bakteriosin.
SIMPULAN
Isolat Bacillus sp. galur LTS 40 mampu menghambat pertumbuhan Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, dan Vibrio harveyi.
Kombinasi molase dan NPK pada konsentrasi 0,2% merupakan kombinasi terbaik yang dapat digunakan untuk media pertumbuhan
Bacillus sp. galur LTS 40. Uji kompetisi dan
uji aktivitas supernatan dapat menghambat pertumbuhan V. harveyi. Bakteriosin dari
Bacillus sp. LTS 40 dihasilkan pada fase
eksponensial dengan menggunakan media kombinasi molase dan NPK (1 : 1 w/v) pada konsentrasi 0,2%.
SARAN
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mendapatkan kombinasi media molase dengan pupuk NPK, ZA, TSP dan urea dengan rasio 1:2, 1:3, dan 1:4 untuk pertumbuhan Bacillus sp. galur LTS 40. Aplikasi secara langsung di tambak udang perlu dilakukan untuk mengetahui tingkat keefektifan bakteri probiotik.
8
DAFTAR PUSTAKA
Aslim B, Saglam N, Beyatli Y. 2002. Determination of some properties of
Bacillus isolated from soil. Turk J Biol
26: 41-48.
Baruno A. 2008. Karakterisasi antimikrob bakteriosin dari Bacillus sp. galur LTC8 asal tambak udang [tesis]. Bogor : Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Boer DR, Zafran. 1992. Bakteri Vibrio sp. Sebagai patogen oportunis bagi udang windu. J Penel Budidaya Pantai 7: 73-76.
Dajani AS, Wannamaker LW. 1969. Demonstration of bactericidal substance againts beta-hemolytic streptococci in supernatant fluids of stapylococcal cultures. J Bacteriol 97: 985-991.
Frazier WC, Wasthoff DC. 1981. Food
Microbiology. New Delhi: Tata Mc
Graw-Hill.
Gonzales BE et al. 1996. Bactericidal mode of action Plantaricin S. Appl Environ
Microbiol 62: 2701-2709.
Goldman JC, Dennett MR. 2000. Growth of marine bacteria in batch and continuous culture under carbon and nitrogen limitation. Limnol Ocean 45: 789-800.
Hurst A. 1981. Nisin advances. J Appl
Microbiol 27: 85-123.
Isnansetyo A. 2005. Bakteri antagonis sebagai probiotik untuk pengendalian hayati pada aquakultur. J Perikan 7:1-10.
Isramilda. 2007. Karakteristik zat antimikrob penghambat pertumbuhan Vibrio harveyi dan Escherichia coli dari Bacillus sp. asal tambak udang [tesis].
Bogor : Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Jack RW, Tagg JR, Ray B. 1995. Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Bacteriol Rev 59: 171-200.
Jo YB, Kyung MB, Sung-Koo K, Hong-ki J. 1996. Evaluation at optimum conditions for bacteriocin production from Lactobacillus sp. JB-42 isolated from kimichi. J Microbiol Biotechnol 6: 63-67.
Lavilla-Pitogo CR, Baticados MCL, Cruz-Lacierda ER. de la Pena LD. 1990. Occurence of luminous bacterial disease of Penaeus monodon larvae in the Philippines. Aquaculture 91:1-14. Lestari D. 2008. Isolasi dan seleksi Bacillus
sp. untuk biokontrol pada tambak udang [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB.
Lim D. 1998. Microbiology. Ed ke-2. New York : McGraw-Hill.
Lisboa MP, Bonatto D, Bizani D, Henriques JAP, Brandelli A. 2006. Characterization of a bakteriosin-like substance produced by Bacillus amyloliquefaciens isolated from Brazillian atlantic forest. Intern Microbial 9:111-118.
Meighen EA. 1991. Molecular biology of bacterial bioluminescence microbiol. Rev. Vulgaris and Syringomycin Production. J Bacteriol 176: 1374-1382.
Moriarty DJW. 1999. Disease control in shrimp aquaculture with probiotic bacteria. Di dalam : Bell CR, Brylinsky M, Johnson GP, editor.
Microbial Biosystem: New Frontiers. Proceeding of the 8th International Symposium on Microbial Ecology.
Ottawa.
Paturau JM. 1982. By-Products of The Cane
Sugar Industry. Amsterdam: Elsevier
Scientific.
Prescott LM, Harley JP, Klein DA. 2000.
Microbiology. Ed ke-5. New York:
McGraw-Hill.
Rachmawati I. 2007. Penggunaan molase, fishmeal, dan soymeal sebagai media produksi Pseudomonas stutzeri
ASLT2 untuk probiotik di tambak udang [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
9
Ruangpan L, Na-anan P. Direkbusarakom S. 1998. Inhibitory effect of Vibri
alginolyticus on the growth of V. harveyi. Fish Pathol 33: 293-296.
Rukyani A. 1993. Penanggulangan Penyakit
Udang Windu. Jakarta: Pusat Penelitian dan Pengembangan Perikanan.
Saraswati R. 2003. Produksi massal sel
Rhizobium dengan teknologi bioproses. Mikrobiol Indones 8:47-52. Silaban RC. 2007. Penggunaan probiotik
Bacillus sp. IRVE01 dan Pseudomnas stutzeri IRNAE01 asal tambak udang
pada larva udang Vannamei
(Litopenaeus vannamei) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Singleton P. 1992. Introduction to Bacteria :
for Student of Biology, Biotechnology and Medicine. New York: John Wiley
and Sons Chichster.
Suparnika I. 2007. Aktivitas antimikrob
Bacillus sp. asal tambak udang
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Tagg JR, Dajani AS, Wannamaker LW. 1976. Bacteriocins of Gram positive bacteria. Bacteriol Rev 40: 722-756. Torkar KG, Matijasic BB. 2003. Partial
characterization of bacteriocins produced by Bacillus cereus isolate from milk and milk products. Food
Technol 41: 121-671
Verrschuere L, Rombaut G, Sorgeloos P, Verstaete W. 2000. Probiotic bacteria as control agent in aquaculture. J Mol
Biol Biotechnol 64: 655-657.
Volk WA, Wheeler MF. 1984. Mikrobiologi
Dasar. Ed ke-5. Markham, penerjemah; Adisoemarto S, editor. New York: Harper & Row Publisher Inc. Terjemahan dari: Basic Microbiology. Ed ke-5.
William RAD, Lambert PA, Singleton P. 1996. Antimicrobiol Drug Action. Oxford: Scientific Publisher.
10
11
Lampiran 1 Komposisi media yang digunakan
No. Nama media Komposisi Jumlah (g/l) 1 Sea Water Complete (SWC) 50% Air laut 750 ml
Akuades 250 ml Gliserol 1,5 ml Ekstrak khamir 0,5
Agar 20
Bacto pepton 2,5 2 SWC Semisolid Air laut 750 ml
Akuades 250 ml Gliserol 1,5 ml Ekstrak khamir 0,5
Agar 10
Bacto pepton 2,5
Lampiran 2 Komposisi kimia molase (Paturau 1982)
Komponen Kisaran (%) Rata-rata (%)
Air 17-25 20 Sukrosa 30-40 35 Glukosa 4 - 9 7 Fruktosa 5 -12 9 Gula Pereduksi 1 - 5 3 Karbohidrat lain 2 - 5 4 Abu 7-15 12 Komponen nitrogen 2 - 6 4,5 Asam bukan nitrogen 2 - 6 5 Lilin, steroid, dan fosfolipid 0,1-1 0,4 Lampiran 3 Komposisi pupuk yang digunakan
Pupuk Komponen Kisaran (%) NPK N 15 P 15 K 15 ZA Nitrogen 11 Sulfur 24 TSP SiO2 37 P2O5 11 CaO 28 Urea N 46
